何明揚(yáng)，楊 洋，陳智勇

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

金銀花又名忍冬（Lonicera Japonica），其根、莖、葉、花、果實(shí)均可入藥，自古被譽(yù)為清熱解毒的良藥，用于治療身熱、發(fā)疹、發(fā)斑、熱毒瘡癰、咽喉腫痛等熱病[1]。忍冬屬植物還在綠化觀賞、營(yíng)養(yǎng)保健、日用化工、保持水土及畜牧獸醫(yī)等領(lǐng)域具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2-3]。

金銀花中含有黃酮等多種化合物[4]，是藥用植物資源中含天然黃酮類化合物最多的植物之一[5]。黃酮類化合物具有抗老化、抗突變、調(diào)血脂、降血壓等功能，是一類具有極大開發(fā)前景的天然有機(jī)抗氧化劑[6]。黃酮還可以抑制炎性生物酶的滲出，促進(jìn)傷口愈合并止痛[7]。金銀花莖葉與花的藥性相同，近年來利用金銀花莖葉提取黃酮的研究也慢慢增多[8]。筆者通過測(cè)定金銀花愈傷組織和再生植株莖葉中的總黃酮含量，并與其外植體野生型金銀花莖葉總黃酮含量進(jìn)行對(duì)比，得到金銀花組織快速繁殖階段中不同材料總黃酮含量的變化。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 金銀花品種 參試金銀花品種為長(zhǎng)沙金銀花野生種，采自瀏陽大圍山地區(qū)。取金銀花幼葉進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，取金銀花快繁過程中外植體莖葉、愈傷組織及再生植株莖葉進(jìn)行總黃酮的測(cè)定。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 電子天平、紫外可見分光光度計(jì)、烘干機(jī)、粉碎機(jī)、恒溫水浴鍋、超聲波清洗器等。

1.1.3 主要試劑 80%乙醇溶液、5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液、4%氫氧化鈉溶液等。

1.1.4 基本培養(yǎng)基 MS 培養(yǎng)基[9]，蔗糖3%，瓊脂0.7%，pH 值5.8（滅菌前），高壓蒸汽滅菌（121℃，101 kPa，20 min）。其中生根培養(yǎng)基使用1/2MS 培養(yǎng)基并通過分別添加NAA（萘乙酸）、6-BA（6-芐基腺嘌呤）、2,4-D（2, 4-二氯苯氧乙酸）等不同植物激素來調(diào)控植物生長(zhǎng)[10-13]。

1.1.5 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)溫度為25℃，光照2 500 Lx，每天照射12 h。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 金銀花愈傷組織的誘導(dǎo) 取金銀花的幼葉浸泡在吐溫80 中2 min 后用自來水反復(fù)沖洗干凈。然后放置于滅過菌的三角瓶中，用75%的酒精浸泡15 s，用0.1% HgCl2浸泡8 min，再用無菌水反復(fù)沖洗3～4 次，用滅菌過的解剖刀將葉片切成0.5～1.0 cm2大小的外植體接種于編號(hào)1～5 號(hào)，2,4-D 含量分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L 的MS 培養(yǎng)基上。每瓶3 個(gè)外植體，每個(gè)處理接種10 瓶，15 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.2 不定芽的誘導(dǎo) 在超凈無菌工作臺(tái)中，取生長(zhǎng)良好且長(zhǎng)勢(shì)一致的愈傷組織放無菌紙上，用滅過菌的解剖刀將其切割成適當(dāng)大小后接種至編號(hào)1～16 號(hào)，6-BA（mg/L）和NAA（mg/L）激素配比分別為0.5 ∶0.01、0.5 ∶0.05、0.5 ∶0.10、0.5 ∶0.50、1.0 ∶0.01、1.0 ∶0.05、1.0 ∶0.10、1.0 ∶0.50、1.5 ∶0.01、1.5 ∶0.05、1.5 ∶0.10、1.5 ∶0.50、2.0 ∶0.01、2.0 ∶0.05、2.0 ∶0.10、2.0 ∶0.50的MS 標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基上。每瓶接種3 塊愈傷組織，每個(gè)處理接種10 瓶。20 d 后觀察并統(tǒng)計(jì)不定芽的誘導(dǎo)和分化情況，約30 d 繼代一次。

