周 文，廖 濤，朱子健，白 嬋，王炬光，熊光權，柴 毅

(1 長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434023；2 湖北省農業(yè)科學院農產品加工與核農技術研究所，農業(yè)農村部農產品冷鏈物流技術重點實驗室，湖北 武漢 430064)

在各種水產養(yǎng)殖過程中，麻醉已被廣泛證明是減少各種水產養(yǎng)殖過程中應激或物理損傷的有效方法[1-3]。麻醉通常由化學藥劑或物理方法誘導，首先引起鎮(zhèn)靜效果，其次是產生麻醉效果(失去活動能力、平衡能力和意識)[4]。

目前，已有多種化學或者物理的方法可用于魚類麻醉，然而，不同方法對不同魚類的麻醉效果不同，其通常受到藥劑種類、濃度，動物的大小以及環(huán)境因素(溫度、pH)影響[15-16]。恰當?shù)穆樽砜梢詫︳~類的有害影響降到最低[17]。因此，每個物種都需要選擇合適的麻醉方式，制定合適的麻醉方案以減少運輸過程中的有害影響[18]。

黃顙魚(Tachysurusfulvidraco)是中國重要的經濟淡水魚類之一，由于“全雄1號”和雜交黃顙魚“黃油1號”兩個審定新品種的推廣，顯著促進了水產生產和消費的增加，黃顙魚被認為是未來20年水產養(yǎng)殖產量將超過100萬t的僅有的兩種特殊魚類之一(另一種是大嘴鱸魚)[19-20]。此外，黃顙魚鮮美的肉質和較高的市場價值，使其在日本、韓國、東南亞有廣闊的市場前景[21]。遺憾的是，目前沒有看到相關文獻評價多種麻醉方式對黃顙魚的麻醉效果以及達到麻醉狀態(tài)后持續(xù)麻醉所造成的應激相關研究。

本研究評估了茶樹精油、低溫麻醉、電麻醉對經過不同溫度暫養(yǎng)以及不同體質量黃顙魚的麻醉效果，同時還研究了麻醉時長對黃顙魚應激的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗魚和馴養(yǎng)

本研究使用的黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)來自中國湖北省洪湖市水產養(yǎng)殖場(氣溫約30℃)。包括兩種大?。后w質量100.58±3.13 g 、體長20.5±0.32 cm；體質量157.35 g±7.16、體長25.33±0.51 cm。試驗前，魚被放在室內循環(huán)系統(tǒng)中(氣溫22℃)飼喂7 d以適應試驗條件(黃顙魚專用飼料購買至通威)。每個養(yǎng)殖桶都有相同數(shù)量的魚，分別在兩種水溫下暫養(yǎng)：17℃和24℃，其他生活條件一致。養(yǎng)殖水質如下：溶氧、pH分別為6.80±0.14 mg/L和7.15±0.07。光暗周期為12 h:12 h(08：00—20：00)。試驗期間沒有魚死亡，并且在實驗進行前24 h暫停飼喂，以清空魚消化道。

1.2 試劑和儀器

茶樹精油(Tea oilMelaleucaalternifolia，藥用級)、無水乙醇購買至阿拉丁試劑網(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；皮質醇、葡萄糖測定都采用商業(yè)試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國)；A-BF高精度線性電源，東莞市不凡電子有限公司；3K15離心機，美國Sigma-Aldric公司；酶標儀SPARK，瑞士Tecan 公司；ISO 900電子分析天平，德國Sartorius 公司；hq40 哈希HACH便攜式雙路輸入多參數(shù)數(shù)字化分析儀，哈希水質分析儀器(上海)有限公司。

1.3 暫養(yǎng)溫度優(yōu)化

總共25條黃顙魚(157.35±7.16 g；25.33±0.51 cm)被平均分到5個溫度的循環(huán)系統(tǒng)中(7.7、12.5、17.2、20.3、24.1℃，實際溫度)。暫養(yǎng)7 d后，黃顙魚經過低溫被誘導深度麻醉，緊接著被采集血液進行皮質醇和葡萄糖測定。小循環(huán)系統(tǒng)如圖1a所示。

