裴徐梨，荊贊革，唐 征，羅天寬

(1.昆明學院 農(nóng)學與生命科學學院，昆明 650214；2.溫州科技職業(yè)學院 農(nóng)業(yè)與生物技術學院，浙江溫州 325006)

長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)是一類長度大于200 nt且沒有長開放閱讀框的RNA[1]。LncRNAs在真核生物中普遍存在，其含有較少的內(nèi)含子及較低的表達水平。LncRNAs根據(jù)其與相鄰基因的相對位置可分為基因間LncRNAs、基因內(nèi)LncRNAs及與編碼序列反義LncRNAs。研究發(fā)現(xiàn)LncRNAs能在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和表觀遺傳等層面調(diào)控生命進程[2-4]。目前，植物LncRNAs的研究相對較少，研究材料多集中在擬南芥、玉米、水稻、番茄等模式植物中。Enod40是第一個在植物中發(fā)現(xiàn)的LncRNA，其在蒺藜苜蓿體內(nèi)發(fā)揮著重要生物功能[5]。前人通過ESTs、RNA-Seq等技術在擬南芥中鑒定得到13 000多條LncRNAs[6]，研究發(fā)現(xiàn)這些LncRNAs參與了擬南芥的開花、逆境脅迫等多種生命進程。過表達LncRNA T5120可促進擬南芥對硝酸鹽的同化，提高其生物量和根系的發(fā)育[7]。TaS1和TaS2的大量表達可以提高小麥對白粉病的抗性[8]。此外，過表達lncRNA LAIR可提高水稻產(chǎn)量及其鄰近基因簇的表達[9]。在玉米中鑒定到3 488條LncRNAs，其中1 535條可響應干旱脅迫[10]。

高溫和高鹽對于青花菜的生長極為不利。青花菜花球的最佳形成溫度為22 ℃，溫度過高使花球形成受阻從而降低產(chǎn)量[11]。高鹽脅迫使青花菜根系活力受到抑制，根系吸收能力下降，葉片光合作用受到嚴重影響[12]。因此，探討青花菜在高溫和鹽脅迫下的響應機制對于青花菜生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實意義。

LncRNAs是轉(zhuǎn)錄組的重要組成部分，在植物器官發(fā)育[13]、生物[14]和非生物脅迫[15]等過程中起著重要的調(diào)控作用。本研究成功構建青花菜高溫和鹽脅迫的LncRNAs文庫，并進行差異 LncRNAs的鑒定、靶基因注釋以及表達特征等分析，研究結(jié)果為進一步分析LncRNAs在青花菜高溫和鹽脅迫下的調(diào)控機制提供一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以青花菜(Brassicaoleraceavar.italica)高代自交系‘WN12-95B’為試驗材料，種植于光照培養(yǎng)箱內(nèi)(白天：16 h光照，25 ℃；夜晚：8 h黑暗處理，18 ℃；相對濕度：85%)，5葉期時進行高溫(38 ℃)和鹽(200 nm/L NaCl)脅迫處理，處理時間為3 h和12 h，以0 h為對照。脅迫處理設3次生物學重復。處理結(jié)束后，取第3片葉用于高通量測序和qRT-PCR分析。

1.2 青花菜總RNA提取及RNA文庫構建

提取葉片總RNA，經(jīng)檢測合格后，進行文庫構建，于北京組學生物科技有限公司進行高通量測序。

1.3 高通量測序數(shù)據(jù)分析

測序所得的原始數(shù)據(jù)(raw data)經(jīng)處理后，對產(chǎn)出數(shù)據(jù)進行分析和統(tǒng)計。利用TopHat2 軟件[16]將clean reads與甘藍基因組進行序列比對，獲取序列特征信息。

