陳兆貴，張荃鋒，盧曉琪，鄭希綿

（惠州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 惠州 516007）

馬鈴薯是第四大糧食作物，中國(guó)是全球最大的馬鈴薯生產(chǎn)國(guó)，在保證國(guó)家糧食安全方面具有重要的意義。惠州市作為我國(guó)冬種馬鈴薯的主要生產(chǎn)基地，由于種植的品種較為單一，在生產(chǎn)上存在較大的風(fēng)險(xiǎn)，有必要進(jìn)一步擴(kuò)大引種的品種資源[1]。

ISSR（Inter-Simple Sequence Repeats 簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間）是由Zietkiewicz[2]等基于SSR 技術(shù)發(fā)展起來的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)，具有重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)資源鑒定領(lǐng)域以及不同品種植物的遺傳多樣性分析[3-6]，在馬鈴薯種質(zhì)資源鑒定上也有應(yīng)用[7-8]。

利用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)惠州冬種馬鈴薯生產(chǎn)基地引種的36 份來源不同的馬鈴薯種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，為惠州地區(qū)冬種馬鈴薯引種提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為引進(jìn)的冬種馬鈴薯品種，共36 個(gè)（見表1），由惠州市惠東縣油麻地馬鈴薯種植基地提供。在馬鈴薯生長(zhǎng)中后期，每個(gè)品種取2～3 片葉，放到-80℃冰箱保存。

表1 用于ISSR-PCR 分析的馬鈴薯材料

1.2 馬鈴薯DNA 提取

采用艾科瑞生物工程有限公司植物DNA 提取試劑盒提取馬鈴薯葉片DNA，用超微量核酸蛋白測(cè)定儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的濃度和純度，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 多態(tài)性引物篩選和擴(kuò)增

引物由湖南艾科瑞生物工程有限公司合成，以提取的2 號(hào)和3 號(hào)2 個(gè)馬鈴薯品種DNA 為模板，篩選出選9 條引物，按優(yōu)化好的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.1 PCR 反應(yīng)體系 反應(yīng)體系：12.5 μL Taq 預(yù)混液，10.5 μL RNase-free 水，1 μL 引物，1 μL DNA 模板，共25 μL。

1.3.2 PCR 反應(yīng)條件 PCR 反應(yīng)條件參考何海旺等[1]的方法，94℃預(yù)變性7 min；94℃變性45 s，55℃復(fù)性45 s，72℃延伸2 min，35 次循環(huán)；72℃延伸10 min，12℃保溫。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過ISSR-PCR 擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖，進(jìn)行人工讀帶，以DL 8 000 DNA Maker 作為標(biāo)準(zhǔn)分子量，引物對(duì)每個(gè)條帶擴(kuò)增的位點(diǎn)為基礎(chǔ)，記錄引物的擴(kuò)增位點(diǎn)，有條帶的記作“1”，沒有條帶的記作“0”。對(duì)每張電泳結(jié)果圖進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，將數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)成0 和1 矩陣。后續(xù)將利用NTSYS-pc 2.10 e 分析軟件對(duì)矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并制成系統(tǒng)聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 總DNA 質(zhì)量分析

用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA，結(jié)果表明，所提取的DNA 質(zhì)量較好，總DNA 條帶清晰、均勻，無DNA 大量降解現(xiàn)象。經(jīng)微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，OD260/OD280比值均在1.8 左右，說明提取的 DNA 純度較高，符合PCR 擴(kuò)增的要求。

2.2 ISSR 引物篩選和擴(kuò)增

以2 號(hào)、3 號(hào)馬鈴薯DNA 模板，對(duì)所有引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增電泳（圖1），從15 個(gè)引物中篩選出9 個(gè)條帶比較清晰、數(shù)量比較多的引物。

圖1 15 種引物篩選結(jié)果

從表2 可知，用篩選出的9 個(gè)引物對(duì)36 份馬鈴薯品種進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，共得到81 條清晰的條帶，平均每個(gè)引物可擴(kuò)增出9 條條帶。這些條帶位于100～3 000 bp 范圍內(nèi)，其中多態(tài)性條帶有65 條，平均每個(gè)引物可以擴(kuò)增出7.22 條多態(tài)性條帶，平均多態(tài)性條帶比率達(dá)80.25%（引物ISSR 6、ISSR 14 引物擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果見圖2、圖3）。表明ISSR 技術(shù)可以有效展示各個(gè)馬鈴薯材料之間的多態(tài)性。

