羅文芳 何偉 孫曉軍 周軍輝 許建軍

摘要 為篩選對瓜列當具有良好防治效果的生防真菌，本研究從新疆加工番茄田自然發(fā)病的瓜列當莖基部分離病原真菌，采用盆栽瓜列當接種無菌發(fā)酵濾液原液，篩選對瓜列當具有強致病性的菌株;采用共培養(yǎng)法測定菌株不同濃度無菌發(fā)酵濾液及其發(fā)酵產物萃取物對瓜列當種子萌發(fā)的影響;利用形態(tài)學特征和分子生物學方法對其進行種類鑒定。結果表明：盆栽瓜列當接種無菌發(fā)酵濾液原液可使瓜列當植株傷口變褐，嚴重的可造成整株萎蔫死亡;菌株JTF001發(fā)酵原液對瓜列當種子萌發(fā)抑制率可達100%，25倍、50倍稀釋液抑制率分別為92.88%和87.62%;濃度為5 μg/mL和1 μg/mL JTF001發(fā)酵產物對瓜列當種子萌發(fā)抑制率均達100%;濃度為0.5、0.25 μg/mL 和0.1 μg/mL 的JTF001發(fā)酵產物對瓜列當種子萌發(fā)的抑制率分別為91.03%、81.87%和60.04%;結合形態(tài)學和基于rpb2、tef 1和gapdh基因序列分析，將菌株JTF001鑒定為交鏈格孢Alternaria alternata。上述結果表明菌株JTF001有作為開發(fā)防治瓜列當生物農藥的潛力。

關鍵詞 瓜列當;交鏈格孢;生物防治;發(fā)酵產物

中圖分類號： S476;S451

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021192

Abstract The present study was to isolate fungi from the stem base of Orobanche aegyptiaca， which naturally occurred in processing tomato fields in Xinjiang， and screen the strong pathogenic strains against O.aegyptiaca by potting assay with the sterile fermentation filtrate of the strains stock solution. The activities of the sterile fermentation filtrate of the strains and extracts of its solid fermentation products against the seed germination of O.aegyptiaca were measured by using the co-cultivation method. The species of strong pathogenic strains were identified by using morphological characteristics and molecular biological method. The potting assay showed that the inoculated area turn brown after inoculation with the sterile fermentation filtrate， and the whole plant even wilted or died. The inhibition rate of the fermentation filtrate of strain JTF001 on the seed germination of O.aegyptiaca was 100%， and the 25-fold and 50-fold dilutions was 92.88% and 87.62%， respectively. The inhibition rate of the extracts of the solid fermentation products on seed germination of O.aegyptiaca was up to 100% at the concentration of 5 μg/mL or 1 μg/mL， and it was 91.03%， 81.87% and 60.04% at 0.5 μg/mL， 0.25 μg/mL or 0.1 μg/mL， respectively. Strain JTF001 was identified as Alternaria alternata based on morphological characteristics and sequence analysis of rpb2， tef 1 and gapdh. In conclusion， the above results suggested that A. alternata JTF001 had the potential to be developed as a biopesticide for the prevention of O.aegyptiaca.

Key words Orobanche aegyptiaca;Alternaria alternata;biocontrol;fermented products

瓜列當Orobanche aegyptiaca為列當科Orobanchaceae列當屬Orobanche一年生草本植物。由于缺少葉片、葉綠素和功能性根，列當完全寄生在寄主植物根系上，靠汲取寄主水分、養(yǎng)分及各類生長激素來維持自身生長，因此會對寄主造成嚴重危害[1]。據調查，在新疆受列當屬植物危害的農作物（向日葵、甜瓜、加工番茄、打瓜、辣椒等）面積為5.3萬～6.7萬hm2，每年給新疆農業(yè)生產造成的損失超過5億元人民幣，且發(fā)生面積還有進一步擴大的趨勢[2]。

