李敏，孟祥兆，孫江漫，邵燕，于洪遠(yuǎn)（北京航天總醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100076）

總膽紅素是醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室肝功能檢查的重要常規(guī)項(xiàng)目，其結(jié)果有助于臨床醫(yī)生判斷患者肝臟功能、黃疸程度及類型等［1］。Doumas等開發(fā)的檢測(cè)總膽紅素的參考方法已獲得國(guó)際認(rèn)可，該方法建議使用NIST的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM916a作為一級(jí)參考物質(zhì)進(jìn)行校準(zhǔn)。目前，SRM916a已經(jīng)停產(chǎn)，這種狀態(tài)阻礙了總膽紅素的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程。德國(guó)漢諾威臨床化學(xué)研究所在Doumas參考方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，改良參考測(cè)量程序不再依賴標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行校準(zhǔn)。本研究通過復(fù)現(xiàn)血清總膽紅素的改良參考測(cè)量程序，并對(duì)其各項(xiàng)性能進(jìn)行評(píng)估，觀察其是否可實(shí)現(xiàn)臨床常規(guī)實(shí)驗(yàn)室總膽紅素檢測(cè)結(jié)果的量值溯源和標(biāo)準(zhǔn)化。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 Cary100紫外-可見分光光度計(jì)（安捷倫公司），LA120S型電子天平（賽多利斯公司），reference移液器（艾本德公司），Microlab-500型稀釋配液儀（Hamilton公司），Milli-Q純水機(jī)（密理博公司）。

對(duì)氨基苯磺酸（批號(hào)：BCBJ0170V）、亞硝酸鈉（批 號(hào)：1389022）、四 水 酒 石 酸 鉀 納（批 號(hào)：SLBD8827V）、氫氧化鈉（批號(hào)：BCBH5016）、安息香酸鈉（批 號(hào)：SLBC8803V）、EDTA-Na2（批 號(hào)：1205337）、醋酸鈉（批號(hào)：SZBF2210V）（Sigma公司），咖啡因（批號(hào)：007913275）購(gòu)自（AMRESCO公司）。

1.2 標(biāo)本來源 （1）2020年國(guó)際參考實(shí)驗(yàn)室比對(duì)標(biāo)本20RELA-A、20RELA-B，合格范圍分別為（53.50±2.94）μmol/L、（22.43±1.23）μmol/L，膽紅素國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW09184、GBW09185（有效期2021年12月），靶值±不確定度范圍分別為（108.10±1.9）μmol/L、（44.60±0.8）μmol/L（k＝2），均用于方法的正確度評(píng)價(jià)；（2）收集北京航天總醫(yī)院住院患者血清，無肉眼可見的溶血和乳糜，用于方法的精密度和線性評(píng)價(jià)。

1.3 方法

1.3.1 反應(yīng)原理 在咖啡因試劑的存在下，膽紅素與重氮試劑反應(yīng)生成偶氮膽紅素，酸性條件下呈紅色，堿性酒石酸使顏色不穩(wěn)定的紫紅色偶氮膽紅素轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的藍(lán)色偶氮膽紅素，最大吸收峰由530 nm轉(zhuǎn)移至598 nm，該波長(zhǎng)下偶氮化合物的吸光度與膽紅素濃度呈正比。

1.3.2 試劑配制與檢測(cè) 依據(jù)參考文獻(xiàn)［2］中的內(nèi)容配制相關(guān)試劑，包括咖啡因試劑、堿性酒石酸、亞硝酸鈉溶液、對(duì)氨基苯磺酸溶液、重氮試劑。實(shí)驗(yàn)室測(cè)量條件：溫度25℃；波長(zhǎng)598 nm；光譜帶寬2 nm；光徑10.0 mm。具體檢測(cè)步驟如下：1 mL的咖啡因試劑和0.2 mL的待測(cè)標(biāo)本同時(shí)加入測(cè)量管和空白管，室溫下充分混勻，靜置10 min。測(cè)量管和空白管中分別加入0.5 mL的重氮試劑和對(duì)氨基苯磺酸，室溫下充分混勻，靜置10 min。最后，測(cè)試管和空白管中均加入1 mL的堿性酒石酸，室溫下充分混勻，靜置10 min后在598 nm處檢測(cè)吸光度。

1.3.3 測(cè)量結(jié)果的計(jì)算 血清總膽紅素含量是由空白吸光度修正后的最終反應(yīng)混合物的吸光度總和乘以因子F計(jì)算得出，具體公式見公式1。

式中ε為摩爾吸光系數(shù)（7 649 m2/mol）［3］，d為比色杯光徑（0.01 m），v為樣本的體積分?jǐn)?shù)（0.074 04），f為mol/m3到μmol/L的單位轉(zhuǎn)換系數(shù)（1 000），Atotal為最終完全反應(yīng)混合物在598 nm處的吸光度，Ablank為空白溶液在598 nm處的吸光度，經(jīng)計(jì)算F因子＝176.5?？瞻坠芘c測(cè)量管相比，除了用對(duì)氨基苯磺酸代替重氮試劑，其他添加試劑和反應(yīng)條件均相同。

1.4 性能評(píng)價(jià)

1.4.1 正確度 采用改良的參考測(cè)量程序檢測(cè)國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和RELA比對(duì)標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)測(cè)量3次，計(jì)算平均值，比較均值與靶值/認(rèn)定值的偏倚。

1.4.2 精密度 取3份不同濃度梯度的血清標(biāo)本，每天每個(gè)濃度標(biāo)本測(cè)量5次，連續(xù)測(cè)量5 d，各25個(gè)檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算總CV。

