褚雅歆，劉佳新，楊靜，郭晗，張?jiān)坡敚瑮畲T，喬蕊（1.北京大學(xué)第三醫(yī)院a.檢驗(yàn)科，b.婦產(chǎn)科，北京 100191；.北京積水潭醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100035）

子癇前期（preeclampsia，PE）是嚴(yán)重影響母嬰健康的妊娠并發(fā)癥，以妊娠20周后新發(fā)高血壓（≥140/90 mmHg）和蛋白尿（尿蛋白≥0.3 g/24 h）為特征，可迅速進(jìn)展至危及生命的子癇［1］。目前除終止妊娠外，PE尚無其他有效治療措施［2］。雖然PE發(fā)病機(jī)制尚不明確，但是胎盤缺血-再灌注損傷通常會(huì)導(dǎo)致母體全身血栓-炎癥反應(yīng)綜合癥［3-4］——使母體出現(xiàn)廣泛的血管內(nèi)皮功能障礙和止血系統(tǒng)過度激活。小劑量阿司匹林（100～150 mg/d）抗血小板治療是目前唯一被證明具有PE預(yù)防作用的措施［5］，提示血小板激活在PE母體血栓-炎癥反應(yīng)的發(fā)生或進(jìn)展中可能發(fā)揮著重要作用。

血小板在激活后形成的血小板促凝亞群可以大量釋放同時(shí)具有促炎癥和促凝作用的血小板微粒（platelet microparticle，PMP）［6-9］，所以該群血小板極有可能參與了PE母體全身血栓-炎癥的發(fā)生或進(jìn)展過程。因此，為了證明PE發(fā)生過程中，血小板激活是否會(huì)形成異常升高的促凝亞群，本研究首先利用流式細(xì)胞術(shù)構(gòu)建了血小板促凝亞群檢測方法，進(jìn)而探索了血小板促凝亞群形成在PE和正常妊娠過程中的水平差異。

1 對象和方法

1.1 研究對象 自2020年10月至2021年6月，連續(xù)入選北京大學(xué)第三醫(yī)院健康育齡女性49例，健康孕婦39例，PE孕婦34例。PE診斷符合《妊娠期高血壓疾病診治指南（2020）》診斷標(biāo)準(zhǔn)［10］。排除患有妊娠期高血壓、慢性高血壓、心臟病、糖尿病、自身免疫病、闌尾炎、膽囊炎和胰腺炎等疾病的患者。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號：IRB00006761），研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑 掃描電子顯微鏡（日本電子公司）；大容量臺(tái)式離心機(jī)（美國Thermo FIsher Scientific公司）；低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司），CantoⅡ流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；共聚焦培養(yǎng)皿（美國MatTek公司）。

I型膠原、凝血酶、Gly-Pro-Arg-Pro amide（GPRP）、PBS緩沖液、前列腺素E1（美國Sigma公司）；流式細(xì)胞管、FITC-Annexin V、PE-Cy7 CD41a抗體、PE-Cy7 IgG1κ同型對照（美國BD公司）；PE-CD62P抗體、PE-CD62P IgG1κ同型對照（美國Biolegend公司）；Cy5-GSAO、Cy5-GSCA（北京博奧森公司）；PGE1（美國MCE公司）。

1.3 體外激活血小板成為促凝血小板的反應(yīng)條件 采集5名健康育齡女性志愿者新鮮全血，在室溫條件下，即刻分別用不同濃度的膠原（2、5、10、12及15μg/mL）和凝血酶（0.1、0.2、0.5、1、2 U/mL）激活血小板（終濃度：2×109/mL），以確定體外激活血小板形成促凝血小板的適宜反應(yīng)條件。

1.4 利用掃描電鏡檢測促凝血小板形成 采集新鮮全血，0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝（抗凝劑∶全血＝1∶9），在室溫、230×g條件下離心5 min，獲取富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP），將PRP加入包被有膠原及凝血酶的共聚焦培養(yǎng)皿溫育60 min，洗滌及干燥處理后于電鏡下觀察。

