劉芳玲 厲晨陽(yáng) 張哲盼 徐良輝 卓雯文 韓嘉煒 張凱 鄭善堅(jiān)

摘要 為探究草魚（Ctenopharyngodon idella）感染多子小瓜蟲（Ichthyophthirius multifiliis）體表黏液的分泌及調(diào)控機(jī)制，設(shè)計(jì)了3個(gè)預(yù)防組，分別對(duì)健康草魚投喂添加維生素C 500 mg/kg飼料15 d，水體潑灑五倍子2 mg/L、硫酸銅1 mg/L連續(xù)預(yù)防5 d后再感染多子小瓜蟲5 d;以及3個(gè)治療組，對(duì)健康草魚感染多子小瓜蟲5 d后再分別按上述藥物進(jìn)行內(nèi)服或外用治療5 d。定期測(cè)定草魚體表黏液中的酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LZM）的酶活、黏液細(xì)胞密度和Muc5B基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，3個(gè)預(yù)防組的草魚黏液中的ACP、AKP酶活普遍顯著上升（P<0.05），五倍子和硫酸銅組的LZM酶活顯著上升（P<0.05）。除五倍子組外，其余預(yù)防組Muc5B基因表達(dá)量均顯著上升（P<0.05）。維生素C治療組的草魚黏液ACP、AKP酶活均顯著上升，硫酸銅治療組的草魚體表黏液中僅AKP酶活顯著上升（P<0.05）。飼料中添加維生素C顯著提高草魚體表黏液中的酶活、黏液細(xì)胞密度和Muc5B基因的相對(duì)表達(dá)量，有效促進(jìn)草魚體表黏液的分泌調(diào)控，對(duì)抑制多子小瓜蟲侵染的效果顯著。

關(guān)鍵詞 草魚;多子小瓜蟲;體表黏液;Muc5B基因

中圖分類號(hào) S943? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2022）10-0063-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.10.016

Effects of Drugs on Mucus and Enzyme Activity of Ctenopharyngodon idellus Infected by Ichthyophthirius multifiliis

LIU Fang-ling1，2， LI Chen-yang1， ZHANG Zhe-pan1 et al

（1.Zhejiang Normal University， Jinhua，Zhejiang? 321004;2. Key Laboratory of Wildlife Biotechnology and Conservation and Utilization of Zhejiang Province，Jinhua， Zhejiang? 321000）

Abstract In order to explore the secretion and regulation mechanism of Ctenopharyngodon idella infection with Ichthyophthirius multifiliis， three prevention groups were designed in this study. Healthy Ctenopharyngodon idella were fed with 500 mg/kg diet supplemented with vitamin C for 15 days， and water body was daubed with 2 mg/L Chinese gallnut and 1 mg/L copper sulfate for continuous prevention for 5 days. Ichthyophthirius multifiliis was used for infection for 5 days. And three treatment groups were treated with healthy Ctenopharyngodon idella with Ichthyophthirius multifiliis for 5 days， followed by oral or topical treatment for 5 days， respectively. The activities of acid phosphatase （ACP）， alkaline phosphatase （AKP）， lysozyme （LMZ）， the density of mucus cells and the relative expression of Muc5B gene in the mucus of Ctenopharyngodon idella were determined regularly. The results showed that the activities of ACP and AKP in the Ctenopharyngodon idella mucus of the three prevention groups were significantly increased （P<0.05）， the activity of LZM enzyme in Chinese gallnut and copper sulfate groups was significantly increased （P<0.05）. The expression of Muc5B gene in all prevention groups except Chinese gallnut group was significantly increased （P<0.05）. The activity of ACP and AKP in mucus of grass carp in vitamin C treatment group was significantly increased， while the activity of AKP in mucus of Ctenopharyngodon idella in copper sulfate treatment group was significantly increased （P<0.05）. The supplementation of vitamin C significantly increased the enzyme activity， mucus cell density and the relative expression of Muc5B gene in the mucus surface of Ctenopharyngodon idella， and effectively promoted the secretion regulation of mucus surface of Ctenopharyngodon idella. The effect on inhibiting the infection of Ichthyophthirius multifiliis was remarkable.

