李 輝，龔 輝，唐映紅，程新奇

（1.湖南文理學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 常德 415000；2，湖南省棉花科學(xué)研究所，湖南 常德 415000）

近年來(lái)，隨著中國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展，居民生活水平不斷提高，高血壓、糖尿病等很多慢性疾病的患者人數(shù)日益增多，這些慢性疾病已經(jīng)嚴(yán)重威脅到了人們的身體健康。研究表明富含抗性淀粉的食物對(duì)這些疾病具有很好的預(yù)防效果[1-2]?？剐缘矸郏≧esistant Starch,簡(jiǎn)稱RS）是指在健康人體的小腸中不能被消化吸收，但在大腸中能夠被益生菌發(fā)酵分解的淀粉[3-4]。食用抗性淀粉可以增加飽腹感、降低動(dòng)物血清總膽固醇濃度、降低餐后血糖水平、對(duì)于非胰島素依賴型糖尿病和心血管疾病等具有輔助治療作用[5-6]。同時(shí)，抗性淀粉還具有減少腸機(jī)能失調(diào)及結(jié)腸癌發(fā)病率、提供能量以及防止脂肪堆積等重要生理功能[7-8]。稻米成分主要包含支鏈淀粉、直連淀粉和抗性淀粉，多數(shù)水稻品種的抗性淀粉含量在1%左右，只有少數(shù)接近3%[9]。因此，選育富含抗性淀粉的水稻品種對(duì)保持人類健康具有重要意義。

稻米淀粉的形成是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過(guò)程，需要一系列酶的共同催化，催化淀粉合成的酶主要包括腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP glucose pyrophosphorylase，AGP）、淀粉合成酶（Starch synthase，SS）、淀粉分支酶（Starch branching enzyme，SBE）和淀粉脫支酶（Starch debranching enzyme，DBE）。葡萄糖焦磷酸化酶是催化淀粉合成的第一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控步驟。淀粉合成酶的功能是將葡萄糖殘基加到引物的非還原端延長(zhǎng)葡聚糖的線性糖鏈。淀粉合成酶有顆粒結(jié)合型淀粉合成酶（GBSS，包括GBSSI 和GBSSII）和可溶性淀粉合成酶（SSS）。GBSS 主要生物學(xué)功能是延長(zhǎng)葡聚糖鏈，形成高聚合度的直鏈淀粉[10]。GBSSI 由Wx基因編碼，Wx基因突變體胚乳總淀粉含量變化不明顯，但是直鏈淀粉含量顯著減少甚至完全缺失[11-13]。SSS 有4 種同工酶，負(fù)責(zé)支鏈淀粉的生物合成，催化較低葡萄糖基聚合度的短直鏈淀粉。

淀粉分支酶（SBE）催化α-1-4 糖苷鍵的斷裂，同時(shí)將斷裂的低聚糖鏈與α-1-6 糖苷鍵形成新的分支。SBE 由SBE1、SBEII 組成。SBEI 主要產(chǎn)生DP大于16 的長(zhǎng)鏈淀粉，而SBEII 主要產(chǎn)生DP 小于12的短鏈淀粉。在單子葉植物中SBEII 存在兩種異構(gòu)體SBEIIa 和SBEIIb。SBEIIa 在植物的所有組織中都有表達(dá)，而SBEIIb 在胚乳中特異性表達(dá)。降低與支鏈淀粉合成相關(guān)基因SBEIIb 的表達(dá)可以增加玉米、小麥胚乳中直鏈淀粉的含量[14-15]。劉素君等研究表明直鏈淀粉的含量與抗性淀粉的含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系[16-18]。通過(guò)RNA 干擾技術(shù)抑制水稻中淀粉分支酶SBE1 和SBEII 基因的表達(dá)，使得轉(zhuǎn)基因水稻直鏈淀粉的含量從27.2%提高到64.8%，同時(shí)抗性淀粉的含量從0 提高到了14.6%[19]。通過(guò)基因編輯的方法抑制OsSBEIIb基因在水稻灌漿期的表達(dá)量，降低支鏈淀粉的含量，使得直鏈淀粉的含量從19.6%提高到27.4%，促使抗性淀粉的含量從0.2%提高到17.2%[10]?？梢?，水稻淀粉分支酶OsSBEIIb基因的表達(dá)與水稻抗性淀粉的含量密切相關(guān)。

