張美玉 謝彥軍 曹永慧

（山東魯抗舍里樂(lè)藥業(yè)有限公司高新區(qū)分公司，山東 濟(jì)寧 272000）

硫酸黏菌素又名硫酸黏桿菌素，克里斯汀（Colistin Sulfate）、多黏菌素（PolymyxinE）、抗敵素等，它是1950 年由日本的小山抗浮從福島縣土壤中分離到的1 株多黏芽孢桿菌抗敵素變株的培養(yǎng)液中提取的一種鎖環(huán)狀多肽類(lèi)抗生素，為白色粉末，易溶于水，耐熱，消化道不易吸收，排泄迅速，毒性小，無(wú)副作用，不易產(chǎn)生耐藥菌株，是最安全的抗生素之一，幾乎對(duì)所有的革蘭氏陰性菌有效，對(duì)綠膿桿菌有顯著作用。治療時(shí)常與抗革蘭氏陽(yáng)性菌的桿菌肽鋅合用。其含量測(cè)定《中國(guó)獸藥典》2020 版規(guī)定為生物效價(jià)測(cè)定方法，但其方法具有操作步驟復(fù)雜、檢驗(yàn)周期長(zhǎng)、影響因素多等缺點(diǎn)，隨著獸藥的發(fā)展和檢驗(yàn)制度的完善，為了滿足生產(chǎn)的需要，提高檢驗(yàn)效率及檢驗(yàn)準(zhǔn)確度，該文采用高效液相色譜法檢測(cè)原理，建立快速、準(zhǔn)確的HPLC 測(cè)定獸藥硫酸黏菌素的含量檢測(cè)方法。

1 主要儀器與試劑

Agilent 1260 Infinity II，硫酸黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所），乙腈（色譜純），無(wú)水硫酸鈉（分析純），其余試劑為分析純，硫酸黏菌素原料。10%硫酸黏菌素可溶性粉，10%硫酸黏菌素預(yù)混劑均為山東魯抗舍里樂(lè)藥業(yè)有限公司高新區(qū)分公司生產(chǎn)（均已用生物效價(jià)法測(cè)定含量）。

2 結(jié)果分析

2.1 測(cè)定方法

C18 鍵合硅膠色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)215nm，流速1.0mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量20uL，流動(dòng)相0.1mol/L 無(wú)水硫酸鈉溶液∶乙腈=4 ∶2，用磷酸調(diào)酸堿度至pH 為2.4 左右。

溶液的制備 對(duì)照品溶液：精密稱定標(biāo)準(zhǔn)品25mg，置50mL 的容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至相應(yīng)刻度，搖勻，制成含硫酸黏菌素0.5mg/mL 的對(duì)照品溶液。供試品溶液：精密稱定硫酸黏菌素可溶性粉250mg，置50ml 的容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至相應(yīng)刻度，搖勻，制成含硫酸黏菌素0.5mg/mL的硫酸黏菌素可溶性粉溶液。

精密稱定硫酸黏菌素預(yù)混劑250mg，置50mL 的容量瓶中，加流動(dòng)相適量超聲助溶5min，冷卻，定容至刻度，制成含硫酸黏菌素0.5mg/mL 的硫酸黏菌素預(yù)混劑溶液。

系統(tǒng)適用性溶液：取硫酸黏菌素對(duì)照品溶液，精密量取對(duì)照品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

系統(tǒng)適用性要求：系統(tǒng)適用性溶液色譜圖中，相鄰峰間的分離度應(yīng)大于1.5，各峰的拖尾因子不得大于1.5。

系統(tǒng)適用性結(jié)果：相鄰峰間的分離度均大于1.5，各峰的拖尾因子小于1.5，見(jiàn)表1。

表1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

2.2 分析方法優(yōu)化

通過(guò)對(duì)流動(dòng)相、波長(zhǎng)、溶劑、進(jìn)樣量等條件進(jìn)行選擇，確定最佳試驗(yàn)條件。

為了考察乙腈對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，分別選擇流動(dòng)相為無(wú)水硫酸鈉溶液、無(wú)水硫酸鈉溶液∶乙腈=40 ∶20、無(wú)水硫酸鈉溶液∶乙腈=45 ∶15，無(wú)水硫酸鈉溶液均為0.1 mol/L，結(jié)果表明，當(dāng)無(wú)水硫酸鈉溶液∶乙腈=40 ∶20 時(shí)，色譜圖中各峰的峰形較好，分離度良好；為了考察無(wú)水硫酸鈉溶液濃度的影響，固定乙腈的比例，分別比較當(dāng)磷酸鹽濃度為0.1mol/L 和0.2 mol/L 的檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)0.1mol/L 的無(wú)水硫酸鈉溶液時(shí)，峰形對(duì)稱性好且流動(dòng)相中含鹽濃度低，對(duì)色譜柱壽命影響相對(duì)較小，更符合方法學(xué)要求。

采用紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器，對(duì)硫酸黏菌素對(duì)照品、原料及其制劑溶液在200nm～400nm 波長(zhǎng)內(nèi)進(jìn)行掃描，評(píng)價(jià)硫酸黏菌素的紫外吸收行為。測(cè)得在215nm 處均有較明顯吸收，故選擇215 nm 為測(cè)定波長(zhǎng)是合理的。