1.5 利用流式細(xì)胞術(shù)構(gòu)建促凝血小板檢測方法

1.5.1 采用全血作為樣本檢測促凝血小板 即刻檢測枸櫞酸鈉抗凝血：設(shè)置同型對照管、CD41a單陽管、CD62P單陽管、GSAO單陽管，每份血小板分為靜息組、激活處理2個(gè)組。除靜息組外，分別向各管加入激活劑及相應(yīng)熒光抗體，室溫溫育15 min后洗滌，上機(jī)檢測。設(shè)門方案：首先，調(diào)節(jié)流式細(xì)胞儀電壓及補(bǔ)償，在FSC-SSC圖中圈定血小板大小所在位置，見圖1A中P1區(qū)域；其次，利用血小板特異表達(dá)CD41a圈出血小板，圖1B中P2區(qū)域；最后，通過PE-CD62P和Cy5-GSAO圈定血小板促凝亞群，見圖1C中Q2區(qū)域。

1.5.2 采用洗滌血小板作為樣本檢測促凝血小板 室溫條件下，枸櫞酸鈉抗凝血中加入前列腺素E1，離心（230×g，7 min）獲得PRP，再次離心（300×g，5 min）獲得血小板。洗滌血小板的染色處理程序、設(shè)門方案同上述全血，見圖1D～1F。

圖1 利用流式細(xì)胞術(shù)構(gòu)建促凝血小板檢測方法

1.5.3 檢測所構(gòu)建促凝血小板檢測方法的精密度 采集一名健康育齡女性志愿者靜脈血3 mL，枸櫞酸鈉抗凝，利用上述構(gòu)建的2種方法連續(xù)測定5次，計(jì)算變異系數(shù)（coefficient variation，CV）。

1.6 研究對象血小板激活成為促凝血小板的比例 采集研究對象靜脈血，枸櫞酸鈉抗凝，用1.5方法檢測研究對象血小板激活成為促凝血小板的比例并分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 分別用SPSS 20.0和Graphpad prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和繪圖。流式細(xì)胞術(shù)檢測促凝血小板的精密度評價(jià)以CV表示。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用±s表示，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用M（P25，P75）表示，采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)進(jìn)行多組間比較。促凝血小板對PE的鑒別效能用ROC曲線分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外激活血小板成為促凝血小板的反應(yīng)條件 在2～15μg/mL膠原濃度范圍內(nèi)和在0.1～2 U/mL凝血酶濃度范圍內(nèi)，血小板激活成促凝血小板的比例都逐漸升高，見圖2；用15μg/mL膠原和2 U/mL凝血酶聯(lián)合激活產(chǎn)生的促凝血小板水平高于2種激活劑單獨(dú)激活時(shí)水平，見表1。為了使流式細(xì)胞術(shù)構(gòu)建的促凝血小板檢測方法具有足夠精密度，選擇15μg/mL膠原和2 U/mL凝血酶聯(lián)合激活，作為體外檢測血小板激活形成促凝血小板能力的激活條件。

圖2 不同濃度膠原和凝血酶激活血小板成為促凝血小板的水平

表1 不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)血小板成為促凝血小板亞群的比例（n＝5）

2.2 掃描電鏡下血小板激活后的形態(tài) 見圖3。用15μg/mL膠原及2 U/mL凝血酶作為激活劑，在體外激活健康育齡女性的血小板，在掃描電鏡下可以觀察到3種不同形態(tài)的血小板，分別為靜息血小板、聚集血小板亞群和促凝血小板亞群。

圖3 掃描電鏡下血小板激活后的形態(tài)

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測促凝血小板精密度驗(yàn)證 利用全血在靜息、激活狀態(tài)下檢測促凝血小板的精密度分別為10.11%和3.13%；利用洗滌血小板在靜息和激活狀態(tài)下檢測促凝血小板的精密度分別為12.86%和6.75%。見表2。

表2 利用流式細(xì)胞術(shù)構(gòu)建促凝血小板檢測方法的精密度（n＝5）

2.4 研究對象人口學(xué)特征及臨床資料 研究對象人口學(xué)特征和臨床資料見表3，3組間年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；PE組和健康妊娠組懷孕期間增加體重、孕次、產(chǎn)次和孕周差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。計(jì)學(xué)意義［5.25%（4.13%，6.30%）vs 4.30%（3.70%，5.50%），P＝0.152］；血小板被激活后，PE孕婦組促凝血小板水平也高于健康育齡女性組［19.25%（15.98%，24.08%）vs 13.20%（11.55%，15.70%），P＜0.001］和健康妊娠孕婦組［19.25%（15.98%，24.08%）vs 16.50%（15.00%，17.50%），P＝0.047］。