研究以湘早秈稻2 號(hào)為試驗(yàn)材料，克隆了OsSBEIIb基因的編碼序列，并分析了其時(shí)空表達(dá)特征以及OsSBEIIb基因在不同水稻品種中的變異情況，以期為抗性淀粉水稻育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 水稻材料的種植

試驗(yàn)共35 個(gè)水稻品種（見表1），由湖南省水稻研究所種質(zhì)資源研究室提供。挑選籽粒飽滿，大小均勻的種子，于2020 年3 月下旬播種于湖南文理學(xué)院生物園，當(dāng)秧苗長(zhǎng)到3 葉一心時(shí)移栽到肥力中等的水稻田。移栽后按正常的大田管理措施進(jìn)行管理，及時(shí)清除雜草并進(jìn)行病蟲害的防治。在水稻灌漿時(shí)期分別選取正在灌漿的稻穗，液氮速凍后帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

表1 試驗(yàn)所用水稻品種

1.2 水稻OsSBEIIb 基因cDNA 的克隆和測(cè)序

以湘早秈2 號(hào)灌漿期的水稻胚乳為試驗(yàn)材料，利用RNA 提取試劑盒DP452 提取總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 作為基因克隆的模板。根據(jù)NCBI 網(wǎng)站公布的OsSBEIIb基因序列（LOC4329532），利用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)OsSBEIIb基因編碼序列克隆引物（表2）。PCR 反應(yīng)體系：ApexHF HS DNA Polymerase CL（1 U/μL）1 μL，2×ApexHF CL Buffer 25 μL；cDNA 模板2 μL；上游引物1 μL；下游引物1 μL；最后用超純水補(bǔ)足50 μL。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性1 min；98℃ 10s；55℃ 16s；68℃ 1 min，共32 個(gè)循環(huán)。取10 μLPCR 產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。然后將PCR 產(chǎn)物切膠、回收，連接T 載體并轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性菌落送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.3 水稻OsSBEIIb 基因的生物信息學(xué)分析

利用在線工具（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析OsSBEIIb基因的編碼序列；利用在線 程 序（http：//www.expasy.ch/tools/pi_tool.html） 對(duì)OsSBEIIb 蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用在線工具NCBI-CDD 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)OsSBEIIb 蛋白質(zhì)的保守功能域；利用NCBI-BLASTP 序列比對(duì)功能對(duì)OsSBEIIb 的氨基酸序列進(jìn)行在線序列比對(duì)；DNAMAN 軟件用于氨基酸序列一致性的比對(duì)；MEGA6.0 軟件用于該基因系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.4 水稻OsSBEIIb 基因的時(shí)空表達(dá)特征分析

在大田水稻長(zhǎng)到始穗期時(shí)開始取樣根、莖、葉、稻穗，此時(shí)的稻穗還沒有開始灌漿，然后每隔一周取稻穗，并將穎殼和稻粒剝開分離，分別提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 并作為qRT-PCR 反應(yīng)的模板，qRTPCR 反應(yīng)的引物見表2。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系：QPCR mix 10 μL，模板2 μL，上下游引物各0.8μL，用超純水補(bǔ)足20 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2 min，95 ℃，15 s；60℃，30 s；共40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3 個(gè)技術(shù)重復(fù)。

