王清華，呂晨，王捷，馬佳文，劉國祥

（1.太原師范學(xué)院 生物系，山西 晉中 030619；2.中國科學(xué)院水生生物研究所 中國科學(xué)院藻類生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430072）

0 引言

柵藻屬（Scenedesmus）隸屬于綠藻門（Chlorophyta）環(huán)藻目（Sphaeropleale），為該目柵藻科（Scenedesmaceae）的模式屬，主要營淡水浮游生活。該屬由 Meyen建于 1829年［1］，Carl在 1849年將鈍形柵藻Scenedesmus obtusus定為該屬的模式種［2］。柵藻屬自建立之后有超過300個(gè)物種被記錄，為了便于區(qū)分，不同分類學(xué)者都建立了不同的屬下分類系統(tǒng)并進(jìn)行描述。Komárek和Fott在《Chlorococcales》中將柵藻屬分為柵藻亞屬（Subg.Scenedesmus）和鏈帶藻亞屬（Subg.Desmodesmus），亞屬之下又包含6個(gè)組，并認(rèn)為只有100～ 150個(gè)種較為可靠［3］。

1999年，An等基于ITS序列研究了廣義柵藻屬，發(fā)現(xiàn)該屬可明顯分為兩個(gè)不同的支系，于是將鏈帶藻亞屬（Subg.Desmodesmus）提升為屬級(jí)分類單位［4］。之后又有多個(gè)屬下分類單位或物種被提升至屬級(jí)，如尖帶藻屬（Acutodesmus）、考 馬 斯 藻 屬（Comasiella）、扇 帶 藻 屬（Pectinodesmus）以及喬帶藻屬（Chodatodesmus）等［5-8］。如今的柵藻屬幾乎僅包含Komárek和Fott分類系統(tǒng)中的柵藻亞屬（Subg.Scenedesmus）中的狹義柵藻組（Gruppe Scenedesmus sensu stricto）。其形態(tài)描述為群體多由2，4或8個(gè)細(xì)胞組成，外具膠被，群體平面平直或彎曲，細(xì)胞依其長軸線形或交錯(cuò)地排成1列或2列，細(xì)胞橢圓形、圓柱形或卵圓形，直或稍微彎曲，末端鈍圓，細(xì)胞壁完全光滑，且有時(shí)稍有加厚。

我國記錄的柵藻類植物種類豐富，諸多學(xué)者對(duì)該類群在我國的分布及多樣性調(diào)查做出過重要貢獻(xiàn)。1999年，謝樹蓮等系統(tǒng)整理了分布于我國的52種柵藻屬植物，并依據(jù)數(shù)量分類將它們分為5個(gè)類群［9］。依據(jù)《中國淡水藻志》第十五卷，我國記錄柵藻屬植物共81種，但主要采用了Komárek和Fott的分類系統(tǒng)，而其中形態(tài)符合當(dāng)前柵藻屬定義的物種僅包含7種，2變種［10］。當(dāng)前部分種已被轉(zhuǎn)移至其他屬或被證實(shí)為同種異名，如盤狀柵藻（Scenedesmus disciformis）、卵形柵藻（Scenedesmus ovalternus）、鈍形柵藻交錯(cuò)變種（Scenedesmus obtusus var.alternans）等［11］。因此，急需對(duì)我國現(xiàn)有的柵藻屬進(jìn)行重新修訂。

本研究基于采自我國內(nèi)蒙古自治區(qū)阿爾山國家森林公園的1株柵藻屬植物，通過形態(tài)學(xué)與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究相結(jié)合的手段，最終鑒定其為我國柵藻屬新記錄種，擬命名為亨氏柵藻（Scenedesmus hindakii Hegewald&Hanagata），并進(jìn)一步對(duì)我國的柵藻屬系統(tǒng)進(jìn)行了探討。

1 材料方法

1.1 標(biāo)本采集與培養(yǎng)

藻株采自內(nèi)蒙古自治區(qū)阿爾山國家森林公園（47°16′55″N，120°24′45″E）。使用浮游生物網(wǎng)（20 μm孔徑）撈取水樣，并置于采樣瓶（60 mL）中帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究。藻株的分離純化使用單細(xì)胞挑取法，即在倒置顯微鏡（Nikon SMZ800N）下用毛細(xì)管挑取得到單個(gè)群體，將其接入含有BBM液體培養(yǎng)基的96孔板中，經(jīng)逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)后得到單藻種，藻株編號(hào)為LXD60。分離得到的藻株培養(yǎng)于25℃恒溫培養(yǎng)箱（博迅 BSG-400）中，光暗比為12∶12。

1.2 顯微形態(tài)獲取

藻體的形態(tài)描述和顯微拍照使用顯微鏡奧林巴斯 BX53（Olympus Cop，日本），觀察模式為微分干涉（Differentical interference contrast，DIC）。

