王苗利，薛瑞雪，張 月，藺曉月，李玉杰，邢林林，孔祥華，王貴升

（山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，山東 濟(jì)南 250100）

流感病毒（Influenza virus）屬于正粘病毒科流感病毒屬，病毒結(jié)構(gòu)由內(nèi)而外分為核芯、基質(zhì)蛋白和囊膜三個(gè)部分，基因組包含8個(gè)分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA（ss-RNA）。流感病毒的基因組RNA（vRNA）與核蛋白（NP）結(jié)合，并與RNA聚合酶復(fù)合體纏繞成致密的核糖核蛋白復(fù)合體（RNPs），以異源三聚復(fù)合體的形式存在于感染宿主的細(xì)胞核內(nèi)，主要參與病毒RNA的合成。流感病毒感染的宿主范圍十分廣泛，包括人和其他哺乳動(dòng)物、禽類、鳥類等。

不均一性核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP）是細(xì)胞核內(nèi)的一類RNA結(jié)合蛋白，包括約30個(gè)高豐度表達(dá)的成員，這類蛋白可與新合成的不均一性RNAs（hnRNAs/pre-mRNAs）的內(nèi)含子區(qū)域結(jié)合來(lái)協(xié)助完成內(nèi)含子的剪切，并在mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)的過(guò)程中結(jié)合mRNA來(lái)穩(wěn)定mRNA結(jié)構(gòu)。

本研究前期發(fā)現(xiàn)hnRNP H2蛋白能夠抑制流感病毒復(fù)制，為進(jìn)一步探究hnRNP H2是否會(huì)抑制流感病毒復(fù)制及相關(guān)機(jī)制，本研究采用雙熒光素酶活性試驗(yàn)、免疫共沉淀試驗(yàn)等方法進(jìn)行相關(guān)研究分析。

1 材料與方法

表1 引物序列

1.1 病毒株、細(xì)胞及質(zhì)粒毒株A/WSN/1933(H1N1)、293T細(xì)胞系、犬腎上皮細(xì)胞系MDCK由本試驗(yàn)室保存；含有流感病毒聚合酶識(shí)別序列的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（LUC）和含有CMV啟動(dòng)子序列的海腎螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（RENILLA）由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；pCMV-N-Flag載體、pCAGGS載體購(gòu)自Novagen公司。

1.2 主要試劑兔抗beta Actin、Flag、hnRNP H2多抗和鼠抗A型流感病毒NP、M1、M2、PB1、PB2、PA多抗均購(gòu)自ThermoFisher公司；T7 RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自Invitrogen公司；RNA提取試劑盒和質(zhì)粒提試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；RIPA裂解液（弱）和SDS-PAGE凝膠配置試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；ECL發(fā)光液和Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自翊圣生物公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中登錄的hnRNP H2序列及流感病毒參考株的NP、PB1、PB2和PA序列，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。

1.4 利用雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)檢測(cè)hnRNP H2蛋白對(duì)流感病毒聚合酶的影響將LUC、RENILLA、pCAGGS-NP、pCAGGS-PB1、pCAGGS-PB2、pCAGGS-PA、pCMV-N-Flag-hnRNP H2（對(duì) 照 組pCMV-N-Flag）質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后30h，用Dual-Luciferase Reporter Assay System試劑盒按照說(shuō)明書裂解細(xì)胞，取部分裂解上清加入蛋白上樣緩沖液，95℃10 min變性處理后，用鼠抗NP、PB1、PB2、PA(1：1000)多抗和兔抗beta Actin、Flag(1：1000)多抗為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1：10000)、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1：10000)為二抗，利 用western blot檢 測(cè)NP、PB1、PB2、PA、hnRNP H2和beta Actin蛋白的表達(dá)水平。另取部分裂解上清于96孔板中，利用發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染pCMV-N-Flag-hnRNP H2以及pCMV-N-Flag空載體樣品的聚合酶活性。

