程亞婷，王陳，邱雪平，，馬建鴻，馬玲，張銘，靳冰玉，趙悅，張?jiān)?，鄭芳，?武漢大學(xué)中南醫(yī)院基因診斷中心＆檢驗(yàn)科，武漢 43007；.湖北省產(chǎn)前診斷與優(yōu)生優(yōu)育臨床研究中心，武漢 43007）

短指癥（brachydactyly）又名短趾癥，是一類(lèi)由于指（趾）骨或掌（跖）骨發(fā)育異常導(dǎo)致的指（趾）骨縮短、缺失或者融合的家族性遺傳病［1］。Temtamy和MeKusiek根據(jù)手指畸形的特征，將短指分為A～E型短指、IV型短跖、Sugarman短指、Kirner畸形8種類(lèi)型［2］。B型短指癥是這幾種類(lèi)型中最嚴(yán)重的一種，其根據(jù)致病基因的不同又可分為B1型（BDB1）和B2型（BDB2）。BDB1的臨床表現(xiàn)為中間指節(jié)縮短，同時(shí)末端指節(jié)缺陷或發(fā)育不良，所有手指和腳趾均受累，拇指和大腳趾通?；?，伴有指甲部分或完全缺失，可有不同程度的指關(guān)節(jié)粘連、軟組織并指等，嚴(yán)重程度因人而異。BDB1呈常染色體顯性遺傳，致病基因是位于染色體9q22上的ROR2基因。ROR2基因全長(zhǎng)235 kb，由9個(gè)外顯子組成，編碼長(zhǎng)度為943個(gè)氨基酸的“受體酪氨酸激酶樣孤兒素受體2”［3］。

我們收集了一個(gè)來(lái)自湖北武漢的BDB1家系，通過(guò)全外顯子組測(cè)序及臨床特征分析，確定為BDB1，致病基因?yàn)镽OR2。針對(duì)候選突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后Sanger測(cè)序在家系中驗(yàn)證該突變位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的雜合突變：c.2239C＞T（p.R747X），豐富了國(guó)際ROR2基因突變譜。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 先證者，女性，以“短指/趾畸形”為主訴就診于武漢大學(xué)中南醫(yī)院生殖遺傳中心咨詢(xún)門(mén)診。該家系來(lái)自湖北省武漢市，漢族，4代共15人，有3人出現(xiàn)短指（趾）癥狀，符合常染色體顯性遺傳規(guī)律（圖1）。經(jīng)每位成員書(shū)面知情同意后，采集家系內(nèi)3位患者Ⅲ3、Ⅰ2、Ⅱ3和2位未受累親屬Ⅱ4、Ⅱ5的外周血，并收集Ⅲ3、Ⅱ3手足部照片及X線片。本研究得到了武漢大學(xué)中南醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：科倫2021062）。

圖1 BDB1家系圖

1.2 外周血基因組DNA的提取 采集靜脈血2 mL，EDTA-K2抗凝，采用外周血DNA提取試劑盒（Zymo Research Quick-DNATM Miniprep Plus Kit，USA）提取基因組DNA，然后進(jìn)行質(zhì)量鑒定，將提取的DNA產(chǎn)物置于-20℃保存。

1.3 全外顯子測(cè)序?qū)ふ抑虏』?以先證者外周血來(lái)源的基因組DNA為檢測(cè)材料，首先用超聲將DNA打斷并制備文庫(kù)，然后通過(guò)Roche KAPA HyperExome芯片對(duì)目標(biāo)基因外顯子及臨近剪切區(qū)的DNA進(jìn)行捕獲和富集，最后使用MGISEQ-2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行變異檢測(cè)。測(cè)序片段通過(guò)BWA（Burrows-Wheeler Aligner）與UCSC hg19人類(lèi)參考基因組進(jìn)行比對(duì)，去除重復(fù)。使用基因組分析工具包（GATK，Genome Analysis Toolkit）3.7進(jìn)行堿基質(zhì)量值校正SNV、INDEL和基因型檢測(cè)。使用ExomeDepth進(jìn)行外顯子水平的拷貝數(shù)變異檢測(cè)。

1.4 PCR引物合成 根據(jù)全外顯子測(cè)序結(jié)果，針對(duì)先證者ROR2基因第9外顯子突變位點(diǎn)的位置，用Primer 3.0 plus設(shè)計(jì)引物，ROR2正向引物序列：5′-AGACATCTGGTCCTACGG-3′，反向引物序列：5′-ATCTGCATTGGGATCTGC-3′。引物由武漢擎科生物公司合成。

1.5 PCR擴(kuò)增與Sanger測(cè)序 PCR擴(kuò)增體系為50μL，采用南京諾唯贊生物科技公司PCR擴(kuò)增試劑盒［Vazyme biotech，2×Taq Plus Master MixⅡ（Dye Plus）］，包括25μL 2×Taq Plus Master MixⅡ（Dye Plus），正、反向引物各2μL（10μmol/L），DNA模板5μL，ddH2O 16μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，循環(huán)35次，72℃繼續(xù)延伸5 min，4℃保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定并進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。