圖1 低溫麻醉系統(tǒng)(a)以及電麻醉系統(tǒng)(b)

1.4 3種麻醉方式的麻醉效果

總共408條黃顙魚被用于麻醉效果測試，它們被分為4組，包括2種大小(100.58±3.13 g 、20.5±0.32 cm；157.35±7.16 g、25.33±0.51 cm)和2種暫養(yǎng)溫度(17℃、24℃)。4組(不同大小×不同溫度暫養(yǎng))黃顙魚都被用于3種麻醉方式測試(茶樹精油、電麻醉、低溫麻醉)。每一條黃顙魚被完全浸沒在含有40 L溶液的塑料箱(體積100 L)中觀察15 min，整個暴露過程持續(xù)充氣，15 min后魚被取出放到80 L的清水中復蘇，并記錄麻醉時間、恢復時間。所有經過麻醉實驗的黃顙魚都被保留到原來的暫養(yǎng)水箱中，觀測3 d內的存活情況。黃顙魚麻醉分期判斷標準如表1所示，改編自Mirghaed 等[22]。麻醉試驗水質條件如表2所示，麻醉的水溫和暫養(yǎng)溫度保持一致，暫養(yǎng)水溫來源于1.3節(jié)的結果。

其中244條黃顙魚被用于茶樹精油測試，黃顙魚(n=6)暴露于含有16個不同質量濃度的茶樹精油的溶液中(40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190 mg/L)。茶樹精油溶液由準確稱重的茶樹精油母液(茶樹精油:無水乙醇為1∶9)均勻混合到40 L水中配置而成。

144條黃顙魚被用于電麻醉測試，黃顙魚(n=6)暴露于不同電流強度的自制麻醉系統(tǒng)中(0.18、0.2、0.24、0.26、0.28、0.30 A，30 V)。電麻醉裝置如圖1b所示。

20條黃顙魚被用于低溫麻醉測試，所有的黃顙魚都經過同樣的降溫程序：當水溫>10℃時，降溫速率為5℃/h；當水溫<10℃時，降溫速率為1℃/h。每5條黃顙魚被用于每個麻醉狀態(tài)測試(4個狀態(tài)，從輕度鎮(zhèn)靜到深度麻醉)，每條黃顙魚的誘導水溫被記錄，隨后被取出放入暫養(yǎng)水缸中復蘇并記錄復蘇時間。

1.5 3種麻醉方式持續(xù)麻醉過程中應激變化

總共85條在24℃暫養(yǎng)7 d后的黃顙魚(157.35±7.16 g；25.33±0.51 cm)被用于應激測試。其中75條黃顙魚被誘導深度麻醉，并在達到麻醉后(3 min)第0、2、4、6、8 分鐘被采集血液進行皮質醇和葡萄糖分析。3種麻醉方式條件分別如下：茶樹精油的質量濃度為190 mg/L；電麻醉的電流和電壓為0.30A和30V；低溫麻醉的溫度為8℃。

此外，提供一個非應激組(基線組)和過應激組的血糖和血漿皮質醇水平，作為麻醉期間應激水平的比較。5條未處理的黃顙魚被殺死作為基線組；5條遭受巨大應激的黃顙魚作為過應激組黃顙魚被暴露在高速流動的水流中，直到對尾部按壓不會爆發(fā)游泳并且在取樣前保持30 min[13]。

1.6 樣品處理和分析

用非肝素化注射器采集血樣，血樣在25℃靜置1 h后經過離心(4℃，4 000 r/min，15 min，離心半徑13.5 cm)后取上清液，在-80℃冰箱中保存直到測定應激指標。選取皮質醇和葡萄糖作為應激指標，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清皮質醇水平。采用葡萄糖氧化酶法測定血清葡萄糖質量濃度。

1.7 數(shù)據(jù)處理和分析

使用 Microsoft Excel 2019 和用 Graphpad Prism9軟件對試驗結果進行統(tǒng)計分析和作圖。對所有結果進行雙因素方差分析(Two-Way ANOVA)，并作Tukey多重比較檢驗，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。所有結果以箱線圖表示，箱線圖上限為最高值，下限為最低值，中間線為中位數(shù)。