表3 研究對象人口學(xué)特征及臨床資料

進(jìn)行ROC分析顯示，采用全血樣本，在靜息狀態(tài)下，ROC曲線下面積（AUCROC）為0.951（0.908～0.994），當(dāng)cut-off值為1.65%時(shí)，區(qū)分健康孕婦和PE的敏感性和特異性分別為97.1%和84.6%；在激活狀態(tài)下，AUCROC為0.993（0.978～1.000），當(dāng)cut-off值為12.35%時(shí)，區(qū)分健康孕婦和PE的敏感性和特異性分別為100.0%和97.4%；而洗滌血小板在激活狀態(tài)下，AUCROC為0.691（0.563～0.819），當(dāng)cut-off值為18.25%時(shí)，區(qū)分健康孕婦和PE的敏感性和特異性分別為61.8%和76.9%，見圖4。

圖4 采用不同樣本類型檢測促凝血小板區(qū)分正常妊娠和PE的性能

2.5 各組研究對象血小板激活成為促凝血小板比例的差異比較 采用全血作為檢測樣本，血小板在靜息狀態(tài)下，PE孕婦組促凝血小板水平高于健康妊娠女性組［2.30%（1.90%，2.80%）vs 1.35%（1.13%，1.50%），P＜0.001］和健康育齡女性組［2.30%（1.90%，2.80%）vs 0.30%（0.20%，0.60%），P＜0.001］；血小板被激活后，PE孕婦組促凝血小板水平也高于健康妊娠女性組［16.90%（15.25%，18.85%）vs 8.50%（7.92%，9.50%），P＜0.001］和健康育齡女性組［16.90%（15.25%，18.85%）vs 3.70%（2.95%，4.30%），P＜0.001］。

采用洗滌血小板作為檢測樣本，血小板在靜息狀態(tài)，PE孕婦組促凝血小板水平高于健康育齡女性組［5.25%（4.13%，6.30%）vs 2.50%（2.20%，2.90%），P＜0.001］，但與健康妊娠女性組差異無統(tǒng)

3 討論

本研究利用流式細(xì)胞術(shù)成功構(gòu)建了可靠的促凝血小板檢測方法，并且對入組的健康育齡女性、健康妊娠孕婦和PE孕婦進(jìn)行了促凝血小板檢測，結(jié)果提示PE孕婦血小板激活后成為促凝血小板水平顯著高于健康妊娠孕婦。

3.1 基于促凝血小板是血小板的一種死亡方式構(gòu)建促凝血小板檢測方案 細(xì)胞在經(jīng)歷壞死過程時(shí)，其線粒體膜上的mPTP的開放，隨后細(xì)胞內(nèi)部形成超高的Ca2+流，與細(xì)胞壞死過程相似，血小板促凝亞群的形成過程中同樣伴隨mPTP的開放以及細(xì)胞內(nèi)部的超高Ca2+流［9-13］；除此之外，在電子顯微鏡下觀察到血小板促凝亞群的關(guān)鍵形態(tài)特征類似于哺乳動(dòng)物有核細(xì)胞所表現(xiàn)的壞死特征，例如，細(xì)胞膜上PS轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜外側(cè)，細(xì)胞微泡化以及細(xì)胞膜完整性喪失［14］。所以，血小板促凝亞群是經(jīng)歷壞死過程的血小板。4-（N-（S-谷胱甘肽乙?；┌被┍诫纤幔?-（N-（S-glutathionylacetyl）amino）phenylarsonous acid，GSAO］是細(xì)胞壞死的標(biāo)志物，研究人員在GSAO的γ-谷氨?；鶜埢蠘?biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，利用它作為標(biāo)志物成功檢測到了血小板促凝亞群［15-19］。

除去壞死特征，血小板促凝亞群也是激活的血小板。血小板受到激活劑刺激后，CD62P大量轉(zhuǎn)移至血小板膜上，是血小板激活的標(biāo)志物［20］。因此，本研究采用CD62P以及GSAO同時(shí)定義血小板促凝亞群，成功利用全血和洗滌血小板作為樣本構(gòu)建了血小板促凝亞群的檢測方案。