1.6 氨基酸保守性分析 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取各物種ROR2蛋白的氨基酸序列文件，用DNAMA軟件作圖進(jìn)一步可視化。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征 先證者Ⅲ3，女，31歲。雙手拇指外觀正常，雙手第2～5指遠(yuǎn)端指節(jié)短小，第2手指尤為明顯，伴有指甲發(fā)育不良（圖2A）；雙足第2～5趾縮短，大腳趾外觀正常（圖2B）。X線片顯示：雙手第2、4～5指中遠(yuǎn)節(jié)指骨骨質(zhì)融合，關(guān)節(jié)間隙消失（雙手食指末節(jié)指骨稍短?。?，其余各掌、指骨骨質(zhì)結(jié)構(gòu)正常（圖2C）；雙足第2～4趾僅見(jiàn)二節(jié)趾骨，余足部所示各跖、趾骨及跗骨骨質(zhì)結(jié)構(gòu)正常（圖2D）。其母親和外祖母表型與其類(lèi)似都有短指癥狀，未發(fā)現(xiàn)其他異常（圖3）。

圖2 先證者Ⅲ3手足部照片

圖3 先證者母親Ⅱ3手足部照片

2.2ROR2基因突變分析與驗(yàn)證 通過(guò)對(duì)先證者的外周血基因組DNA進(jìn)行全外顯子測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其ROR2基因9號(hào)外顯子上存在c.2239C＞T雜合突變，該突變會(huì)導(dǎo)致ROR2基因編碼的氨基酸序列上第747位精氨酸錯(cuò)義終止，形成截短蛋白（圖4）。根據(jù)ACMG指南標(biāo)準(zhǔn)［4］，該變異被判斷為致病變異（PVS1+PM1+PM2+PP1），經(jīng)查詢(xún)ESP數(shù)據(jù)庫(kù)、人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)（HGMD）、EXAC外顯子組整合數(shù)據(jù)庫(kù)，均未見(jiàn)該變異報(bào)道。對(duì)家系中Ⅲ3、Ⅰ2、Ⅱ3、Ⅱ4和Ⅱ5的基因組DNA的9號(hào)外顯子進(jìn)行Sanger測(cè)序發(fā)現(xiàn)，患者Ⅲ3及Ⅰ2、Ⅱ3均存在c.2239C＞T雜合突變，而未受累者Ⅱ4和Ⅱ5該位點(diǎn)正常（圖5）。

圖4 ROR2蛋白模式圖及預(yù)測(cè)的氨基酸變化

圖5 ROR2基因測(cè)序圖（箭頭所指為突變位點(diǎn)）

2.3 氨基酸保守性分析 對(duì)ROR2蛋白進(jìn)行氨基酸保守性分析，發(fā)現(xiàn)R747以及下游近30個(gè)氨基酸在多個(gè)物種中高度保守（圖6）。

圖6 ROR2蛋白R(shí)747及其下游保守性分析

3 討論

B1型短指（BDB1）是一種常染色體顯性遺傳病，是短指中最嚴(yán)重的一種，其特征是手指和腳趾的末端缺失，指甲發(fā)育不良，中節(jié)指骨發(fā)育不全及不同程度的指（趾）關(guān)節(jié)粘連以及伴有拇指（趾）寬大畸形［5］。位于9q22上的酪氨酸激酶受體ROR2基因被認(rèn)為是致病基因。在本研究中，通過(guò)對(duì)先證者的臨床表型、X線檢查、全外顯子測(cè)序和一代測(cè)序驗(yàn)證等多方面分析，確定該先證者ROR2基因存在c.2239C＞T（P.R747X）突變，依據(jù)ACMG指南標(biāo)準(zhǔn)［4］，該變異被判斷為致病變異（PVS1+PM1+PM2+PP1），經(jīng)過(guò)對(duì)其家系進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)受累者均存在c.2239C＞T突變，該突變?cè)诩蚁抵信c疾病存在共分離，提示ROR2基因c.2239C＞T突變可能是導(dǎo)致該家系短指表型的原因。此突變導(dǎo)致編碼精氨酸的密碼子轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子，從而產(chǎn)生一個(gè)只有747個(gè)氨基酸的截短ROR2蛋白。

為了分析R747及其上下游序列對(duì)ROR2蛋白功能的影響，我們進(jìn)行了氨基酸保守性分析，發(fā)現(xiàn)R747以及下游近30個(gè)氨基酸在多個(gè)物種中高度保守，推測(cè)該段氨基酸序列對(duì)ROR2蛋白的正常功能非常重要。c.2239C＞T突變導(dǎo)致R747及其下游共196個(gè)氨基酸缺失，這可能會(huì)對(duì)ROR2蛋白的功能產(chǎn)生重要影響。