1.2.3 不定芽的擴(kuò)繁 取生長(zhǎng)良好且長(zhǎng)勢(shì)一致的不定芽，切割成大小和數(shù)目都相同的不定芽叢（下端帶有愈傷組織）后接種至編號(hào)1～9 號(hào)，6-BA（mg/L）和NAA（mg/L）激素配比分別為1.0 ∶0.01、1.0 ∶0.05、1.0 ∶0.10、1.5 ∶0.01、1.5 ∶0.05、1.5 ∶0.10、2.0 ∶0.01、2.0 ∶0.05、2.0 ∶0.10 的MS 標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基上。每瓶接種3個(gè)，20 d 后觀察并統(tǒng)計(jì)不定芽的擴(kuò)繁和生長(zhǎng)情況，約30 d 繼代一次。

1.2.4 生根培養(yǎng)及煉苗移栽 在超凈無菌工作臺(tái)中，將生長(zhǎng)至3～5 cm 的不定芽自基部切下，接種至編號(hào)1～7 號(hào)，NAA 含量分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L 的1/2MS 標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基上，每瓶3 株。每個(gè)處理接種10 瓶，20 d 后觀察并統(tǒng)計(jì)生根的情況，30 d 繼代一次。在不定芽生根培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d并長(zhǎng)出根以后，將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到煉苗室中培養(yǎng)2 d，然后移栽到營(yíng)養(yǎng)土（泥炭土 ∶ 珍珠巖=3 ∶1）中，25℃下培養(yǎng)，定期澆水，20 d 后觀察并統(tǒng)計(jì)幼苗成活率。

1.2.5 總黃酮含量測(cè)定 根據(jù)王晉[14]的方法，通過蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液在510 nm 處測(cè)得的吸光度（Y）對(duì)濃度（X）進(jìn)行回歸，得到回歸方程Y=1.2614X-0.0261，以此進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定。對(duì)照組為試劑空白溶液，在510 nm 波長(zhǎng)下讀取吸光值A(chǔ)?？傸S酮含量計(jì)算公式如下。

W=[（Y+0.026 1）×50/（1.261 4×M）]×100%

公式中，Y表示吸光度；M表示金銀花樣品重量（mg）；W表示金銀花中總黃酮含量；50 為稀釋倍數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Exsel 軟件統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度2, 4-D 對(duì)金銀花愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表1 中可以看出，金銀花外植體在不同2,4-D濃度下誘導(dǎo)愈傷的生長(zhǎng)狀況和誘導(dǎo)率均有較明顯的差別。在低于3.0 mg/L 濃度時(shí)愈傷組織顏色偏黃，而在4.0 mg/L 及以上濃度誘導(dǎo)的愈傷組織顏色較綠，濃度在3.0～4.0 mg/L 時(shí)愈傷誘導(dǎo)率較高，生長(zhǎng)狀況好。其中，當(dāng)濃度為4.0 mg/L 時(shí)愈傷誘導(dǎo)率最高，且顏色較綠，為金銀花誘導(dǎo)愈傷組織的最佳濃度。

表1 不同濃度2,4-D 處理金銀花外植體愈傷組織的誘導(dǎo)情況

2.2 不同激素配比對(duì)金銀花不定芽誘導(dǎo)的影響

從表2 中可得，隨著6-BA 濃度的升高，不定芽的誘導(dǎo)率先上升再下降；隨著NAA 濃度的升高，不定芽的誘導(dǎo)率有所下降。

表2 不同6-BA 和NAA 含量配比處理金銀花不定芽的誘導(dǎo)情況

試驗(yàn)顯示6 號(hào)和7 號(hào)培養(yǎng)基配方的不定芽誘導(dǎo)率較高，且不定芽粗壯高大，顏色較綠，尤其是7 號(hào)，故6-BA 1.0 mg/L 及NAA 0.10 mg/L 為較理想的不定芽誘導(dǎo)激素配比。

2.3 不同激素配比對(duì)金銀花不定芽增殖的影響

從表3 可以看出，隨著6-BA 濃度的逐漸升高，誘導(dǎo)擴(kuò)繁率整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)6-BA 濃度為1.5 mg/L 時(shí)，不定芽增殖效率達(dá)到最大，之后出現(xiàn)下降趨勢(shì)。隨著NAA 濃度的緩慢升高，不定芽的增殖效率先是呈上升趨勢(shì)，當(dāng)NAA 濃度超過0.05 mg/L 后，不定芽增殖率明顯下降。

由研究結(jié)果可知，1 號(hào)、4 號(hào)、5 號(hào)和8 號(hào)培養(yǎng)基的不定芽增殖率較高，都達(dá)到60%以上。其中5號(hào)培養(yǎng)基的平均增殖率最高，達(dá)到79.33%，且不定芽粗壯高大。因此，較理想的不定芽增殖激素配比為6-BA 1.5 mg/L 和NAA 0.05 mg/L。