表1 黃顙魚麻醉分期

2 結果

2.1 黃顙魚麻醉過程中水質

表2所示的水質結果顯示，茶樹精油、電麻醉、低溫麻醉不會造成水質的劇烈變化，并且3種麻醉方式不會使魚死亡。

表2 麻醉過程中水質情況以及存活率

2.2 黃顙魚經過不同溫度暫養(yǎng)后皮質醇和葡萄糖水平

如圖2所示，暫養(yǎng)溫度影響黃顙魚麻醉后的皮質醇和葡萄糖水平。經過17.2℃暫養(yǎng)的黃顙魚皮質醇水平最低，而葡萄糖水平最高，意味著17.2℃是最佳的暫養(yǎng)溫度。此外，黃顙魚在7.7℃被麻醉，因此沒有暫養(yǎng)7 d后的數(shù)值。

圖2 不同溫度暫養(yǎng)7 d后經低溫麻醉后黃顙魚的皮質醇(a)和葡萄糖(b)含量

2.3 茶樹精油對不同大小和溫度暫養(yǎng)黃顙魚的麻醉效果

如圖3所示，茶樹精油的質量濃度和不同的組別對黃顙魚的麻醉以及恢復時間有顯著影響(P<0.05)。隨著茶樹精油質量濃度升高，黃顙魚的麻醉程度加深，誘導時間變短，恢復時間增加。在17℃時，小個體的黃顙魚深度麻醉最佳質量濃度為130 mg/L而大的黃顙魚為190 mg/L；在24℃時，小個體黃顙魚深度麻醉最佳質量濃度為120 mg/L，大個體最佳為130 mg/L；它們對應的恢復時間分別為：193.25±36.99 s、140.25±29.94 s、174.25±8.44 s、211.75±10.89 s。在面對茶樹精油時，黃顙魚個體越大所需質量濃度以及時間更長，相反，暫養(yǎng)溫度越高，黃顙魚所需質量濃度以及時間更短。此外，研究發(fā)現(xiàn)較高溫度暫養(yǎng)能夠減少不同體質量黃顙魚所需的茶樹精油質量濃度差(從60 mg/L下降到10 mg/L)，這可能使不同體質量的黃顙魚在較短的時間內同時達到所需的麻醉狀態(tài)。

圖3 不同大小和不同暫養(yǎng)溫度的黃顙魚在接觸不同質量濃度的茶樹精油時的麻醉和恢復時間

2.4 電麻醉對不同大小和暫養(yǎng)馴化黃顙魚的麻醉效果

如圖4所示，電流大小和不同的組別對黃顙魚的麻醉時間有顯著影響(P<0.05)，而恢復時間沒有明顯差異(P>0.05)。隨著電流大小升高，黃顙魚的麻醉程度加深，誘導時間變短。在17℃時，小規(guī)格的黃顙魚深度麻醉最佳電流為0.30 A，而大規(guī)格的黃顙魚所需電流>0.30 A；在24℃時，兩種個體的黃顙魚深度麻醉最佳電流為0.30 A；黃顙魚在0.30 A的恢復時間分別為：173.50±17.10 s、177.25±5.40 s、171.75±8.93 s、165.5±11.01 s。在面對電麻醉時，黃顙魚個體越大、暫養(yǎng)溫度越低所需電流更大，但是他們的恢復時間沒有顯著性差異(P>0.05)。水中電擊需要調整電流強度、持續(xù)時間和頻率，以達到預期效果。表3列舉了最近有關電麻醉的研究，由于電麻醉條件不同，這些結果很難進行比較，但是大部分研究都顯示了一個短暫的麻醉時間。

圖4 不同大小和不同溫度暫養(yǎng)黃顙魚在接觸不同電流后的麻醉(a-d)和恢復時間(e)