圖2 引物ISSR6 擴(kuò)增結(jié)果圖

圖3 引物ISSR14 擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果圖

表2 ISSR 引物的擴(kuò)增情況與多態(tài)性條帶比率

2.3 各馬鈴薯材料之間的多態(tài)性分析

采用NTSYS-pc 2.10 e 軟件分析36 個(gè)馬鈴薯品種遺傳相似系數(shù)，并構(gòu)建聚類樹狀圖（圖4），36 個(gè)馬鈴薯品種之間的遺傳相似系數(shù)為0.78～0.91。其中遺傳相似性最高的是華渝5（28 號(hào)）和黑金剛（29 號(hào)），遺傳相似系數(shù)為0.91，說明這2 個(gè)馬鈴薯品種親緣關(guān)系較為接近。

圖4 36 種馬鈴薯的聚類樹狀圖

以遺傳相似系數(shù)0.80 為閾值可以把36 種馬鈴薯材料分為4 大類。第一大類有2 個(gè)品種，分別是云薯306（4 號(hào)）和云薯608（9 號(hào)）；第二大類有4 個(gè)品種，包括中薯28（22 號(hào)）、中薯紅1 號(hào)（23 號(hào)）等品種，第二大類又可分為2 個(gè)亞類；第三大類有5 個(gè)品種，包括粵農(nóng)薯6 號(hào)（7 號(hào)）、隴10（30 號(hào)）等品種，其中可分為2 個(gè)亞類；余下的25 個(gè)品種聚為第四大類，第四大類在遺傳相似系數(shù)0.81 處可分為2 個(gè)大亞類。

3 討 論

一直以來，我國(guó)多是使用傳統(tǒng)育種方法來進(jìn)行作物育種，通過對(duì)親本的性狀和生化指標(biāo)來進(jìn)行分類鑒定，再通過優(yōu)良的親本來進(jìn)行雜交育種，雖然這些方法簡(jiǎn)單，也可培育出產(chǎn)量高、抗性好的優(yōu)良品種，但是也有難以改善的缺點(diǎn)，如花費(fèi)大量時(shí)間、人力、物力和精力來進(jìn)行分類，培養(yǎng)過程中也容易受到環(huán)境的影響。ISSR 分子標(biāo)記是基于PCR 技術(shù)發(fā)展起來的一種DNA 多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)[9]。與傳統(tǒng)的分類鑒定等方法相比較，ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)不易受環(huán)境因素影響，且可以快速而準(zhǔn)確地鑒別親本間的親緣關(guān)系，讓育種工作變得更加簡(jiǎn)便快捷，因此被廣泛應(yīng)用在動(dòng)植物的品種鑒定、遺傳多樣性檢測(cè)等研究領(lǐng)域中[10-13]。馬鈴薯屬于多倍體作物，育種可能性較之其他作物更加多樣，但是也容易發(fā)生變異，這樣也就造成馬鈴薯依據(jù)傳統(tǒng)育種方法（通過親本的性狀）來進(jìn)行分類鑒會(huì)存在偏差。ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)較于其他的分子標(biāo)記技術(shù)，可以無需知道任何靶序列的SSR 背景信息，且ISSR 標(biāo)記通過使用比RAPD 引物更長(zhǎng)的引物，克服了RAPD 標(biāo)記穩(wěn)定性和重復(fù)性差的缺點(diǎn)，具有操作性好、遺傳多態(tài)性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可以在短時(shí)間內(nèi)構(gòu)建作物的基因指紋圖譜[14]。

利用9 個(gè)ISSR 引物從36 份馬鈴薯樣品中得到81條清晰的條帶，其中多態(tài)性條帶有65 條，多態(tài)性條帶比率達(dá)80.25%。與趙永秀等[15]的多態(tài)性條帶比率（93.38%）結(jié)果相差較遠(yuǎn)，說明引進(jìn)的36 個(gè)馬鈴薯品種物種水平上遺傳多樣性豐富度一般。聚類分析結(jié)果表明，36 個(gè)馬鈴薯品種遺傳變異程度較為一般，部分品種間遺傳相似系數(shù)接近于1、親緣關(guān)系較為接近，并且呈現(xiàn)出地域差異小的情況。該研究結(jié)果可為這36個(gè)馬鈴薯品種在以后的雜交育種中親本選配提供依據(jù)，并為進(jìn)一步研究馬鈴薯種質(zhì)鑒定分類提供參考。