張 鵬

（上海兒童醫(yī)學中心，上海 200127）

硅基器件因其精確定義的微納尺度特征而越來越受到植入式醫(yī)療應(yīng)用的青睞，這些特征可以以低單位成本生產(chǎn)，并與微電子集成。其中一些設(shè)備包括用于神經(jīng)假體的微電極、用于控制藥物輸送的系統(tǒng)、用于細胞移植的免疫隔離室和用于腎臟替代治療的濾膜。此類應(yīng)用使硅直接接觸體液，包括血液。根據(jù)美國疾病控制和預(yù)防中心（CDC），任何遇到無菌生物液體的醫(yī)療設(shè)備都被歸類為“關(guān)鍵項目”，必須進行消毒。對于植入物，指南要求無菌保證水平（SAL）為10這相當于百萬分之一的孢子在滅菌過程中存活的概率。這一水平可以通過許多物理和化學過程實現(xiàn)：高溫暴露、化學和化學等離子體暴露以及輻射。雖然這些處理可以根除微生物和孢子，但其嚴酷的特性可能導(dǎo)致醫(yī)療器械組件的交聯(lián)、鍵斷裂和/或氧化，可能對功能化表面造成不可接受的損壞。

雖然硅本身可能不受常規(guī)滅菌技術(shù)（如高壓滅菌器和γ輻射）的影響，但滅菌對應(yīng)用于硅的薄膜聚合物表面涂層的影響尚未得到很好的表征。其他研究表明，滅菌對水凝膠、交聯(lián)聚合物和表面改性的影響為幾個數(shù)量級。然而，據(jù)我們所知，滅菌對PEG、pSBMA和pMPC的刷狀聚合物結(jié)構(gòu)的影響尚未見報道。因此，本研究的目的是研究常用滅菌方式對涂有PEG、pSBMA和pMPC的硅的影響。使用CDC認可的5種技術(shù)對涂層基材進行滅菌：高壓滅菌器、干熱、過氧化氫（HO）等離子體、環(huán)氧乙烷（EtO）氣體和電子束（電子束）輻照。我們利用各種表面表征工具來檢查滅菌的物理和化學效應(yīng)。用X射線光電子能譜（XPS）測定了表面的化學成分。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測量滅菌前后蛋白質(zhì)抗性的變化。

1 材料與方法

1.1 材料準備

從Ultrasil公司獲得雙面拋光、400 μm厚的p型硅片，并將其切成1 cm的芯片。用硫酸（96%）與過氧化氫（30%）比例為3∶1的溶液清洗20 min。然后將芯片暴露于氫氟酸中5 min，以去除暴露于大氣氧氣中的硅表面自發(fā)形成的二氧化硅，接著激活水面，再將洗液清洗干凈，然后用氮氣干燥硅片。

1.2 表面改性

1.2.1 PEG表面改性

如前所述，用PEG對硅表面進行改性。簡單地說，基板在110 ℃的加熱板上干燥1 h。2-[甲氧基（聚乙烯氧基）丙基]三甲氧基硅烷（PEG硅烷）通過將基底浸入285 μL PEG硅烷溶液中，在70 ℃溫度下浸泡2 h，共價鍵合到硅上。然后用甲苯每隔10 min沖洗基底3次，分別用乙醇和水去除多余的聚乙二醇。

1.2.2 兩性離子表面改性

兩性離子表面改性如前所述進行。表面引發(fā)劑2-溴-2-甲基-N-3[（三甲氧基硅基）丙基]-丙酰胺（BrTMOS）。將底物置于雙環(huán)己基中的1%（v/v）BrTMOS溶液中2 h。然后分別用氯仿、乙醇和水沖洗表面，以去除多余的BRTMO。

