賈永娟，劉春冉，李婷，倪君君（北京和合醫(yī)學診斷技術股份有限公司研究院，北京 100079）

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的天然維生素K有2種：維生素K1和維生素K2。維生素K1主要來源于綠色植物，而維生素K2主要在體內(nèi)通過腸道細菌合成［1］。維生素K2的主要生理活性以MK4和MK7 2種形式為主，可以在人體內(nèi)直接發(fā)揮生理作用，而維生素K1必須通過生物轉化為維生素K2才能夠發(fā)揮生理作用。維生素K與機體健康密切相關，不僅在機體抗凝系統(tǒng)中扮演重要角色［2］，還參與調(diào)節(jié)骨代謝［3］、血管鈣化和心血管疾病的診斷與治療［4］、糖代謝、呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、癌癥及腫瘤的治療與預防等［5-7］。人體內(nèi)維生素K主要活性成分的監(jiān)測對人體健康有著極為重要的意義，特別是嬰幼兒和新生兒維生素K水平受到越來越多的關注和重視［8］。目前維生素K含量測定的樣本類型主要是血清［9］和血漿［10］，而指尖血相對于血清和血漿更易獲得且對患者創(chuàng)傷更小。本研究比較了指尖血、血清和血漿3種基質維生素K1、MK4和MK7檢測結果的差異，為醫(yī)學檢驗實驗室檢測維生素K1、MK4和MK7時選擇樣本基質提供指導和參考。

1 材料與方法

1.1 標本采集 分別采集30名健康志愿者指尖血100μL，分別采集靜脈血并制備新鮮血清、血漿標本各1 mL，排除溶血、脂血、黃疸標本。30名健康志愿者來自本單位，年齡25～45周歲，未服用維生素K制劑，體檢結果正常，對本研究知情同意。

1.2 主要儀器與試劑 島津LC-30ADCL高效液相色譜儀、島津8050C串聯(lián)四極桿質譜儀（日本島津公司），MSA 6.6S-0CE-DM電子天平、A-14C-1EU YCSR-A2B離心機（德國賽多利斯公司）；甲醇、甲酸、無水乙醇（德國默克公司），乙腈、異丙醇、環(huán)己烷（美國Fishier公司），Oasis?HLB SPE板（美國Waters公司），維生素K1、MK4、MK7標準品及內(nèi)標（美國Sigma公司）。天平精密稱取維生素K1、MK4、MK7標準品，并用乙腈溶解稀釋后得到3種物質混合標準品溶液，濃度范圍分別為維生素K1：0.015～250.000 ng/mL，MK4：0.015～15.000 ng/mL，MK7：0.015～30.000 ng/mL；天平精密稱取維生素K1、MK4、MK7內(nèi)標，并用乙腈溶解稀釋后得到3種物質混合內(nèi)標溶液，濃度分別為50 ng/mL、15 ng/mL、15 ng/mL。

1.3 方法 本實驗室自建方法。精密移取標準品溶液或人指尖血、血清、血漿各50μL于離心管中，加入10μL內(nèi)標溶液，充分混勻1 min；加入無水乙醇150μL，渦旋3 min，4℃14 462×g離心10 min，取上清液于Oasis?HLB SPE板，分別用300μL由甲醇和水（含0.5%甲酸）按2∶8比例配制的溶液、300μL乙腈和水（含0.5%甲酸）按9∶1配制的溶液洗滌SPE板，最用500μL由甲醇、異丙醇、環(huán)己烷按1∶1∶3比例配制的溶液進行洗脫，室溫下氮氣吹干洗脫液，最后加入80μL甲醇復溶，渦旋震蕩1 min，4℃14 462×g離心3 min，取上清液60μL進樣分析；色譜柱：Agilent Eclipse plus C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8μm）；流動相：甲醇（0.1%甲酸）/水（0.1%甲酸），梯度洗脫；質譜條件：APCI源，用自動優(yōu)化軟件對維生素K1、MK4、MK7進行優(yōu)化得出3種物質最優(yōu)質譜參數(shù)（離子源溫度：300℃、DL管溫度：300℃、霧化氣流速：2.5L/min、接口電壓：6kV）。每個基質類型分別檢測維生素K1、MK4、MK7含量，每份樣本檢測2次。

參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）C62-A文件《高效液相色譜質譜檢測方法指導原則》，對自建方法進行方法學驗證，包括回收率、基質效應、精密度、定量限、檢出限等，以確保檢測方法的準確性。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行。呈正態(tài)分布的計量資料用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 方法學驗證 參照C62-A對自建方法進行方法學驗證，在3種基質中維生素K1、MK4、MK7的回收率在90%～115%之間，基質效應在4.96%～5.69%之間，精密度以CV表示，均小于6.25%，檢出限和定量限遠遠小于定量下限，具體結果見表1。

表1 自建方法檢驗維生素K1、MK4、MK7的方法學考察結果

2.2 不同基質樣本K1、MK4、MK7水平 3種不同基質中維生素K1、MK4、MK7的檢測結果見表2。3種不同基質中維生素K1、MK4、MK7檢測結果差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。見表2。

表2 3種不同基質中維生素K1、MK4、MK7的檢測結果

3 討論

本研究結果表明，指尖血、血清和血漿3種不同基質用于維生素K1、MK4和MK7含量檢測，其結果差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。指尖血采集比通過靜脈穿刺采血更加容易，同時患者對這種形式的采血恐懼心理更小，護理人員的采血壓力也更小，但是在采集指尖血時要特別注意，采血中不可用力擠壓，以免組織液混入血液，使血液易于凝固和稀釋，從而導致測定結果出現(xiàn)誤差。

本研究從實際臨床需要出發(fā)，為醫(yī)學檢驗實驗室檢測維生素K含量提供了參考和依據(jù)。必須指出的是，本研究結果可能會受健康志愿者年齡、身體狀況、檢測方法等諸多因素的影響，本研究征集的30名健康志愿者是年齡在25～45周歲的健康人，采用的是LC-MS/MS方法，因此本研究得出的結論還需要在更多不同人群和其他檢測手段中進一步驗證。