1.4.3 線性 參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所的EP-6A文件，收集本院高值（H）膽紅素血清樣本，低值（L）血清樣本，按L、0.8L+0.2H、0.6L+0.4H、0.4L+0.6H、0.2L+0.8H、H的比例配制6個(gè)濃度標(biāo)本，按隨機(jī)順序?qū)γ總€(gè)濃度的標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合多項(xiàng)式回歸分析。

1.4.4 不確定度 根據(jù)《測(cè)量不確定度表示指南》，識(shí)別測(cè)量結(jié)果各不確定度分量來源，對(duì)各分量分別進(jìn)行評(píng)定，計(jì)算相對(duì)擴(kuò)展不確定度。

1.4.5 方法學(xué)比對(duì) 采用改良參考測(cè)量程序和Doumas方法測(cè)定40份新鮮冰凍人血清標(biāo)本中的總膽紅素，濃度范圍為10～240μmol/L，選取最佳擬合模型進(jìn)行回歸分析，計(jì)算回歸方程及各項(xiàng)參數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件和Microsoft Excel 2003進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 正確度評(píng)價(jià) 改良參考測(cè)量程序?qū)?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和RELA樣本的檢測(cè)結(jié)果見表1，所有測(cè)量值均在合格范圍內(nèi)，偏倚均小于1.5%。

表1 總膽紅素正確度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.2 精密度評(píng)價(jià) 3個(gè)濃度水平的血清標(biāo)本連續(xù)測(cè)量5 d結(jié)果的總CV均小于1.5%，見表2。

表2 總膽紅素精密度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3 線性評(píng)價(jià) 使用改良的參考測(cè)量程序檢測(cè)6個(gè)濃度梯度的標(biāo)本，結(jié)果見表3。對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析處理。通過對(duì)結(jié)果分析可知，二次和三次回歸多項(xiàng)式中的非線性參數(shù)與0相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)最適擬合模型為一次多項(xiàng)式，總膽紅素在11.55～443.96μmol/L的范圍內(nèi)呈線性。

表3 總膽紅素線性評(píng)價(jià)測(cè)量結(jié)果

2.4 不確定度評(píng)價(jià) 建立評(píng)定總膽紅素測(cè)量不確定度的模型，見公式1。識(shí)別不確定度來源，考慮影響測(cè)量結(jié)果的所有因素，將其繪制成因果關(guān)系圖，見圖1。識(shí)別不確定度來源后，量化這些不確定度來源所產(chǎn)生的不確定度分量。經(jīng)分析，波長(zhǎng)、吸光度、測(cè)量溫度、延遲時(shí)間、樣本體積分?jǐn)?shù)等是影響總膽紅素測(cè)量不確定度的主要分量。通過對(duì)不確定度分量的合成，計(jì)算合成不確定度及相對(duì)擴(kuò)展不確定度，見表4。

表4 不確定度評(píng)價(jià)結(jié)果

圖1 不確定度來源的因果關(guān)系圖

2.5 方法學(xué)比對(duì) 以Doumas參考方法的測(cè)定結(jié)果為X軸，改良參考測(cè)量程序的測(cè)定結(jié)果為Y軸，對(duì)兩種方法采用Passing-Bablok回歸分析。線性回歸方程為Y＝0.029 9+1.001X，斜率的95%CI為0.995 8～1.004 6，截距的95%CI為-0.197 2～0.187 5，相關(guān)系數(shù)r＝0.999，回歸線顯示斜率與1、截距與0無顯著偏差，因此兩種方法測(cè)量結(jié)果之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

雖然總膽紅素的Doumas參考方法已獲得美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）的批準(zhǔn)，但是官方認(rèn)可的總膽紅素參考測(cè)量實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)仍然缺失，其中很大的原因是由于NIST提供的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM916a無法持續(xù)供應(yīng)。因此，避免使用916a進(jìn)行校準(zhǔn)，有利于優(yōu)化測(cè)量程序的性能并消除相關(guān)的不確定度因素。

本研究依據(jù)相關(guān)文件復(fù)現(xiàn)總膽紅素改良參考測(cè)量程序，與傳統(tǒng)的Doumas參考方法相比有以下幾點(diǎn)不同：（1）使用摩爾吸光系數(shù)代替標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行校準(zhǔn)，無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)典的Doumas參考方法的難點(diǎn)之一是標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，用NIST916a配制200 mg/L總膽紅素標(biāo)準(zhǔn)原液并在598 nm處測(cè)定摩爾吸光系數(shù)ε，若ε滿足證書要求，則可以將原液稀釋成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。Lo等［4］的總膽紅素室間比對(duì)表明使用摩爾吸光系數(shù)代替標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行校準(zhǔn)，有助于推動(dòng)總膽紅素測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)化的進(jìn)程。（2）樣本量從0.5 mL減少到0.2 mL，最終反應(yīng)混合物的體積從8.5 mL減少到2.7 mL，有利于小體積患者標(biāo)本的測(cè)量。（3）傳統(tǒng)方法對(duì)總膽紅素的測(cè)量上限為261μmol/L，改良后的程序提供了更高的測(cè)量范圍，經(jīng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證，測(cè)量上限可達(dá)443.96μmol/L。（4）不確定度分量的來源發(fā)生變化。Doumas參考方法中校準(zhǔn)曲線斜率和截距、標(biāo)準(zhǔn)原液的配制是主要的不確定度分量來源，改良后的參考測(cè)量程序消除了校準(zhǔn)曲線引入的不確定度分量。

對(duì)于改良參考測(cè)量程序，本研究未對(duì)可能的干擾因素進(jìn)行研究，如標(biāo)本中血紅蛋白濃度、鋅的濃度、光照強(qiáng)度的影響等，我們將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中及時(shí)補(bǔ)充相關(guān)數(shù)據(jù)。