1.3 分子標(biāo)記獲取

將適量藻液收集于2 mL凍存管中，利用MiniBeadBeater（Model607EUR，美國）震蕩破碎細(xì)胞?；蚪M提取使用商品化試劑盒（Axy-Prep，蘇州，中國）。選擇18S、ITS和tufA三個(gè)分子標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增。18S引物參考Medlin等［12］，ITS 引物參考 Bhattacharya等［13］，tufA 序列引物參考Famà等［14］。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)后送往擎科生物（武漢）進(jìn)行測(cè)序。序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

分別使用18S+ITS聯(lián)合序列以及tufA基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，近緣序列參考Wang等研究結(jié)果［15］。序列比對(duì)、校正以及序列串聯(lián)分別使用軟件 Mafft7.0［16］、MEGA 6.0［17］和 SequenceMatrix［18］。數(shù)據(jù)集的堿基組成分析、堿基轉(zhuǎn)換與顛換比分析分別使用MEGA 6.0和Bioedit 7.0［19］進(jìn)行。系統(tǒng)發(fā)育分析最大似然法（ML）使用軟件 IQ-TREE web server［20］，貝葉斯法（BI）利用軟件 MrBayes 3.2.1［21］。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)觀察

柵藻屬Scenedesmus Meyen，1892。

模式種：鈍形柵藻Scenedesmus obtusus Meyen 1892。

亨氏柵藻Scenedesmus hindakii Hegewald&Hanagata，2000：46，F(xiàn)ig.5。

群體多由4細(xì)胞組成，群體平面平直或彎曲（圖1（a）—（b））。細(xì)胞交錯(cuò)排列成2行，相連細(xì)胞多以細(xì)胞側(cè)壁1/2至1/4處（即亞頂端）相連，培養(yǎng)狀態(tài)常解散成單細(xì)胞（圖1（c））。細(xì)胞橢球形或長圓柱狀，末端鈍圓，細(xì)胞壁光滑，群體外具膠被。色素體周生片狀或杯狀，具一個(gè)明顯的蛋白核，蛋白核外具淀粉鞘。通過似親孢子進(jìn)行無性繁殖（圖1（d））。

圖1 亨氏柵藻a—b：四細(xì)胞群體c：培養(yǎng)狀態(tài)單細(xì)胞d：似親孢子（標(biāo)尺=10 μm）Fig.1 Scenedesmus hindakii.a—b.4 cell coenobia.c.Single cells in culture.d.autosporangia.（Scale bar=10 μm）

細(xì)胞大小：（8 μm ～ 11.5 μm）×（4 μm ～7.5 μm）；四細(xì)胞群體寬：18 μm ～ 22 μm。

生境：溫帶地區(qū)池塘等靜水水體。

標(biāo)本采集地：內(nèi)蒙古自治區(qū)阿爾山國家森林公園。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

圖2顯示基于18S聯(lián)合ITS分子標(biāo)記的系統(tǒng)發(fā)育樹，數(shù)據(jù)集共有序列28條，矩陣經(jīng)手動(dòng)校正后長度為2 001 bp，包含217 bp簡約信息位點(diǎn)（10.84%），263 bp可變位點(diǎn)（13.14%），以及1 738 bp的保守位點(diǎn)（86.86%）。外類群選用水網(wǎng)藻科藻株。

圖2 柵藻科基于18S rDNA和ITS序列的系統(tǒng)樹Fig.2 Phylogenetic analysis of Scenedesmaceae by 18S+ITS genes

圖3顯示基于tufA基因的柵藻科系統(tǒng)發(fā)育樹，數(shù)據(jù)集共有序列27條，矩陣經(jīng)手動(dòng)校正后長度為736 bp，包含207 bp簡約信息位點(diǎn)（28.12%），243 bp可變位點(diǎn)（33.02%）以及493 bp保守位點(diǎn)（66.98%）。外類群選用2株水網(wǎng)藻科藻株。

圖3 柵藻科基于葉綠體tufA基因的系統(tǒng)樹Fig.3 Phylogenetic analysis of Scenedesmaceae by tufA sequence

系統(tǒng)樹中以“*”標(biāo)示的類群，代表由原Komárek和Fott分類系統(tǒng)中柵藻屬中獨(dú)立出來的屬。目前對(duì)于柵藻屬的定義僅包含柵藻亞屬（Subg.Scenedesmus）的 狹 義 柵 藻 組（Gruppe Scenedesmus sensu stricto），其主要形態(tài)描述為細(xì)胞橢圓形、圓柱形或卵圓形，直或稍微彎曲，末端鈍圓，細(xì)胞壁完全光滑。該類群區(qū)別于部分細(xì)胞表面具棘刺、脊、齒狀凸起（鏈帶藻屬Desmodesmus），細(xì)胞呈紡錘形（四鏈藻屬Tetradesmus）或細(xì)胞呈狹紡錘形、表面具縱向肋紋（扇帶藻屬Pectinodesmus）的種。目前的柵藻屬類群在系統(tǒng)樹中以紅色陰影部分表示。