表3 本研究和先前的研究在電麻醉效果之間的比較

2.5 低溫麻醉對不同大小和暫養(yǎng)馴化黃顙魚的麻醉效果

如表4所示，不同的組別對黃顙魚的低溫麻醉麻醉溫度和恢復時間有顯著影響(P<0.05)。不同處理黃顙魚的低溫麻醉區(qū)間在6～10℃，并且，隨著暫養(yǎng)溫度降低以及個體增大，黃顙魚的低溫麻醉區(qū)間更低。24℃暫養(yǎng)大個體、24℃暫養(yǎng)小個體、17℃暫養(yǎng)大個體、17℃暫養(yǎng)小個體深度麻醉溫度分別為:8.22、8.83、6.26、7.23℃；它們對應的恢復時間分別為:254.50±5.02 s、216.5±7.23 s、278.25±13.16 s、254.25±5.07 s。

表4 低溫麻醉對不同大小和不同暫養(yǎng)溫度黃顙魚的麻醉誘導溫度以及對應的恢復時間

2.6 3種麻醉方式持續(xù)麻醉過程中應激變化

如圖5所示，不同的麻醉方式對皮質醇水平有顯著性差異(P<0.05)，而對葡萄糖水平沒有顯著性差異(P>0.05)，麻醉的時間對皮質醇和葡萄糖水平都沒有顯著性差異(P>0.05)，但是，不同的麻醉方式和麻醉時間的相互作用對皮質醇水平有顯著性差異(P<0.05)。在本研究中，3種麻醉方式的皮質醇和葡萄糖水平隨著麻醉時間增加有一個略微增加的趨勢，但是低溫麻醉一直保持最低的皮質醇和葡萄糖水平。電麻醉的皮質醇質量濃度在9 min時顯著升高(P<0.05)，茶樹精油則變化不大，而低溫麻醉在麻醉11 min時顯著降低(P<0.05)。此外，電麻醉的葡萄糖水平在11 min時顯著高于低溫麻醉(P<0.05)。

圖5 3種麻醉方式持續(xù)麻醉過程中皮質醇和葡萄糖水平變化

3 討論

3.1 3種麻醉方式的麻醉效果

3種麻醉方式都能用于黃顙魚的麻醉，并且所有麻醉后的魚都能正常生存。鑒于不同目的需要不同深度的麻醉(例如：有水運輸通常使魚鎮(zhèn)靜，而手術、無水運輸通常使魚麻醉)，本試驗記錄了輕度鎮(zhèn)靜、深度鎮(zhèn)靜、輕度麻醉、深度麻醉所需的誘導時間和恢復時間，這些結果將作為黃顙魚麻醉條件優(yōu)化的參考。

最佳濃度是活魚運輸研究中的最主要參數(shù)，大多數(shù)研究都根據(jù)3 mim麻醉、5 min恢復的公認標準來選擇最佳的麻醉劑濃度、電流強度從而獲得最佳的麻醉效果[28]。麻醉時間以及恢復時間通常受到生物因素(物種、大小等)以及非生物(麻醉劑濃度、溫度、pH等)因素的影響。和大多數(shù)研究類似，本研究中黃顙魚的麻醉誘導時間和茶樹精油的質量濃度以及電流的大小呈負相關，而恢復時間則呈正相關[29-31]。

在生物因素中，物種和大小在選擇最佳質量濃度時被廣泛考慮[32-33]。Correia等[34]發(fā)現(xiàn)深度麻醉1.03 g的黃尾小丑魚(Amphiprionclarkii)所需茶樹精油質量濃度為200 μ/L，而深度麻醉6.60 g的銀鯰[35](Rhamdiaquelen)需要茶樹精油質量濃度為300 μ/L，類似地，本研究茶樹精油麻醉結果顯示，兩種溫度下100.58 g的黃顙魚所需茶樹精油最佳質量濃度都小于157.35 g的黃顙魚。以上結果似乎表明體質量越大的魚所需的茶樹精油質量濃度越大。與此相似，本研究電麻醉結果顯示，0.30 A的電流能夠在3 min內麻醉100.58 g的黃顙魚卻不能麻醉157.35 g的黃顙魚。此外，Venturini等[36]研究發(fā)現(xiàn)深度麻醉498.9 g的羅非魚(Oreochromisniloticus) 需要10.8 A(205 V)的電流。電麻醉受到體質量大小影響的變化趨勢似乎和茶樹精油一致。然而，朱挺兵[27]等報道深度麻醉359.10 g的圓口銅魚(Coreiusguichenoti)僅需要200～225 mA(30 V)的電流。電麻醉的電流大小似乎更受物種影響，因此，關于電麻醉還需要進一步的研究才能做出準確判斷。