1.5 利用免疫共沉淀試驗(yàn)檢測(cè)hnRNP H2與流感病毒RNA相互作用分別將pCMV-N-Flag-hnRNP H2質(zhì)粒和pCMV-N-Flag質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24h后接種MOI 0.1 A/WSN/1933，感染后30 h，棄去上清，用RIPA裂解液（弱）4℃條件下裂解10～20 min，收集細(xì)胞裂解液，離心獲得上清，上清液中加入Anti-DDDDK-tag mAb-Magnetic Agarosse磁珠，4℃搖床過(guò)夜。預(yù)冷的RIPA洗滌4次，離心棄上清。將磁珠分為兩部分：一部分用兔抗hnRNP H2(1：1000)多抗為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1：10000)為二抗，利用western blot檢測(cè)hnRNP H2蛋白的表達(dá)水平；另一部分提取RNA，RNA提取后分為兩部分，一部分用Oligo(dT)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用WSN-PA-F1/R1引物檢測(cè)病毒mRNA水平，另一部分Uni 12引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用WSN-PA-F/R引物檢測(cè)病毒vRNA水平。

2 結(jié)果

2.1 hnRNP H2蛋白抑制流感病毒聚合酶活性Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒均可檢測(cè)到PB1、PB2、PA、NP和Flag-hnRNP H2蛋白（圖1A）。在此基礎(chǔ)上，過(guò)表達(dá)hnRNP H2蛋白后，流感病毒聚合酶活性顯著下降（圖1B）。表明hnRNP H2蛋白能夠在流感病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制階段發(fā)揮抑制作用。

圖1 hnRNP H2蛋白過(guò)表達(dá)對(duì)流感病毒聚合酶的影響

2.2 hnRNP H2蛋白能夠與流感病毒RNA發(fā)生相互作用在293T細(xì)胞上分別轉(zhuǎn)染pCMV-N-Flag-hnRNP H2質(zhì)粒和pCMV-N-Flag質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后12h，將A/WSN/1933以MOI 0.1感染細(xì)胞，細(xì)胞感染后24h，利用Anti-DDDDK-tag mAb-Magnetic Agarosse磁珠進(jìn)行CO-IP，結(jié)果顯示，hnRNP H2蛋白共沉淀下來(lái)的流感病毒vRNA和mRNA均明顯多于對(duì)照組（圖2），說(shuō)明hnRNP H2蛋白能夠與流感病毒RNA發(fā)生相互作用。

圖2 免疫共沉淀驗(yàn)證hnRNP H2蛋白與RNA相互作用

3 討論

流感病毒在復(fù)制過(guò)程中，有大量的宿主蛋白參與其中，研究宿主蛋白與流感病毒之間的相互作用，能夠深入闡明流感病毒的復(fù)制及致病機(jī)制，為抗流感藥物的研發(fā)提供潛在靶標(biāo)。流感病毒在細(xì)胞核內(nèi)完成復(fù)制，核內(nèi)一些蛋白蛋白會(huì)參與流感病毒復(fù)制，已有研究表明核內(nèi)蛋白hnRNP K能夠與流感病毒NS1蛋白相互作用而參與流感病毒復(fù)制過(guò)程；Ecco等研究發(fā)現(xiàn)核蛋白ANP32能夠增強(qiáng)流感病毒聚合酶活性促進(jìn)流感病毒復(fù)制；Chang等發(fā)現(xiàn)核內(nèi)蛋白hnRNP A2/B1能夠與流感病毒NP蛋白相互作用影響病毒復(fù)制。

本研究在細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)hnRNP H2蛋白后影響了流感病毒的復(fù)制，通過(guò)熒光素酶活性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，hnRNP H2蛋白能夠抑制流感病毒聚合酶的活性。hnRNP H2蛋白是一種RNA結(jié)合蛋白，在細(xì)胞內(nèi)hnRNP H2蛋白與流感病毒核酸相互作用研究中發(fā)現(xiàn)，hnRNP H2蛋白能夠與流感病毒RNA發(fā)生相互作用。這說(shuō)明hnRNP H2蛋白可能通過(guò)與流感病毒的RNA結(jié)合而阻止核酸出核來(lái)發(fā)揮抑制流感病毒的作用，這將為抗流感病毒藥物研發(fā)提供思路。