由ROR2基因編碼的受體酪氨酸激酶（RTK）樣孤兒受體2屬于RTK的ROR家族，由細(xì)胞外區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)區(qū)組成。參與蛋白質(zhì)相互作用的細(xì)胞外區(qū)域包含一個(gè)免疫球蛋白樣（Ig-like domain，Ig）結(jié)構(gòu)域，一個(gè)卷曲的半胱氨酸富集區(qū)（Frizzled-like cysteine-rich domains，CRD）和Kringle（Kringle domain，Kr）結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞內(nèi)區(qū)域包括酪氨酸激酶域（Tyrosine kinase domain，TK），以及2個(gè)絲氨酸/蘇氨酸富集區(qū)（Serine/threonine-rich domain，ST）和1個(gè)富含脯氨酸（Proline-rich domain，PR）的結(jié)構(gòu)［6］。由于ROR2的突變產(chǎn)生截短蛋白的類(lèi)型主要分為近端突變和遠(yuǎn)端突變。位于跨膜區(qū)之后的TK近端突變會(huì)導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞內(nèi)區(qū)域的丟失［5］，臨床上發(fā)現(xiàn)這種患者的癥狀較輕微但表型多樣。相比之下，位于TK結(jié)構(gòu)域之后的遠(yuǎn)端突變產(chǎn)生了一個(gè)缺乏ST和PR的截短蛋白質(zhì)，如我們之前所報(bào)道的c.2273C＞A［7-8］等，即位于ST1的雜合突變，這種突變患者的表型往往更嚴(yán)重，如手指重度中遠(yuǎn)端融合，甚至手指缺失，指（趾）甲完全缺失等。少數(shù)突變是由于移碼突變而產(chǎn)生新的C-末端，如c.2243delC（p.W749fs*24）和c.2249delG（p.G750fs*23）等，研究提示突變ROR2蛋白中額外C-末端肽的產(chǎn)生可能會(huì)造成并指表型［9］。本研究中發(fā)現(xiàn)的c.2239C＞T突變發(fā)生于TK末端，產(chǎn)生了一個(gè)缺失TK末端以及富含絲氨酸/蘇氨酸和脯氨酸結(jié)構(gòu)的截短蛋白。目前國(guó)內(nèi)外上發(fā)現(xiàn)的ROR2突變多是8、9號(hào)外顯子上無(wú)義突變或移碼突變導(dǎo)致的截短蛋白或產(chǎn)生的異常C末端。表1總結(jié)了國(guó)內(nèi)外有關(guān)ROR2基因突變導(dǎo)致BDB1的突變位點(diǎn)。

表1 導(dǎo)致BDB1的ROR2基因突變位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)

由ROR2基因突變導(dǎo)致BDB1的分子機(jī)制并不清楚。Takeuchi等［24］發(fā)現(xiàn)小鼠ROR2基因雜合缺失突變沒(méi)有表型。Oldridge等［3］發(fā)現(xiàn)兩個(gè)染色體9q22雜合缺失的患者并沒(méi)有表現(xiàn)出短指癥狀。這些研究說(shuō)明BDB1的發(fā)病是由于ROR2特定位置突變產(chǎn)生了致病的蛋白，而非單純的由于蛋白質(zhì)單倍型劑量不足所致［3］。本研究報(bào)道的ROR2c.2239C＞T突變導(dǎo)致mRNA上出現(xiàn)了提前終止密碼子（premature termination codon，PTC），但由于該突變發(fā)生在第9號(hào)外顯子上，翻譯后產(chǎn)生了較長(zhǎng)的多肽鏈，可能發(fā)生了無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解（nonsensemediated mRNA decay，NMD）逃逸，從而產(chǎn)生了有害的ROR2截短蛋白。研究表明，Wnt5a作為ROR2蛋白的配體，能夠與ROR2的CRD結(jié)合，Wnt5a/ROR2通路可通過(guò)激活SOX9促進(jìn)β-catenin降解，從而拮抗典型的Wnt信號(hào)通路參與軟骨形成，在肢體骨骼發(fā)育和形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮重要作用［25］。此外，ROR2蛋白胞內(nèi)區(qū)的PR和ST2可以和細(xì)絲蛋白A（Filamin A，F(xiàn)LNa）相結(jié)合，從而激活Wnt5a/ROR2/JNK信號(hào)通路誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的增殖和極性細(xì)胞遷移［26］。這些結(jié)果表明ROR2基因的突變可能通過(guò)上述通路信號(hào)傳導(dǎo)異常導(dǎo)致BDB1的發(fā)生。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)1個(gè)湖北漢族BDB1家系進(jìn)行突變鑒定，發(fā)現(xiàn)了ROR2c.2239C＞T突變可導(dǎo)致ROR2基因編碼的氨基酸序列上第747位精氨酸錯(cuò)義終止，形成截短蛋白。這一新的突變豐富了國(guó)際BDB1疾病的基因突變譜，結(jié)合以往我們報(bào)道的在3個(gè)湖北省BDB1家系中ROR2的另一個(gè)終止突變，提示ROR2基因的終止突變可能是湖北省BDB1疾病的主要致病基因突變。