1.4 青花菜LncRNAs鑒定

使用Cufflinks和Scripture軟件對轉(zhuǎn)錄本進行拼接[17]。根據(jù)LncRNAs的結(jié)構以及非編碼功能特點，篩選候選lincRNA、intronic LncRNA、anti-sense LncRNA類型的轉(zhuǎn)錄本。具體篩選步驟參照Zhang等[18]的進行。

1.5 青花菜LncRNAs差異表達分析

采用FPKM法計算LncRNAs的表達水平。差異表達LncRNAs的檢測標準為：|Fold Change|≥ 2且FDR<0.01。對篩選出的差異表達LncRNAs使用Cluster 3.0軟件進行層次聚類分析[19]。

1.6 青花菜LncRNAs靶基因預測

采用LncTar軟件對鑒定得到的LncRNAs進行cis靶基因預測[20]。trans作用靶基因根據(jù)Pearson相關系數(shù)法進行預測。

1.7 青花菜差異表達LncRNAs靶基因功能注釋和富集分析

對cis、trans作用模式下的差異表達LncRNAs靶基因進行GO和KEGG注釋，并進行富集分析。

1.8 青花菜差異LncRNAs表達特征分析

從表達量變化較大的LncRNAs中隨機挑選10個LncRNAs進行qRT-PCR驗證(表1)，以actin為內(nèi)參(F:GACAACTTACAACTCCATCAT；R:CTCATACGGTCAGCGATA)。反應過程依據(jù)SYBR Premix Ex Taq試劑盒(TaKaRa公司)說明書在ABI 7500(Applied Biosystems公司)上進行。反應總體系及反應程序參照Xu等[21]進行。每個反應設3次技術重復。定量數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCT法[22]。

表1 LncRNAs的qRT-PCR特異性引物Table 1 LncRNAs-specific primers for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果的初步分析

在高溫和鹽脅迫文庫中分別獲得38 738 918(CK)、35 895 588(HEAT-3H)、38 622 915(HEAT-12H)、35 772 779 (SALT-3H)和35 764 013(SALT-12H)條clean pair-end reads。文庫的平均GC含量為42.53%，Q30比例均大于91%(表2)。將clean reads比對到甘藍基因組，結(jié)果分別得到47 111 785(CK)、45 815 806(HEAT-3H)、52 658 043(HEAT-12H)、49 140 771(SALT-3H)和49 700 942(SALT-12H)條單一比對序列，文庫平均比對率約為75%。

表2 青花菜轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果及數(shù)據(jù)質(zhì)量匯總Table 2 Summary of transcriptome sequencing result and data quality in broccoli

2.2 青花菜LncRNAs鑒定結(jié)果分析

5個文庫中共鑒定得到2 432條LncRNAs，其中31條為intronic RNA，79條為anti-sense RNA，2 322條為lincRNA。結(jié)構分析顯示LncRNAs的長度較mRNA短，主要集中于200～ 2 600之間；外顯子個數(shù)多為2～13個不等，也比mRNA少。

2.3 青花菜差異LncRNAs的鑒定

通過比較不同處理間的LncRNAs表達量，鑒定出差異LncRNAs分別為41(CK vs HEAT-3H)、43(CK vs HEAT-12H)、12(HEAT-3H vs HEAT-12H)和17(CK vs SALT-3H)、24(CK vs SALT-12H)和21(SALT-3H vs SALT-12H)條。其中96條LncRNAs上調(diào)表達，62條LncRNAs下調(diào)表達。

對差異LncRNAs進行聚類分析發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下上調(diào)表達的LncRNAs數(shù)量較鹽脅迫多，且變化幅度更大，兩種脅迫處理后的差異LncRNAs表達模式差異較大(圖1)。XLOC_002584在高溫脅迫12 h的表達量為CK的18倍，但在鹽脅迫中的表達量差異較小；XLOC_003847在高溫脅迫過程中表達量變化趨勢平緩，但在鹽脅迫12 h表達量達到峰值，為CK的2倍；XLOC_005515在高溫和鹽脅迫處理后，表達量急劇 下降。