表2 引物名稱及其序列

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻OsSBEIIb 基因的克隆及測(cè)序分析

以湘早秈2 號(hào)胚乳總RNA 反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1 所示。從電泳圖可以看出，有一條清晰的單一條帶，對(duì)其切膠回收并送北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行sanger 測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明基因編碼序列全長(zhǎng)2 478 bp，符合電泳結(jié)果。

圖1 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.2 水稻OsSBEIIb 基因的生物信息學(xué)分析

OsSBEIIb基因的編碼序列全長(zhǎng)2 478 bp，編碼一個(gè)含有825 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)（圖2），該蛋白的理論分子量為92.85 kD，等電點(diǎn)為5.69。在線工具NCBICDD 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，OsSBEIIb蛋白的保守功能結(jié)構(gòu)域位于69～825 bp 之間，屬于1,4-α-淀粉分支酶。

圖2 水稻OsSBEIIb 基因的核苷酸和編碼的氨基酸序列

在線工具NCBI-BLASTP 對(duì)OsSBEIIb的氨基酸序列進(jìn)行在線序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與粳稻（Oryza sativa JaponicaGroup）、玉 米（Zea mays）、谷 子（Setaria italica）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、高粱（Sorghum bicolor）、黍（Panicum miliaceum）、野生二粒小麥（Triticum dicoccoides）氨基酸序列的相似性分別為99.88%、85.73%、82.54%、81.53%、81.52%、80.96%、80.36%。這些植物的SBEIIb 氨基酸序列多序列比對(duì)（圖3）分析發(fā)現(xiàn)，湘早秈2 號(hào)OsSBEIIb 的氨基酸序列與其他植物SBEIIb 的氨基酸序列一致性為85.96%，表明湘早秈2 號(hào)水稻OsSBEIIb 的氨基酸序列總體上是保守的，能夠形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，行使相似的生物學(xué)功能。

圖3 OsSBEIIb 氨基酸序列多序列比對(duì)

利用MEGA6.0 軟件構(gòu)建OsSBEIIb基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）發(fā)現(xiàn)秈早稻2 號(hào)與粳稻的親緣關(guān)系最近，與野生二粒小麥的關(guān)系最遠(yuǎn)。這主要原因是秈早稻2 號(hào)與粳稻同屬于禾本科稻屬植物。

圖4 水稻OsSBEIIb 與其他植物SBEIIb 的系統(tǒng)進(jìn)化樹

不同顏色氨基酸殘基代表不同的一致性。藍(lán)色：氨基酸一致性為100%; 粉紅色、青色、黃色分別表示氨基酸的一致性為75%以上、50%以上及33%以上;無(wú)顏色標(biāo)識(shí)的氨基酸一致性不足33%。

2.3 水稻OsSBEIIb 基因的時(shí)空表達(dá)特征分析

2.3.1 水稻OsSBEIIb基因在不同器官的表達(dá)特征分別提取水稻根、莖、葉、稻殼和胚乳的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 并作為RT-PCR 的模板。由圖5 可知，OsSBEIIb基因在根、莖、葉、稻殼和米粒中都有表達(dá)，但是其在米粒中的表達(dá)量遠(yuǎn)大于其在根、莖、葉和稻殼中的表達(dá)量，且差異極顯著（P＜0.01）。

圖5 OsSBEIIb 基因在水稻不同器官的表達(dá)

2.3.2OsSBEIIb基因在不同生育期稻殼的表達(dá)特征分別提取不同時(shí)期稻殼總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA并作為RT-PCR 的模板。由圖6 可知，OsSBEIIb基因隨著水稻的逐漸成熟，OsSBEIIb基因在稻殼的表達(dá)量呈現(xiàn)出了先升高在降低的趨勢(shì)，但沒有顯著差異。這種變化趨勢(shì)的出現(xiàn)可能是剝離的稻殼中有殘留的稻米組織，從而引起了該基因表達(dá)量的變化。

圖6 OsSBEIIb 基因在不同時(shí)期稻殼的表達(dá)