Key words Ctenopharyngodon idella;Ichthyophthirius multifiliis;Mucus on body surface;Muc5B gene

基金項(xiàng)目 浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2019C02049，2020C02014） 。

作者簡(jiǎn)介 劉芳玲（1997—），女，浙江金華人，碩士研究生，研究方向：水生動(dòng)物病害。通信作者，副教授，碩士，碩士生導(dǎo)師，從事水生動(dòng)物病害研究。

收稿日期 2021-09-02

魚類的黏膜免疫系統(tǒng)（mucosal immune system）包括魚類的鰓、皮膚和腸道黏膜組織是抵御外界病原侵襲的第一道防線，魚類鰓、皮膚黏膜組織不僅具有物理屏障作用，還具有特異性及非特異性免疫應(yīng)答[1-2]。魚類表皮層中杯狀細(xì)胞和腺細(xì)胞具有分泌黏液的功能，其中含有多種抗菌酶以及其他廣譜性的抗細(xì)菌、真菌成分，分泌到體表的黏液具有物理性凝結(jié)沉淀外源性侵襲原及潤(rùn)滑作用;魚類皮膚組織及其分泌黏液中存在多種非特異性免疫因子，主要包括酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LZM）、凝集素、抗菌肽等，具滲透調(diào)節(jié)、運(yùn)動(dòng)、抵御微生物入侵等功能[3-7]。

多子小瓜蟲（Ichthyophthirius multifiliis）是一種纖毛類原生動(dòng)物，主要寄生在淡水魚類的體表和鰓絲，由于缺乏安全有效的治療藥物，給水產(chǎn)養(yǎng)殖造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[8]。而通過(guò)調(diào)控魚類體表黏液分泌，激活魚類體表的黏膜免疫，阻止或抵御多子小瓜蟲的入侵，可在一定程度上降低多子小瓜蟲的危害[9]。研究表明，維生素C具有一定促進(jìn)體表黏液的分泌，Dawood等[10]在真鯛（Pagrus major）的飼料中添加維生素C和β-葡聚糖后，發(fā)現(xiàn)真鯛皮膚黏液分泌顯著增加。硫酸銅也可促進(jìn)魚體表黏液分泌增多，鰓絲黏液分泌亢進(jìn)[11]。五倍子含有60%～80%的鞣酸，可使魚體皮膚黏膜腺細(xì)胞蛋白發(fā)生凝固，引起黏液分泌抑制[12]，硫酸銅和五倍子對(duì)多子小瓜蟲掠食體有一定的殺滅作用[13]，Zhang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，從五倍子中分離得到的五倍子葡萄糖（pentagall oylglucose）當(dāng)其使用濃度為2.5～20.0 mg/L時(shí)對(duì)小瓜蟲掠食體的殺滅率為100%。因此，筆者選取上述3種藥物對(duì)多子小瓜蟲感染草魚（Ctenopharyngodon idella）前后的體表黏液分泌開(kāi)展研究，以期為魚類寄生蟲病的防控研究提供理論支撐與實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

健康草魚來(lái)自浙江省金華市金農(nóng)魚種場(chǎng)，規(guī)格（180±30）g。多子小瓜蟲為筆者所在實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。

主要試劑：酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、溶菌酶測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所）;Animal Total RNA Isolation Kit（Foregene），DNA提取試劑盒（上海生工生物技術(shù)有限公司）;HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit，2×UltraSYBR Mixture（High ROX）（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）;維生素C（含量90%，華北制藥股份有限公司）、五倍子（含量25%，山西首愛(ài)）、五水硫酸銅（含量95%，山東習(xí)化生物科技有限公司）。PCR引物的合成委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)在室內(nèi)養(yǎng)殖桶內(nèi)進(jìn)行，每個(gè)養(yǎng)殖桶內(nèi)放養(yǎng)20尾健康草魚，暫養(yǎng)2 d后進(jìn)行試驗(yàn)。預(yù)防試驗(yàn)分別外用五倍子（2 mg/L）5 d、硫酸銅（1 mg/L）5 d和內(nèi)服維生素C（500 mg/kg）15 d，各設(shè)一個(gè)空白對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組，每組3個(gè)平行。預(yù)防用藥結(jié)束后再用多子小瓜蟲掠食體（3 000個(gè)/尾）感染5 d。