3.2 PE的炎癥反應(yīng)狀態(tài)可能導(dǎo)致血小板在體內(nèi)預(yù)激活 本研究結(jié)果顯示，PE孕婦的促凝血小板水平均顯著高于健康妊娠孕婦，這可能是由于PE孕婦存在更高的炎癥反應(yīng)狀態(tài)，容易導(dǎo)致靜息血小板在體內(nèi)預(yù)激活。

促凝血小板形成的前提是胞漿Ca2+水平持續(xù)升高，當(dāng)血小板處于高炎癥環(huán)境時(shí)，促炎癥因子（如腫瘤壞死因子α）、黏附分子等增加，可通過復(fù)雜的機(jī)制導(dǎo)致血小板胞漿Ca2+升高，即血小板在炎癥狀態(tài)下可能被預(yù)激活，在受到激活刺激后就會(huì)更容易形成形成促凝血小板［21］。這與本研究結(jié)果一致：利用全血在靜息狀態(tài)下檢測的PE孕婦血小板促凝亞群水平顯著高于健康妊娠孕婦［2.30%（1.90%，2.80%）vs 1.35%（1.13%，1.50%），P＜0.001］（洗滌血小板可能由于樣品制備過程因素導(dǎo)致組間無差異）；在利用激活劑激活后，利用全血以及洗滌血小板作為樣本，PE組的血小板促凝亞群水平自然也均顯著高于健康妊娠孕婦組［16.90%（15.25%，18.85%）vs 8.50%（7.92%，9.50%），P＜0.001；19.25%（15.98%，24.08%）vs 16.50%（15.00%，17.50%），P＝0.047］。

3.3 促凝血小板檢測采用全血方案優(yōu)于洗滌血小板方案的原因 本研究結(jié)果顯示，采用全血檢測方案在檢測精密度和區(qū)分PE孕婦與健康妊娠孕婦時(shí)都顯示了優(yōu)越性。

首先，全血方案的樣本處理程序簡單導(dǎo)致檢測的變異因素少。利用全血在靜息、激活狀態(tài)下檢測促凝血小板的精密度分別為10.11%和3.13%；而利用洗滌血小板在靜息和激活狀態(tài)下檢測促凝血小板的精密度分別為12.86%和6.75%，提示采用洗滌血小板可能因?yàn)槎啻坞x心、洗滌導(dǎo)致檢測過程中影響因素增多，導(dǎo)致了檢測不確定度增加。

其次，血小板洗滌程序可能外源性增加了血小板的預(yù)激活程度，使PE組和健康妊娠組的差異縮小，區(qū)分PE孕婦和健康孕婦的能力下降。利用全血作為樣本，健康妊娠孕婦和PE孕婦的比較無論在靜息［1.35%（1.13%，1.50%）vs 2.30%（1.90%，2.80%），P＜0.001］或是激活狀態(tài)［8.50%（7.92%，9.50%）vs 16.90%（15.25%，18.85%），P＜0.001］差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而利用洗滌血小板進(jìn)行檢測，只有在激活狀態(tài)下，PE的促凝血小板水平顯著高于健康妊娠孕婦［19.25%（15.98%，24.08%）vs 16.50%（15.00%，17.50%），P＝0.047］，且差異程度不及采用全血樣本顯著；并且靜息狀態(tài)下兩組沒有差異［5.25%（4.13%，6.30%）vs 4.30%（3.70%，5.50%），P＝0.152］，這提示洗滌血小板的制備過程中可能導(dǎo)致了血小板預(yù)激活，使原本差異小的靜息狀態(tài)下的差異消失，激活狀態(tài)下的差異變小。ROC曲線分析顯示，用全血檢測，在靜息和激活狀態(tài)下檢測促凝血小板區(qū)分PE和健康妊娠的AUCROC分別為0.951和0.993；而利用洗滌血小板檢測，在激活狀態(tài)下，其ROCROC只有0.691，這表明采用全血檢測的區(qū)分PE孕婦和健康孕婦的能力明顯好于洗滌血小板。

綜上所述，利用流式細(xì)胞術(shù)成功構(gòu)建促凝血小板檢測方法，其中采用全血檢測的方案性能優(yōu)于洗滌血小板檢測方案。PE孕婦促凝血小板形成水平顯著高于健康妊娠孕婦，提示促凝血小板可能參與PE發(fā)生。