2-（甲基丙烯酰氧基）乙基]二甲基-（3-磺丙基）氫氧化銨（SBMA）和2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿（MPC）。468 mg（3 mmol）2,2’-聯(lián)吡啶脫氣溶液（≥98%）和單個單體SBMA∶1.06 g（3.8 mmol）和MPC∶506 mg（1.9 mmol） 和22.3 mg（0.1 mmol）溴化銅（99%）在5∶5 mL甲醇。在氮氣保護下，將該混合物添加到含有4種底物和143 mg（1 mmol）溴化銅（99.999%）的反應(yīng)室中，并對pSBMA和pMPC分別進行15 min和7 min的聚合。然后用氯仿、乙醇、磷酸鹽緩沖鹽和水沖洗底物，并用氮氣流干燥。

1.2.3 滅菌過程

評估了5種滅菌過程。使用STERIS Amsco Century SV-120 Scientific Prevacum滅菌器進行高壓滅菌器滅菌，在121 ℃下將基質(zhì)暴露在高壓蒸汽中30 min。對于干熱滅菌，將基質(zhì)置于160 ℃烘箱中2 h。使用STERRAD?100S滅菌系統(tǒng)進行HO等離子體處理（標準循環(huán)）。由D2EO進行EtO氣體處理，在13.2 kPa和55 ℃下暴露2 h。最后，由STERIS在21.0～21.9 kGy的應(yīng)用劑量范圍內(nèi)進行電子束滅菌。

1.2.4 表面特性

光電子能譜：使用表面科學儀器S探針光譜儀和單色Al KαX射線束進行XPS。使用150 eV的通過能產(chǎn)生測量和高分辨率光譜。將樣品加壓至小于5×10torr，并使用0°起飛角，對應(yīng)于約10 nm的取樣深度。對于每個樣品，在3個點大小約為800 μm的位置測量XPS。

橢偏儀：使用LSE Stokes橢偏儀和6328?HeNe激光以70°的入射角測量表面涂層厚度。將測量的反射和透射數(shù)據(jù)輸入菲涅耳方程，在已知折射率的情況下，迭代求解透明膜的厚度。對于兩性離子和PEG表面涂層，使用1.45的折射率?？臻g均勻性的特點是在每個樣本集的3個單獨芯片上測量3個位置?？偣矊?次測量進行了平均，并報告了平均值和標準偏差。

酶聯(lián)免疫吸附：通過在37 ℃下將底物在1 mg/mL的人血清白蛋白（HSA）的D-PBS溶液中培養(yǎng)90 min來評估對蛋白質(zhì)吸附的抵抗力。在HSA培養(yǎng)后，所有底物用0.5 mL的D-PBS沖洗5次，用濃度為1 mg/mL牛血清白蛋白持續(xù)1.5 h。用0.5 mL的D-PBS將基質(zhì)沖洗5次，并轉(zhuǎn)移到新鮮的腔室中。然后將樣品與10 μg/mL抗人血清白蛋白抗體結(jié)合辣根過氧化物酶孵育1.5 h。再次沖洗（用0.5 mL D-PBS沖洗5次）后，再次沖洗基質(zhì)并轉(zhuǎn)移到新鮮的腔室。0.5 mg/mL鄰苯二胺和0.03%過氧化氫在0.05 M檸檬酸鹽磷酸鹽緩沖液（pH5.0）中的溶液。使用鋁箔在37 ℃下避光20 min，然后通過添加0.5 mL 1M硫酸停止該反應(yīng)。在490 nm處測量溶液的光吸收率。每種樣品類型一式3份進行測試，并減去背景（未添加HSA的對照）。將所有HSA蛋白吸附數(shù)據(jù)標準化為組織培養(yǎng)聚苯乙烯（TCPS），作為陽性對照。

2 結(jié)果與討論

2.1 X射線光電子能譜（XPS）

接觸角數(shù)據(jù)如圖1所示。

圖1 表面改性和未改性硅滅菌前后的接觸角測量Fig.1 Contact angle measurement of surface modified and unmodified silicon before and after sterilization