由于列當寄生的特殊性，對列當進行有效防治是當今農業(yè)生產上的難題。利用列當病原微生物研制?；詮?、對目標雜草以外的植物影響小、環(huán)境負效應小且安全性高的生防菌劑，是目前防治該類雜草經濟有效的方法之一。真菌是常見的生物防治微生物，列當生防微生物的研究主要集中在鐮刀菌Fusarium spp.等列當病原菌和根瘤菌Rhizobium spp.等列當寄主植物共生菌上[3]?？琢顣缘萚4]報道利用致病鐮刀菌Fusarium sp. L2菌株對向日葵列當Orobanche cumana進行田間生物防治，防治效果達92.4%，且對小麥、玉米、棉花、煙草和向日葵等作物安全。Thomas等[5]在出土向日葵列當上接種尖孢鐮刀菌F.oxysporum的分生孢子培養(yǎng)液后，其死亡率可高達85%。尖孢鐮刀菌 FoxyⅠ和 FoxyⅡ的孢子懸浮液也可顯著降低鋸齒列當O.crenata和分枝列當O.ramose的萌發(fā)率及寄生率[6]。除鐮刀菌外，其他一些列當的病原菌也具有類似防除列當的潛能，Ulocladium botrytiss和洋蔥曲霉Aspergillus alliaceus也具有類似防除列當的作用[7-8]。

為獲得對瓜列當具有良好防治效果的真菌菌株，本研究從自然發(fā)病瓜列當病樣中分離致病菌，采用盆栽瓜列當接種無菌發(fā)酵濾液篩選對瓜列當具有強致病性的菌株，測定其不同濃度的發(fā)酵液和發(fā)酵產物對瓜列當種子萌發(fā)抑制效果，采用形態(tài)學和分子生物學方法對其進行鑒定。以期為新疆本地瓜列當的防治提供生防菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試種子和菌株：瓜列當種子采自吉木薩爾縣加工番茄田自然成熟瓜列當植株，菌株分離自吉木薩爾縣加工番茄田自然發(fā)病瓜列當植株莖基部。

供試培養(yǎng)基：1）馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂12 g、蒸餾水1 000 mL;2）馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL;3）馬鈴薯胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（potato carrot agar，PCA）：馬鈴薯20 g、胡蘿卜25 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL;4）半固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、麥芽糖40 g、酵母提取粉10 g、瓊脂4 g、蒸餾水1 000 mL;5）大米培養(yǎng)基：大米80 g、酵母粉1.2 g、蒸餾水120 mL，封口、浸泡過夜。所有培養(yǎng)基均121℃滅菌30 min。

試劑與儀器：獨腳金內酯（GR24）購于北京酷來博科技有限公司。真菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司。其他試劑均為國產分析純。DWP-9272恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司。YJ-VS-2型超凈工作臺，無錫一凈凈化設備有限公司。HZQ-X500型恒溫振蕩器，上海一恒科學儀器有限公司。XYH-2A雙目體視顯微鏡，上海光學儀器一廠。BK5000生物顯微鏡，重慶奧特光學儀器有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 微生物的分離與純化

采用組織分離法在自然發(fā)病瓜列當植株病健交界處剪切0.2 cm×0.2 cm左右的組織，用70%乙醇處理1 min，3%次氯酸鈉溶液消毒3 min，無菌水連續(xù)漂洗4次，用滅菌濾紙吸干表面水分后放置在PDA培養(yǎng)基平板上，（28±2）℃ 恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2～3 d。挑取菌落邊緣菌絲進行純化，連續(xù)純化4次，并轉接到PDA斜面試管中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 分離菌株對瓜列當的致病性測定

將純化的供試菌株制成孢子懸浮液，采取針刺法、涂抹法和噴霧法3種方式進行致病性測定。針刺法：用接種針蘸取孢子懸浮液，分別針刺瓜列當的基部、中部和頂端;涂抹法：用涂布器蘸取孢子懸浮液，分別涂抹瓜列當植株上述3個部位，接種后用濕潤的脫脂棉覆蓋，用噴有無菌水的密封袋罩住，保濕24 h后摘下密封袋和脫脂棉。噴霧法：噴灑500 μL孢子懸浮液在出土的瓜列當植株上，用密封袋覆蓋瓜列當植株保濕24 h后摘下;空白對照為無菌水，各處理及對照均為3次重復。2 d后開始調查瓜列當發(fā)病情況，7 d后結束調查。