2.4 不同濃度NAA 對(duì)金銀花不定芽生根的影響

從表4 中可得，隨著NAA 濃度的逐漸升高，不定芽的生根率逐漸升高，且隨著NAA 濃度的升高，根生長(zhǎng)變粗壯。但當(dāng)NAA 濃度超過2.0 mg/L 后，生根率下降。因此，1/2MS+NAA 2.0 mg/L 為最適不定芽生根培養(yǎng)基。

表4 不同濃度NAA 處理金銀花不定芽的生根及成活情況

2.5 不同材料總黃酮含量的測(cè)定

通過紫外分光光度計(jì)法，測(cè)得非組培外植體莖葉、愈傷組織和再生植株莖葉提取液的總黃酮含量分別為2.456%、2.642%和1.81%，愈傷組織中的黃酮含量最高，外植體莖葉中黃酮的含量次之，再生植株中黃酮的含量最低，且與二者的差異顯著。

3 討 論

3.1 外植體的選擇和處理

不同種植物及同一植物不同器官對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的條件是不相同的。試驗(yàn)中選用幼嫩的葉片為最適合的外植體。對(duì)于外植體的滅菌，用吐溫80 進(jìn)行預(yù)處理，可以增加消毒劑對(duì)葉片的滲透作用。結(jié)合75% 乙醇和0.01% HgCl2處理，可以達(dá)到最佳的滅菌效果[15]。

3.2 培養(yǎng)基的選擇以及激素的配比

試驗(yàn)以MS 為基本培養(yǎng)基[16]，在以6-BA 和NAA 為激素進(jìn)行濃度組合誘導(dǎo)不定芽的試驗(yàn)中，細(xì)胞分裂素6-BA 濃度在1.0 mg/L 左右時(shí)可以很好促進(jìn)金銀花不定芽的增殖，超過2.0 mg/L 后，濃度越高，植株生長(zhǎng)越差。NAA 是植物生長(zhǎng)素，當(dāng)培養(yǎng)基中加入約0.10 mg/L 的NAA 時(shí)，金銀花不定芽增殖效果最好，長(zhǎng)勢(shì)良好，但當(dāng)濃度大于0.10 mg/L 后，濃度越高，側(cè)芽增殖越慢，并且隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，極易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，并最終枯萎死亡。

3.3 生根誘導(dǎo)及再生植株移栽

多項(xiàng)資料顯示，金銀花的生根比較容易，加入適量濃度的NAA 后，極易長(zhǎng)出不定根，但濃度不宜太大，此試驗(yàn)以1/2MS+NAA 2.0 mg/L 為理想的生根培養(yǎng)基配方。同時(shí)，糖的濃度對(duì)根誘導(dǎo)影響較大，濃度過低時(shí)，生長(zhǎng)緩慢；濃度過高時(shí)，又有大量誘導(dǎo)愈傷組織形成，不利于根的形成[17]，所以此試驗(yàn)采用1.5%的蔗糖。

將生根的再生植株移栽種植，影響移栽成活率的主要原因是不定芽與根之間長(zhǎng)出了愈傷組織，即莖的維管組織和根的維管組織中間有無定形愈傷組織，造成莖和根的維管組織不能正常連接，根吸收的水分和養(yǎng)料不能送到地上部分的枝葉，葉片光合作用生成的有機(jī)物也不能運(yùn)送給根，從而造成植物枯萎，最終死亡。

3.4 金銀花總黃酮含量的測(cè)定

金銀花花期為4—6 月，雖然金銀花花中的總黃酮含量比莖葉中的稍多，但是金銀花一年才開花1 次，花期短，因此從金銀花莖葉中提取黃酮化合物不失為一個(gè)持續(xù)獲取黃酮的方法。紫外可見分光光度計(jì)法檢測(cè)表明，愈傷組織中的總黃酮含量最高，其次是外植體莖葉，再生植株莖葉中含量最低。由此可見，通過愈傷組織的大量增殖和大型培養(yǎng)罐等收集代謝次生物，可以很大程度提高金銀花黃酮類化合物的生物產(chǎn)量。鑒于此結(jié)果，可以將金銀花快速繁殖和天然黃酮化合物提取結(jié)合起來，利用金銀花離體培養(yǎng)來獲得大量的愈傷組織，再?gòu)闹刑崛∷杼烊稽S酮。