基于18S+ITS序列以及tufA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果均表明，目前的柵藻屬在柵藻科中呈單系分支，且均獲得較高的支持值（99/1、96/1），而本研究采自內(nèi)蒙古阿爾山的藻株LXD60與保藏于德國藻類培養(yǎng)保藏中心（哥根廷）的藻株Scenedesmus hindakii SAG47.68具最近的親緣關(guān)系，分子證據(jù)也證實(shí)藻株LXD60為Scenedesmus hindakii，擬命名為亨氏柵藻。

3 討論

亨氏柵藻由Hegewald和Hanagata建于2000年，該種曾被錯(cuò)誤的鑒定為Schroederiella apiculata。Hegewald和Hanagata認(rèn)為亨氏柵藻雖然群體彎曲但并未連成環(huán)形，不符合Schroederiella屬的形態(tài)描述，且其親緣關(guān)系與Scenedesmus raciborskii、S.ovalternus和 S.obtusus相近，因此認(rèn)為該種應(yīng)屬于柵藻屬。本研究所采集藻株形態(tài)與Hegewald和Hanagata所描述一致，即群體多呈彎曲狀但并未連接成環(huán)，兩側(cè)細(xì)胞連接于細(xì)胞同一側(cè)亞頂端部位，使群體細(xì)胞呈交錯(cuò)排列。亨氏柵藻群體彎曲與S.arcuatus、S.raciborskii和S.curvatus類似，但是它們的細(xì)胞排列方式不同。就細(xì)胞排列方式而言，亨氏柵藻與鈍形柵藻更為相似，但鈍形柵藻群體呈平面狀，且二者具有不同的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)位置［5］。

依據(jù)《中國淡水藻志》第十五卷，其中形態(tài)符合當(dāng)前柵藻屬定義的物種僅包含7種，2變種［9］，分別為光滑柵藻（S.ecornis），盤狀柵藻（S.disciformis），鈍形柵藻（S.obtusus），卵形柵藻（S.ovalternus），凸頂柵藻（S.producto-capitatus），單列柵藻（S.linearis），阿庫柵藻（S.acunae）以及鈍形柵藻交錯(cuò)變種（S.obtusus var.alternans）和凸頂柵藻印度變種（S.productocapitatus var.indicus）。其中卵形柵藻和鈍形柵藻交錯(cuò)變種已被視為鈍形柵藻的同種異名［22］。單列柵藻被認(rèn)為是橢形柵藻（新擬）（S.ellipticus）的異名［11］。另依據(jù)《中國淡水藻類：系統(tǒng)、分類及生態(tài)》及其他研究［23-28］記錄的形態(tài)符合當(dāng)前柵藻屬定義的有扁盤柵藻（S.platydiscus）、彎曲柵藻（S.arcuatus）、雙對(duì)柵藻（S.bijuga）、雙對(duì)柵藻交錯(cuò)變種（S.bijugavar.alternans）、雙對(duì)柵藻錯(cuò)亂變種（S.bijugusvar.irregularis）、雙對(duì)柵藻極小變型（S.bijugatusf.tenuissimus）等。其中扁盤柵藻和彎曲柵藻認(rèn)為是彎曲考馬斯藻（Comasiella arcuata）的異名［7，11］，雙對(duì)柵藻是斜生四鏈藻（Tetradesmusobliquus=Scenedesmus obliquus）的異名，雙對(duì)柵藻交錯(cuò)變種被認(rèn)為是卵形柵藻的異名，雙對(duì)柵藻錯(cuò)亂變種是鈍形柵藻的異名，雙對(duì)柵藻極小變型認(rèn)為是單列柵藻的異名［3，10］。朱雅茹和王全喜報(bào)道了采自長三角地區(qū)的柵藻屬中國新紀(jì)錄植物［29］，其中符合當(dāng)前柵藻屬形態(tài)的光滑柵藻盤狀變種（S.ecornisvar.disciformis）被認(rèn)為是鈍形柵藻盤狀變型（S.obtususf.disciformis）（=盤狀柵藻S.disciformis）的異名［11］。因此，目前中國紀(jì)錄的柵藻屬植物共有6種，1變種，1變型（表1）。

表1 中國記錄柵藻屬植物Table 1 The record of genus Scenedesmus in China

國外基于分子標(biāo)記對(duì)柵藻科的研究將部分類群逐步轉(zhuǎn)移出廣義柵藻屬，獨(dú)立成新屬（如疣帶藻屬Verrucodesmus、喬帶藻屬、扇帶藻屬等），但廣義柵藻屬中仍有大量物種分類地位未經(jīng)確認(rèn)，新的柵藻屬也尚未有系統(tǒng)綜合性的研究。我國對(duì)于柵藻屬的研究也僅停留于經(jīng)典形態(tài)學(xué)分類階段，缺少分子數(shù)據(jù)報(bào)道。柵藻屬目前面臨從形態(tài)分類向分子系統(tǒng)分類過渡，屬內(nèi)多數(shù)種類因缺少關(guān)鍵序列而無法最終確認(rèn)其分類地位。今后的研究需要獲得相關(guān)物種的有效序列信息，以從系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的角度厘清其進(jìn)化關(guān)系。