1.2.3 發(fā)酵液對瓜列當種子萌發(fā)的抑制作用

瓜列當種子前期處理：將瓜列當種子用75%乙醇消毒1.5 min，1%的次氯酸鈉消毒12 min，無菌濾紙上晾干備用。

供試菌株轉接于PDA平板中，28℃活化48 h，將活化后的菌株移至PDB培養(yǎng)基中，28℃，135 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后即為種子液。取種子液5 mL轉入裝有100 mL PDB培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，28℃，135 r/min條件下振蕩培養(yǎng)120 h，8 000 r/min離心10 min，取上清液過濾獲得無菌發(fā)酵濾液。將40粒瓜列當種子放置在裝有whatman濾紙（GA/A）的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中加入2 mL 0.05 mg/mL GR24和2 mL發(fā)酵濾液，PDB培養(yǎng)液對照處理中加入2 mL GR24和2 mL PDB，菌株發(fā)酵液和PDB分別設置為原液、25倍稀釋液和50倍稀釋液3個處理，空白對照（CK）中加入2 mL GR24和2 mL無菌水，3次重復。（25±2）℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d，體視顯微鏡下觀察瓜列當種子萌發(fā)情況并記錄萌發(fā)數量，計算抑制率。

抑制率=

空白對照種子萌發(fā)率-處理種子萌發(fā)率空白對照種子萌發(fā)率×100%。

1.2.4 菌株JTF001對番茄植株安全性測定

將菌株JTF001制成1×108個/mL的孢子懸浮液，每株番茄上分別均勻噴灑5 mL孢子懸浮液，用密封袋覆蓋番茄植株保濕24 h后摘下。以茄鏈格孢Alternaria solani 1×108個/mL的孢子懸浮液為對照;空白對照為無菌水，各處理及對照均為3次重復，3 d后開始調查番茄植株生長情況，10 d 后結束調查。

1.2.5 菌株JTF001固體發(fā)酵產物萃取液活性測定

將純化的生防菌株接于PDA平板上培養(yǎng)5 d，打取菌餅接種于半固體培養(yǎng)基中，28℃，135 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，即為半固體種子液;取半固體種子液5 mL轉入大米培養(yǎng)基中，（28±2）℃，恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)15 d，即得供試菌株大米固體發(fā)酵物。將大米固體發(fā)酵物進行機械粉碎，每瓶加入240 mL乙酸乙酯浸泡，超聲萃取2次，旋轉蒸發(fā)得到發(fā)酵產物，使用時用1 mL甲醇溶解，4℃保存。

于24孔板中每孔加入40粒消毒干燥的瓜列當種子、0.5 mL 0.05 mg/mL GR24和0.5 mL發(fā)酵產物，發(fā)酵產物濃度分別為5、1、0.5、0.25 μg/mL和0.1 μg/mL;甲醇對照選用0.5 mL 0.05 mg/mL GR24和0.5 mL 5 μg/mL甲醇;空白對照（CK）加入0.5 mL 0.05 mg/mL GR24和0.5 mL無菌水，每處理3次重復。25℃，遮光培養(yǎng)5 d后，體視顯微鏡下觀察記錄瓜列當種子萌發(fā)數量。

1.2.6 菌株JTF001形態(tài)學和分子生物學鑒定

形態(tài)學鑒定：觀察成熟菌落形態(tài)、菌絲和分生孢子大小、形態(tài)和顏色等特征，分生孢子梗的形態(tài)特征，參考《中國真菌志·鏈格孢屬》進行分類鑒定[9]。

分子生物學鑒定：采用真菌通用引物ITS基因、RNA聚合酶Ⅱ第2大亞基基因（rpb2）、翻譯延伸因子基因（tef 1）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（gapdh）特異性引物進行PCR擴增測序[10-11]，引物序列如表1所示。

PCR反應體系（50 μL）：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，加ddH2O至總體積50 μL。ITS反應條件：94℃預變性4 min;94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30個循環(huán);72℃延伸10 min。rpb 2反應條件：94℃預變性5 min;94℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán);72℃延伸10 min。tef 1反應條件：94℃預變性5 min;94℃變性45 s，58℃退火55 s，72℃延伸40 s，共31個循環(huán);72℃延伸10 min。gapdh反應條件：94℃預變性4 min;94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30個循環(huán);72℃延伸5 min。