2.3.3OsSBEIIb基因在水稻不同生育期胚乳的表達(dá)特征 分別提取不同時(shí)期稻米的總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA 并作為RT-PCR 的模板。由圖7 可知，隨著稻米的逐漸成熟OsSBEIIb基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，第一周表達(dá)量最低，第三周表達(dá)量最高，且兩者差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。因?yàn)榈谝恢芩具€沒有灌漿，胚乳沒有形成，所以O(shè)sSBEIIb基因的表達(dá)量最低。第三周取樣的稻米，此時(shí)水稻灌漿最為活躍，因此OsSBEIIb基因的表達(dá)量最高。

圖7 OsSBEIIb 基因在不同時(shí)期稻米的表達(dá)

2.4 OsSBEIIb 基因編碼區(qū)序列分析

利用引物對(duì)35 份水稻品種進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到了一條編碼序列為2 478 bp 的cDNA 序列，PCR 產(chǎn)物純化后送北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行sanger 測(cè)序。與 “日本晴”O(jiān)sSBEIIb基因的編碼區(qū)進(jìn)行序列比對(duì)，在測(cè)得的35 個(gè)水稻品種OsSBEIIb基因的編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了15 個(gè)SNP 變異位點(diǎn)（圖8）分別位于117、280、345、586、809、1 029、1 235、1 253、1 326、1 562、1 933、2 132、2 274、2 339、2 340、2 438。這些變異位點(diǎn)都位于OsSBEIIb基因的功能區(qū)域。

圖8 OsSBEIIb 編碼區(qū)SNP 變異位點(diǎn)序列

根據(jù)15 個(gè)SNP 變異位點(diǎn)，可將35 份水稻品種分為9 個(gè)單倍型（表3）。由表3 可知，所有單倍型中與“日本晴”差異最小的單倍型是H9、H6，相差1個(gè)堿基；與日本晴”差異最大的單倍型是H7，相差7個(gè)堿基。頻率最高的單倍型是H6 有13 個(gè)品種。

表3 OsSBEIIb 基因編碼區(qū)序列變異位點(diǎn)與單倍型

3 討 論

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，淀粉是水稻的主要營(yíng)養(yǎng)成分，而淀粉又分為直鏈淀粉和支鏈淀粉。淀粉的合成需要一系列酶的共同參與，不同酶之間相互聯(lián)系又相互作用。該研究通過(guò)PCR 擴(kuò)增獲得了湘早秈2 號(hào)水稻淀粉分支酶（OsSBEIIb）基因cDNA 編碼區(qū)序列，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)分析了該基因的時(shí)空表達(dá)特征。該基因表達(dá)具有空間特異性，在根、莖、葉、稻殼的表達(dá)量很低，主要在灌漿期稻米的胚乳中表達(dá)，在灌漿第3 周表達(dá)量最高。可見，OsSBEIIb的表達(dá)與水稻支鏈淀粉的形成密切相關(guān)。如果通過(guò)RNA 干擾技術(shù)或者基因編輯技術(shù)抑制該基因在灌漿期的表達(dá)，那么水稻支鏈淀粉的含量可能會(huì)大幅下降，而直連淀粉的含量將會(huì)大幅增加，這樣水稻抗性淀粉的含量會(huì)得到一定的提升。

通過(guò)PCR 擴(kuò)增，sanger 測(cè)序獲得了35 個(gè)水稻品種OsSBEIIb基因的編碼區(qū)序列。通過(guò)序列多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，該基因在不同水稻品種中存在著SNP 位點(diǎn)變異，且變異位點(diǎn)都位于該基因的功能編碼區(qū)，表明該基因在不同水稻品種中存在著豐富的多態(tài)性信息。這些豐富的變異位點(diǎn)為抗性淀粉水稻品種的選育提供了豐富的基因資源，為高抗性淀粉水稻品種的選育提供了豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)。