圖1 青花菜差異表達LncRNAs的層次聚類分析Fig.1 Hierarchical clustering analysis of differentially expressed LncRNAs in broccoli

2.4 LncRNAs靶基因預測

為了探討LncRNAs的調(diào)控網(wǎng)絡，對篩選得到的LncRNAs進行靶基因預測。分別獲得 8 891條cis作用靶基因和177 364條trans作用靶基因。部分靶基因羅列在表3。

表3 部分青花菜LncRNAs靶基因的代謝通路分析Table 3 Pathway analysis of partial target genes of LncRNAs in broccoli

對差異表達LncRNAs的cis作用靶基因進行分析，發(fā)現(xiàn)高溫處理組中CK vs HEAT-3H與HEAT-3H vs HEAT-12H在3個類別中的富集數(shù)目相差不大，而在CK vs HEAT-12H中沒有富集到生物過程條目；鹽脅迫處理組中較多靶基因映射到分子功能條目。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)“核糖體相關”是高溫處理中差異LncRNAs參與最多的pathway，而鹽脅迫中“氧化磷酸化”和“植物激素信號轉(zhuǎn)導”分別是CK vs SALT-3H和SALT-3H vs SALT-12H富集最多的途徑。

對差異表達LncRNAs的trans作用靶基因進行分析，發(fā)現(xiàn)在GO分析的 3大域中生物過程是富集最多的條目，包括“DNA甲基化(DNA methylation)”“水楊酸脅迫反應(response to salicylic acid)”“胚胎發(fā)育(embryo development)”“H3-K9組蛋白甲基化(histone H3-K9 methylation)”等。KEGG結(jié)果顯示富集量較多的靶基因參與了谷胱甘肽代謝、氨基酸合成、淀粉及糖代謝、半乳糖代謝以及脂肪酸延伸和代謝。

2.5 青花菜差異LncRNAs表達特征分析

使用qRT-PCR技術檢測了10個差異LncRNAs在高溫和鹽脅迫下的表達模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其表達模式與測序結(jié)果基本一致。XLOC_033957和XLOC_034964在鹽脅迫的表達下調(diào)，在高溫脅迫的表達量先下降再上升。XLOC_005515、XLOC_027154、XLOC_023592和XLOC_035830的表達量在高溫脅迫下先下降再上升。但在鹽脅迫中表達模式存在差異，XLOC_005515和XLOC_027154先下降后上升，而XLOC_023592和XLOC_035830的表達量逐漸下降。此外，XLOC_033671、XLOC_003826、XLOC_06988和XLOC_024730也具有相同的表達模式，在鹽脅迫中持續(xù)上調(diào)表達，在高溫脅迫中先上升后下降，高溫脅迫3 h的表達量最高(圖2)。

Y3H和Y12H分別代表鹽脅迫3 h和鹽脅迫12 h；H3H和H12H分別代表高溫脅迫3 h和高溫脅迫12 hY3H and Y12H represent 3 h and 12 h under salt stress treatment, respectively；H3H and H12H represent 3 h and 12 h under heat stress treatment, respectively圖2 10個差異LncRNAs在青花菜高溫和鹽脅迫下的表達特征Fig.2 Expression characteristics of 10 differentially expressed LncRNAs under high temperature and salt stress in broccoli

3 討 論

本研究構建了青花菜高溫和鹽脅迫的LncRNAs文庫，獲得184.77 M clean reads，平均每個文庫36.95 M，此結(jié)果大于前人在青花菜種子及幼苗中測序得到的read數(shù)目[23]。更多的測序數(shù)量有利于表達量相對較低的LncRNAs的鑒定[24]。因此，本文的測序數(shù)據(jù)對于鑒定青花菜高溫和鹽脅迫LncRNAs具有較好的可靠度。篩選出的青花菜LncRNAs也符合LncRNAs的一般特征：長度、外顯子數(shù)以及表達量均比mRNA小。