治療試驗(yàn)，先用多子小瓜蟲掠食體（3 000個(gè)/尾）感染5 d，再分別投喂維生素C（500 mg/kg）、外用五倍子（2 mg/L）和外用硫酸銅（1 mg/L），連續(xù)處理5 d，各設(shè)一個(gè)空白及陽(yáng)性對(duì)照組，每組3個(gè)平行。

試驗(yàn)水溫25 ℃，養(yǎng)殖桶有獨(dú)立增氧及進(jìn)排水系統(tǒng)，蓄水250 L。日投喂飼料（浙江粵海淡水魚飼料，粗蛋白含量28%）按體重0.5%計(jì)，每天投喂1次，每天更換新水100%。

預(yù)防組在開(kāi)始小瓜蟲攻毒之后，每天記錄草魚的存活數(shù)量并計(jì)算成活率，持續(xù)10 d，空白對(duì)照組為預(yù)防對(duì)照;治療組在開(kāi)始用藥之后，每天記錄草魚的存活數(shù)量并計(jì)算成活率，持續(xù)10 d，陽(yáng)性對(duì)照組為治療對(duì)照。

1.3 酶活指標(biāo)測(cè)定

分別在藥物處理及多子小瓜蟲感染前后，各取3尾草魚的背部體表黏液進(jìn)行酶活測(cè)定。先用吸水紙擦干草魚體表水分后，用玻片刮取背部黏液1 mL于離心管，PBS緩沖液10倍稀釋并勻漿，轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min，取離心后黏液上清液進(jìn)行酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LZM）的酶活測(cè)定，在520 nm波長(zhǎng)下測(cè)定ACP、AKP酶活測(cè)量體系的OD值，在530 nm波長(zhǎng)下測(cè)定LZM酶活測(cè)量體系的OD值，并按照相應(yīng)公式計(jì)算酶活。

1.4 RT-qPCR檢測(cè)

分別提取草魚背部皮膚的RNA，用核酸定量?jī)x和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量和完整性，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)草魚Muc5B基因cDNA序列，Primer Premier 5設(shè)計(jì)合成正反向特異熒光定量引物Muc5B，且以內(nèi)參基因β-actin作為對(duì)照。各引物序列：Muc5B（F：5′-TACAATGGCGACAAGGATGA-3′，R：5′-CACTAAACCCTGGACTGCTGA-3′）;β-actin（F：5′-CTGTATGCCTCTGGTCGT-3′，R：5′-GCTGTAGCCTCTCTCGGT-3′）。每樣3個(gè)重復(fù)，采用2-ΔΔCt方法分析所得數(shù)據(jù)，計(jì)算Muc5B基因的相對(duì)表達(dá)水平，陽(yáng)性對(duì)照組分別記錄為感染5和10 d。

1.5 草魚背部皮膚組織切片

取草魚背部約1 cm×1 cm大小的皮膚組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)梯度乙醇脫水，透明，包埋，切片，AB-PAS染色。切片標(biāo)本置顯微鏡（OLYMPUS BX51）下拍照，并按照100 μm皮膚組織內(nèi)黏液細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.6? 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 21軟件進(jìn)行SNK法多重比較檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚存活率

在草魚感染多子小瓜蟲后，預(yù)防組和治療組的草魚均有發(fā)病死亡。其中，維生素C預(yù)防組和治療組的存活率最高，分別是65%和55%，其次為五倍子預(yù)防組和治療組，硫酸銅的預(yù)防組和治療組的存活率最低，均僅有5%，與對(duì)照組相比未表現(xiàn)出治療或預(yù)防的效果（圖1）。

2.2 藥物處理對(duì)草魚ACP、AKP、LZM酶活的影響

健康草魚感染多子小瓜蟲后，其黏液中ACP、AKP 2種酶活性均顯著升高（P<0.05），而LZM酶活性在感染5 d時(shí)與感染前無(wú)顯著變化，在感染10 d時(shí)顯著下降（P<0.05）（圖2）。