圖2（a）～（d）顯示了每種表面改性的各種滅菌方法后的相應(yīng)光譜。固著水滴在10 s內(nèi)保持穩(wěn)定，未涂覆的硅襯底具有32°的接觸角。通過PEG表面改性，接觸角增加到43°。兩性離子涂層顯示pSBMA和pMPC的接觸角分別降低到15°和25°。正如接觸角測量所反映的，所有3種表面改性都是親水的。然而，通過滅菌處理觀察到親水性的顯著變化，尤其是對于未涂覆和pMPC涂覆的基材。高壓釜對pSBMA硅的接觸角影響最大，增加了15°。過氧化物處理對PEG硅的影響最大，降低了14°。

圖2 表面改性的各種滅菌方法后的相應(yīng)光譜Fig.2 Corresponding spectra after various sterilization methods of surface modification

在所有情況下，單晶硅襯底和天然二氧化硅分別存在Si（2p）（100 eV）和O（1s）（528 eV）峰值。未改性的硅也顯示出約8%的不定碳的存在，HO等離子體處理的基板除外，其中碳含量約為16%。在HO等離子體處理后，未改性的硅顯示出較高的氧含量以及氮、鈉和氟的存在。由于這些污染元素在其他基質(zhì)上不明顯存在，它們的存在可能是由于樣品處理不當造成的。除過氧化氫處理的樣品外，在滅菌和未滅菌的硅襯底之間，晶體硅和二氧化硅含量的變化小于5%。

與未改性的硅相比，pSBMA耦合硅的Si（2p）濃度急劇下降大于40%，C（1s）含量增加大于37%。此外，還存在特征元素N（1）（～400 eV）和S（2S）（～228 eV）以及Br 3d（～69 eV），表明pSBMA表面改性成功。滅菌后，與未滅菌pSBMA基板的20%硅含量相比，這些樣品的硅濃度略有下降，從11%～17%不等。

2.2 橢偏儀

使用橢偏儀測定各種表面涂層的厚度，如圖3所示。

圖3 通過橢偏儀測量PEG、pSBMA和pMPC的涂層厚度Fig.3 Measurement of coating thickness of PEG，pSBMA and pMPC by ellipsometer

PEG、pSBMA和pMPC涂層的起始厚度分別為0.9、7.1和2.7 nm。當用過氧化氫等離子體滅菌時，觀察到所有涂層的統(tǒng)計顯著差異，經(jīng)過幾次滅菌處理后涂層厚度的大幅減少。通過干熱、過氧化氫和電子束輻照處理，PEG硅的厚度減少30%以上，而通過干熱和過氧化氫處理，pSBMA和pMPC的厚度變化超過20%。此外，高壓釜中的蒸汽處理對pSBMA也有很大影響，厚度減少了29%。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附

圖4所示的HSA蛋白質(zhì)吸附數(shù)據(jù)表明，未經(jīng)滅菌的pSBMA和經(jīng)pMPC涂覆的硅片均顯示出優(yōu)異的非污染性能，與未涂覆的硅片相比，蛋白質(zhì)吸附分別降低了90%和95%。相比之下，PEG涂層芯片僅比未涂層硅降低10%。

圖4 相對人血清白蛋白（HSA）在PEG、pSBMA和pMPC修飾和未修飾的硅表面上的吸附Fig.4 Relative human serum albumin （HSA） adsorption on modified and unmodified silicon surfaces of PEG，pSBMA and pMPC

3 結(jié)語

隨著新型聚合物和功能表面在醫(yī)療器械中越來越普遍，必須評估滅菌可能對其產(chǎn)生的影響。對植入式醫(yī)療設(shè)備上的聚合物表面改性進行滅菌尤其苛刻。因此，我們提供了各種滅菌工藝對硅上薄膜聚合物刷影響的數(shù)據(jù)。研究表明，HO等離子體處理對所有3種聚合物涂層都有不利影響。相比之下，高壓釜和EtO處理似乎適用于PEG、pSBMA的電子束滅菌以及pMPC涂層的EtO處理。這些結(jié)果將有助于任何使用超薄兩性離子或PEG涂層的硅醫(yī)療設(shè)備的應(yīng)用。這些影響是獨特的表面涂層的化學和物理性質(zhì)。因此，本工作為確定滅菌對任何表面改性的影響提供了指南。