PCR產物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測得的序列經NCBI進行BLAST比對后，用MEGA 5軟件進行序列分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 數據分析

本試驗所有數據均采用3次重復，試驗數據用DPS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 分離菌株對瓜列當致病性

通過對瓜列當罹病植株進行組織分離，共獲得14株真菌，盆栽接種試驗結果（表2）表明，菌株JTF001發(fā)酵液針刺接種瓜列當2 d傷口處變褐壞死，有明顯的縊縮現(xiàn)象，逐漸擴展到整個植株，接種后7 d整株枯萎，死亡;涂抹接種后2 d植株大面積變褐、萎蔫，7 d整株干枯死亡;噴霧接種后2 d使得瓜列當花萼變褐干枯，7 d整株枯萎死亡，而對照瓜列當植株生長狀態(tài)良好（圖1），說明菌株JTF001對瓜列當植株具有強致病性。

2.2 菌株JTF001發(fā)酵液對瓜列當種子萌發(fā)的抑制作用

菌株發(fā)酵原液可完全抑制瓜列當種子的萌發(fā)，抑制率達100%;25倍和50倍稀釋液的抑制率分別為92.88%和87.62%（表3）。菌株發(fā)酵液對瓜列當種子萌發(fā)有較好的抑制效果。

2.3 菌株JTF001對番茄植株的安全性

由圖2可知，噴灑茄鏈格孢A.solani孢子懸浮液后，番茄葉片有明顯圓形和不規(guī)則形病斑，病斑及葉片邊緣有明顯黃色暈圈;而對照組和噴灑菌株JTF001孢子懸浮液對番茄植株生長未造成影響，說明菌株JTF001對番茄植株生長安全。

2.4 菌株JTF001固體發(fā)酵產物萃取物對瓜列當種子萌發(fā)的抑制作用

發(fā)酵產物萃取液濃度為5 μg/mL和1 μg/mL時對瓜列當種子萌發(fā)的抑制率均為100%;濃度為0.5、0.25 μg/mL和0.1 μg/mL時對瓜列當種子萌發(fā)抑制率分別91.03%、81.87%和60.04%（表4）。從圖3可以看出，1 μg/mL處理組的瓜列當種子沒有萌發(fā)，0.1 μg/mL處理組的瓜列當種子芽管明顯縮短，對照組的種子芽管表面光滑，呈透明或半透明狀，萌發(fā)正常。

2.5 生防菌株形態(tài)學和分子生物學鑒定結果

形態(tài)學鑒定：菌株JTF001在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)7 d，菌落呈圓形，1～3 d時菌落為白色，3 d后顏色逐漸變?yōu)榛揖G色或褐色，外圍新生菌絲為白色，菌落呈白色與墨綠色的同心輪紋狀，菌落背面為灰白色;菌株JTF001在PCA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)7 d，菌落初期為白色，后期中間逐漸變青褐色，菌絲發(fā)達;菌株JTF001在水瓊脂培養(yǎng)基上菌落初期為褐色，后期皿中分布大量孢子，菌絲不發(fā)達。分生孢子倒棍棒形，卵形，倒梨形或近橢圓形，表面光滑，具3～6個橫隔膜，1～3個縱、斜膈膜，分隔處不縊縮或略縊縮，孢子大?。?2.59～40.26） μm×（7.39～14.01） μm。短喙柱狀，淡褐色，（8.02～20.12） μm×（2.56～4.78） μm。其在不同培養(yǎng)基上的產孢結果顯示，菌株JTF001在PDA和PCA培養(yǎng)基上產孢量小;在水瓊脂培養(yǎng)基上產孢量極大（圖4），初步鑒定其為鏈格孢屬Alternaria spp.真菌。