在維生素C和五倍子預(yù)防組中，與健康草魚對(duì)照組相比，草魚黏液的ACP和AKP酶活均顯著上升（P<0.05）;預(yù)防后再用多子小瓜蟲感染，預(yù)防后感染與陽(yáng)性對(duì)照5 d相比，維生素C預(yù)防組的ACP、AKP酶活和五倍子預(yù)防組的ACP酶活顯著升高（P<0.05）;3種藥物在治療試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，治療組與陽(yáng)性對(duì)照5 d相比，均能使患病草魚的ACP酶活和AKP酶活顯著升高（P<0.05）。同種藥物預(yù)防后與預(yù)防后感染對(duì)比可發(fā)現(xiàn)，維生素C預(yù)防組在受到多子小瓜蟲入侵之后還能使ACP和AKP酶活進(jìn)一步升高，而五倍子預(yù)防組在多子小瓜蟲入侵前后并無(wú)明顯變化。與健康草魚對(duì)比，維生素C預(yù)防組和治療組的LZM酶活與對(duì)照組無(wú)明顯差異，而五倍子和硫酸銅預(yù)防組中的LZM酶活顯著上升（P<0.05）;五倍子和硫酸銅治療組中的LZM酶活顯著降低（P&lt;0.05）（表1）。

2.3 Muc5B基因表達(dá)水平

RT-qPCR結(jié)果表明，除五倍子

外，預(yù)防組草魚體表Muc5B基因的相對(duì)表達(dá)量相較于對(duì)照均顯著升高（P<0.05），維生素C組表達(dá)量最高;攻毒之后，維生素C組與五倍子組草魚體表Muc5B基因的相對(duì)表達(dá)量顯著提升，其中維生素C組顯著高于其他組（P<0.05）。4種藥物治療組的Muc5B基因相對(duì)表達(dá)量均顯著高于健康對(duì)照組（P<0.05），其中五倍子組和陽(yáng)性對(duì)照較高，硫酸銅組較低（圖3），雖然陽(yáng)性對(duì)照組存活率很低，但存活魚的Muc5B基因相對(duì)表達(dá)量較高。

2.4 表皮黏液細(xì)胞觀察

對(duì)草魚體表黏液細(xì)胞的觀察計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，健康草魚感染多子小瓜蟲后，其體表黏液細(xì)胞密度無(wú)顯著差異。五倍子預(yù)防組和治療組中草魚體表黏液細(xì)胞密

度相較于對(duì)照組無(wú)顯著差異。維生素C預(yù)防組與治療組的

草魚體表黏液細(xì)胞密度相較于對(duì)照組顯著提升（P<0.05）。而硫酸銅的預(yù)防組與治療組的草魚體表黏液細(xì)胞密度相較于對(duì)照組顯著下降（P<0.05）（表2、圖4）。

3 討論

3.1 維生素C對(duì)草魚體表黏液的影響

在常規(guī)草魚飼料中添加維生素C（500 mg/kg）15 d預(yù)防后，草魚的Muc5 B基因表達(dá)量較對(duì)照提高了6倍，再對(duì)其進(jìn)行多子小瓜蟲攻毒感染后，其Muc5B基因表達(dá)量是陽(yáng)性5 d對(duì)照組的2倍，是感染對(duì)照組的4倍，表明添加維生素C能顯著提高草魚體表黏液的分泌量和黏液細(xì)胞密度。內(nèi)服維生素C的健康草魚ACP、AKP酶活較對(duì)照組顯著上升（P<0.05），LZM酶活差異不顯著。在治療處理中，維生素C組的ACP、AKP酶活較陽(yáng)性對(duì)照組也有顯著提高（P<0.05），Muc5B基因表達(dá)量較陽(yáng)性對(duì)照組低，差異顯著（P<0.05）;且預(yù)防組和治療組的草魚存活率也顯著升高。研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加維生素C能促進(jìn)魚類皮膚黏液和血清中各類過(guò)氧化物酶活性提高，如過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶等，可以幫助魚體清除自由基[15-18]。維生素C提高ACP、AKP酶活[19-21]?？梢?jiàn)維生素C不僅可以提高草魚黏液分泌的相關(guān)基因的表達(dá)，提高魚體體表黏液分泌量，還能提升魚體黏液中的免疫相關(guān)酶活性，從而加強(qiáng)魚體體表屏障，提高草魚對(duì)多子小瓜蟲的敏感性，在受到外界病原體入侵時(shí)能更快地上調(diào)相關(guān)免疫基因以及酶活性，提高草魚在多子小瓜蟲脅迫下的生存率。在治療中，維生素C組的成活率最高，維生素C可能參與了預(yù)防多子小瓜蟲感染的其他非特異性免疫作用，其黏液相關(guān)的Muc5B基因表達(dá)量不是很高，是否與多子小瓜蟲感染少有關(guān)仍需進(jìn)一步研究。