在鹽脅迫條件下，氨基酸、蛋白質(zhì)及其他激素類物質(zhì)含量會發(fā)生變化，最終造成植物生理代謝紊亂[25]。氧化磷酸化相關的轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)節(jié)脅迫響應基因的表達[26]，而氧化磷酸化過程是青花菜差異LncRNAs的靶基因在鹽脅迫中富集較多的途徑之一。青花菜XLOC_035830的靶基因為氧化磷酸化酶，該LncRNAs的表達量先下降后上升，其靶基因Bol018386(coproporphyrinogen oxidase)的表達量下調(diào)，推測XLOC_035830通過調(diào)控氧化磷酸化酶基因的表達進行鹽脅迫響應。乙烯和生長素是植物生長發(fā)育的重要激素，同時還是調(diào)控植物對非生物脅迫的重要因子[27]。本試驗中XLOC_003579及其靶向的生長素基因(Bol019000)在青花菜鹽脅迫過程中表達受到抑制，表明某些青花菜生長素相關基因的表達可受到鹽脅迫的調(diào)控。此外，XLOC_021367的靶基因Bol019606(ethylene-responsive transcription factor)可參與乙烯代謝途徑，其表達量在青花菜鹽脅迫過程中先上升后下降，表明XLOC_021367可通過靶基因調(diào)控乙烯介導的信號通路來對鹽脅迫進行響應。

高溫脅迫使植物質(zhì)膜流動性增加，從而促使類受體蛋白激酶向細胞傳遞高溫信號，同時激活相關轉(zhuǎn)錄因子[28]。本研究發(fā)現(xiàn)差異LncRNAsXLOC_023592的靶基因為凝集素類受體蛋白激酶(Bol039139)，該激酶是類受體蛋白激酶家族中的一個亞族，在植物生物/非生物脅迫和發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮非常重要的作用[29]。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)XLOC_023592及其靶基因的表達量隨著高溫脅迫時間的延長逐漸下降，表明抑制該LncRNAs的表達，可能會導致其靶基因表達受限從而影響青花菜高溫脅迫的響應。熱激蛋白合成可以提高植物的耐熱性，異位表達擬南芥的谷氧還原蛋白可提高HSP基因的表達來增加耐熱性[12]。XLOC_003826靶向熱激蛋白基因(Bol005002)，高溫脅迫12 h的表達量為CK的8倍，靶基因的表達量也隨著高溫脅迫時間的延長而快速增加，由此推測該LncRNAs是高溫脅迫響應過程中的重要調(diào)控因子。此外，對青花菜在高溫脅迫下的差異LncRNAs進行注釋，發(fā)現(xiàn)高溫脅迫相關的差異LncRNAs參與了青花菜的谷胱甘肽代謝、信號轉(zhuǎn)導以及脂肪酸延伸和代謝等過程。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶蛋白基因(Bol033291)是XLOC_025914的靶基因，該LncRNA和其靶基因的表達模式相反，推測該LncRNAs可通過負調(diào)控其靶基因的表達來參與青花菜的熱脅迫過程。

4 結(jié) 論

本研究鑒定到青花菜高溫和鹽脅迫相關LncRNAs 2 432條，其中31條為intronic RNA，79條為anti-sense RNA，2 322條為lincRNA。LncRNAs的表達水平整體較mRNA低，且長度和外顯子個數(shù)比mRNA少。篩選得到96條上調(diào)和62條下調(diào)的差異LncRNAs。通過GO和KEGG注釋發(fā)現(xiàn)這些差異LncRNAs可參與青花菜高溫和鹽脅迫中的植物激素信號轉(zhuǎn)導、谷胱甘肽代謝以及氧化磷酸化等過程。實時熒光定量分析表明10個差異LncRNAs在高溫和鹽脅迫下的表達模式存在差異。研究結(jié)果為進一步分析LncRNA在青花菜逆境脅迫中的調(diào)控機理提供理論基礎。