在非生物因素中，溫度是影響麻醉劑最佳質量濃度選取最重要的環(huán)境因素之一。先前研究表明，盡管不同物種對麻醉藥的反應差異很大，但在較高溫度下麻醉，麻醉劑最佳質量濃度有變小的趨勢，這可能與魚類在較高的溫度下保持較高的新陳代謝和通氣率有關[37-38]。本研究發(fā)現(xiàn)相同大小黃顙魚在17℃所需茶樹精油的最佳質量濃度更大，而電麻醉和低溫麻醉在17℃所需電流更大，溫度更低，這可能和低溫時黃顙魚的抗應激能力以及麻醉機制有關。和先前的研究方法(直接放在不同的水溫中麻醉)相比，本研究發(fā)現(xiàn)提高暫養(yǎng)溫度不僅能降低麻醉劑最佳濃度，提升麻醉的整齊程度，而且還能消除由于溫度劇烈變化造成的應激。目前，還沒有關于暫養(yǎng)溫度對于麻醉效果的研究，這可能是以后的一個研究方向，特別是在使用各種麻醉劑時，因為減少麻醉劑的質量濃度意味著更短的麻醉劑代謝時間。

總之，制定合適的麻醉方案時要充分考慮魚的種類、大小、以及溫度，簡單地復制不同物種的麻醉劑使用劑量會導致魚類死亡或無法達到足夠高的麻醉水平。

3.2 3種麻醉方式持續(xù)麻醉過程中應激變化

麻醉效率在文獻中被廣泛報道，然而，很少有研究考慮暴露期間魚類福利[39]。盡管使用麻醉藥被認為可以減少應激，但不受限制的使用可能會引起更大的應激，因為麻醉通過抑制中樞神經系統(tǒng)降低代謝率、影響心肺動力學和降低呼吸頻率[4,40]。

在無水?；钸\輸過程中，魚從接觸麻醉到完成打包通常需要一個不確定的時間，魚麻醉后在麻醉液中繼續(xù)保留的時間仍然充滿爭議。然而，很少研究探究魚類在接觸麻醉過程中應激的變化。Wosnick等[41]在對小鋸蓋魚 (Centropomusparallelus)的麻醉研究中發(fā)現(xiàn)，小鋸蓋魚在接觸苯佐卡因7 min后皮質醇和葡萄糖水平顯著增加，因此推薦麻醉時間為3～6 min。同樣的，本結果顯示：黃顙魚在電麻醉9 min后皮質醇水平顯著提高，而葡萄糖水平升高顯示在11 min，這表明長時間面對電流刺激會增加黃顙魚應激，因此，本推薦黃顙魚的電麻醉時間為3～7 min。與電麻醉相反，低溫麻醉誘導深度麻醉的黃顙魚在11 min時皮質醇和葡萄糖水平降低，而茶樹精油基本保持不變，這說明在11 min內低溫麻醉和茶樹精油沒有使黃顙魚的應激變大。同時，低溫麻醉在3種麻醉方式中對黃顙魚造成的應激最小，暗示低溫麻醉更加適合黃顙魚的麻醉。

4 結論

3種麻醉方式都能很好地麻醉黃顙魚，但是魚體大小、暫養(yǎng)溫度、麻醉方式將影響黃顙魚麻醉方案的制定；推薦電麻醉的持續(xù)時間為3～6 min，而低溫麻醉和茶樹精油為3～11 min；鑒于低溫麻醉造成的應激最小，對規(guī)格統(tǒng)一性要求低，推薦低溫麻醉作為黃顙魚的麻醉方式。

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