硫酸黏菌素原料，易溶于水，分別采用水和流動(dòng)相作為空白溶劑，比較硫酸黏菌素制劑的色譜行為。試驗(yàn)表明，以水做空白溶劑時(shí)，可溶性粉溶解性良好而硫酸黏菌素預(yù)混劑溶解性很差，而且出現(xiàn)倒峰，選流動(dòng)相作為溶劑，不會(huì)出現(xiàn)倒峰，對(duì)預(yù)混劑來(lái)說(shuō)，由于輔料及工藝原因?qū)е氯芙庑陨圆?，必須?jīng)過(guò)5min 超聲處理才能溶解，綜合分析選用流動(dòng)相作為溶劑。

2.3 方法學(xué)考察

精密稱取原料、10%硫酸黏菌素可溶性粉、10%硫酸黏菌素預(yù)混劑適量進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，各樣品含硫酸黏菌素在一個(gè)水平，各精密稱定6 份樣品，每份樣品各進(jìn)2 針，取其峰面積平均值，圖1～圖4 表明對(duì)照品、原料、10%硫酸黏菌素可溶性粉、10%硫酸黏菌素預(yù)混劑色譜圖中均含有這5 種主要物質(zhì)，而且這5 種物質(zhì)在不同時(shí)間出峰，分別命名為1～5。硫酸黏菌素原料及制劑中這5 種物質(zhì)出峰時(shí)間和硫酸黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間保持一致，色譜圖峰形很好。而且拖尾因子均小于1.5，說(shuō)明所測(cè)物質(zhì)相同，各峰分離度良好，達(dá)到完全分離，根據(jù)峰面積計(jì)算含量結(jié)果與《中國(guó)獸藥典》2020 版生物等效法測(cè)定值一致，見(jiàn)表2 和表3，說(shuō)明結(jié)果穩(wěn)定可靠，影響因素少。

表2 生物效價(jià)法測(cè)定結(jié)果

表3 高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果

圖1 硫酸黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2 硫酸黏菌素原料色譜圖

圖3 10%硫酸黏菌素可溶性粉色譜圖

圖4 10%硫酸黏菌素預(yù)混劑色譜圖

精密稱取對(duì)照品適量，置合適的容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，配制成0.5mol/L 的硫酸黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，將其標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 針，記錄峰面積值，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

結(jié)果表明相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3%，說(shuō)明精密度良好，數(shù)據(jù)可靠，儀器狀態(tài)良好。

配制標(biāo)準(zhǔn)濃度為2.0mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密量取1mL、2mL、3mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL 置10mL 容量瓶中，配制成濃度為0.2mg/mL～1.8mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。各取20uL 進(jìn)樣，記錄色譜圖，橫坐標(biāo)為樣品濃度，縱坐標(biāo)為樣品峰面積做線性回歸，濃度在0.3mg/mL～1.6mg/mL 和峰面積呈線性相關(guān)，線性回歸方程為=2568425.6（=0.9999）。表明樣品檢測(cè)濃度為0.5mg/mL 在線性范圍內(nèi)。

分別取原料、10%硫酸黏菌素可溶性粉、10%硫酸黏菌素預(yù)混劑適量和可溶性粉混合配制成樣品濃度為0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL 的溶液，每個(gè)濃度做兩次重復(fù)并計(jì)算平均回收率。結(jié)果表明，當(dāng)樣品濃度在0.5mg/mL 時(shí)，回收率高于98.0%，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠，方法正確，準(zhǔn)確度高，見(jiàn)表4。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)改變柱溫、流速、檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相pH 值、流動(dòng)相比例等參數(shù)，來(lái)評(píng)估色譜條件有微小變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的影響程度。

根據(jù)表5，改變色譜條件后，取空白溶液、對(duì)照品溶液、原料、可溶性粉以及預(yù)混劑進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)要求當(dāng)色譜條件有微小變化后，各峰的分離度大于1.5，含量結(jié)果RSD 不得超過(guò)2.0%。

表5 耐用性試驗(yàn)表

在流速、柱溫、流動(dòng)相比例、流動(dòng)相pH 及不同色譜柱等色譜條件有微小變動(dòng)時(shí)，分離度均符合要求見(jiàn)表6，各條件下，測(cè)得硫酸黏菌素的含量的RSD 值均小于2.0%見(jiàn)表7。表明該方法耐用性良好。

表6 對(duì)照品溶液的各峰分離度結(jié)果

表7 含量測(cè)定方法驗(yàn)證-耐用性試驗(yàn)結(jié)果

取硫酸黏菌素對(duì)照品溶液，采用逐步稀釋的方法，信噪比（/=10）的樣品濃度即為定量限濃度，測(cè)定6 次，信噪比（/=3）的溶液濃度即為檢測(cè)限。結(jié)果定量限溶液的濃度為0.012mg/mL，檢測(cè)限溶液的濃度為 3.63μg/mL，6 份定量限溶液峰面積的RSD 為2.53%。

在不同時(shí)間，2 位分析員分別用不同儀器配制6 份原料供試品溶液和2 份硫酸黏菌素對(duì)照品溶液。取配制溶液各20μL 分別進(jìn)樣分析，結(jié)果表明，2 位分析員6 次測(cè)定重復(fù)性的RSD 分別為：1.53%、1.32%，不同分析員12 次測(cè)定中間精密度的RSD 為1.47%，結(jié)果重復(fù)性及中間精密度良好。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)通過(guò)建立高效液相色譜法檢驗(yàn)硫酸黏菌素的含量，能夠高效測(cè)定獸藥硫酸黏菌素及其制劑的含量，方法可靠、穩(wěn)定性好，和生物效價(jià)法相比較，縮短了檢驗(yàn)周期，實(shí)現(xiàn)批量檢驗(yàn)，能夠?yàn)楂F藥生產(chǎn)質(zhì)量提供有力的保障。