分子生物學鑒定：以菌株JTF001的基因組DNA為模板進行保守基因序列擴增及測序，運用真菌通用引物 ITS1 和 ITS4、RPB2-5F和fRPB2-7CR、EF1-728F和EF1-986R、GPD1 和 GPD2進行PCR反應分別獲得 555、967、242 bp和589 bp的片段，將菌株的擴增序列與GenBank中序列進行同源性比較分析，ITS序列同源性比對結果顯示，菌株JTF001與鏈格孢Alternaria spp.的一致性較高;rpb 2序列同源性比對結果顯示，菌株JTF001與交鏈格孢Alternaria alternata（登錄號：MK605898.1、XM-018535098.1、DQ677980.1）的一致性達99%;tef 1序列同源性比對結果顯示，菌株JTF001與交鏈格孢（登錄號：KU145273.1）的一致性達98%;gapdh序列同源性比對結果顯示，菌株JTF001與交鏈格孢（登錄號：MG674227.1、MK451976.1、LT707620.1）的一致性達98%。利用軟件MEGA 5中鄰接法構建聚類分析樹狀圖，菌株JTF001和交鏈格孢均聚為同一分支（圖5、圖6、圖7），結合形態(tài)學鑒定結果，將菌株JTF001鑒定為交鏈格孢Alternaria alternata。

3 討論

瓜列當種子萌發(fā)后便形成吸器，吸附在寄主根部，通過吸收寄主的營養(yǎng)物質來維持自己的生長，因此，通過抑制瓜列當種子萌發(fā)，避免瓜列當與寄主建立寄生關系，是降低瓜列當對寄主造成傷害的有效途徑。真菌中含有多種對瓜列當生長具有抑制作用的種類，王亞嬌等[12]從感病的列當中分離出尖孢鐮刀菌F.oxysporum Br-2，其發(fā)酵上清液對彎管列當O.cernua種子萌芽抑制率為71.79%;陳杰等[13]研究發(fā)現(xiàn)灰黃青霉Penicillium griseofulvum菌株CF3發(fā)酵液原液、10倍和100倍稀釋液處理后瓜列當發(fā)芽管長度與對照相比分別縮短 100.00%、68.84%和 19.24%。本研究從患病的瓜列當莖基部分離到內生真菌JTF001，培養(yǎng)皿試驗結果表明，菌株無菌發(fā)酵液原液、25倍稀釋液和50倍稀釋液抑制了瓜列當的種子萌發(fā)及萌發(fā)后瓜列當發(fā)芽管的生長。通過盆栽試驗接種JTF001發(fā)酵液，瓜列當植株接種處有明顯的縊縮現(xiàn)象，植株變褐色，嚴重時可使整株萎蔫死亡。

鏈格孢屬真菌物種之間的相似度極高，僅憑形態(tài)學特征很難進行種類鑒定，因此，增加基因進化關系作為分類依據非常有必要。Somma等[14]基于翻譯延長因子基因、β-微管蛋白基因、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因和過敏原基因構建多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹，對引起小麥黑斑病的164個鏈格孢菌菌株進行了鑒定，明確了菌株的種類及其進化關系。王彩霞等[15]基于 ITS，Alt-a1 和 gpd 序列構建系統(tǒng)進化樹將引起葡萄葉斑病的鏈格孢鑒定為3個種。本研究采用形態(tài)學觀察并結合ITS、rpb2、tef 1和gapdh基因標記技術對從患病瓜列當上分離的內生真菌JTF001進行鑒定，將菌株JTF001鑒定為交鏈格孢Alternaria alternata。

近年來，關于利用微生物的次生代謝產物開發(fā)除草劑的研究受到廣泛的關注，并且許多研究證明，雜草?；虏【a生的毒素有較好的除草劑開發(fā)潛力[16]。Zhou等[17]發(fā)現(xiàn)細交鏈孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）是防治棉田、煙田等重要雜草的一種生物除草劑。姜述君等[18]發(fā)現(xiàn)狹卵鏈格孢A. augustiovoidea產生的毒素對稗草的種子萌發(fā)和幼苗生長都有較強的抑制作用，在100 mg/L濃度下對稗草種子萌發(fā)和幼苗生長抑制率分別達100%和76%。本研究中交鏈格孢JTF001發(fā)酵產物萃取物在1 μg/mL濃度下對瓜列當種子萌發(fā)抑制率達100%。目前關于鏈格孢菌防治瓜列當的報道較少，下一步將繼續(xù)研究鏈格孢菌毒素對瓜列當的生防機制，有望開發(fā)為瓜列當的生防除草劑。

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（責任編輯：楊明麗）