3.2 五倍子對(duì)草魚體表黏液的影響

外用五倍子（2 mg/L）對(duì)草魚進(jìn)行預(yù)防處理后，草魚體表黏液中的ACP、AKP和LZM酶活顯著提高，表明五倍子具有提高草魚體表黏液免疫能力的作用。多子小瓜蟲攻毒后，五倍子組Muc5B基因表達(dá)量得到了顯著提高，說(shuō)明多子小瓜蟲的感染激活了草魚體表黏液的分泌。除AKP酶活無(wú)顯著變化，ACP和LZM酶活顯著提高，在五倍子治療處理試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)五倍子組的Muc5B基因表達(dá)量較其他2種藥物組顯著提高（P<0.05），與陽(yáng)性對(duì)照組差異不顯著。ACP、AKP酶活顯著提高，LZM酶活降低。刁菁等[22]研究表明五倍子中所含的大量生物堿、有機(jī)酸等免疫活性物質(zhì)，能使Muc5B基因的表達(dá)量上調(diào)，促進(jìn)體表黏液分泌調(diào)控，對(duì)草魚預(yù)防多子小瓜蟲感染具有積極作用?？梢?jiàn)五倍子主要通過(guò)提高黏液分泌量抵御多子小瓜蟲入侵。

3.3 硫酸銅對(duì)草魚體表黏液的影響

研究表明硫酸銅能促進(jìn)多子小瓜蟲包囊的形成和脫落，能殺滅多子小瓜蟲的掠食體[23-24]。該研究中，硫酸銅能消滅部分小瓜蟲，但草魚皮膚組織中的黏液細(xì)胞密度顯著下降，且皮膚組織中的Muc5B基因表達(dá)量也顯著下降，可見(jiàn)同時(shí)對(duì)草魚體表屏障造成了損傷，進(jìn)而導(dǎo)致草魚存活率顯著下降。王利[11]認(rèn)為硫酸銅促進(jìn)體表黏液分泌亢進(jìn)，但硫酸銅是外部刺激引起魚體的黏液分泌，具有不可持續(xù)性。而試驗(yàn)中連續(xù)5 d用藥可能反而導(dǎo)致黏液的快速消耗，不利于對(duì)多子小瓜蟲的防控。結(jié)果表明硫酸銅（1 mg/L）外用對(duì)多子小瓜蟲的預(yù)和治療均無(wú)明顯效果。不難發(fā)現(xiàn)，連續(xù)的硫酸銅使用對(duì)草魚體表黏液調(diào)控起到負(fù)面效果，導(dǎo)致魚體體表屏障受損，黏液細(xì)胞密度下降，當(dāng)魚體受到多子小瓜蟲入侵時(shí)，免疫相關(guān)基因及酶活均下降，反而不利于對(duì)多子小瓜蟲的防控。

4 結(jié)論

綜上所述，維生素C對(duì)多子小瓜蟲的防治效果最佳，五倍子次之，硫酸銅則無(wú)明顯的防治作用。其中，維生素C能促進(jìn)黏液相關(guān)基因的表達(dá)，有效提高體表黏液酶活及體表黏液分泌水平，從而增強(qiáng)草魚免疫能力，提高成活率，因此預(yù)防及治療效果最好。五倍子在預(yù)防效果上表現(xiàn)一般，但在攻毒及治療后酶活提升，基因表達(dá)量也有所上調(diào)，因此對(duì)多子小瓜蟲具有一定的治療效果。硫酸銅可以促進(jìn)多子小瓜蟲從魚體脫落形成包囊，但也會(huì)影響體表黏液細(xì)胞的形成和黏液正常分泌，并不利于草魚免疫力的提升，因此硫酸銅對(duì)小瓜蟲的預(yù)防和治療效果均較差。上述結(jié)果表明藥物可以通過(guò)調(diào)控魚類自身的黏液分泌，增強(qiáng)其屏障作用的機(jī)制，從而對(duì)多子小瓜蟲起到一定的防治作用，在魚類養(yǎng)殖和疾病防治方面具有重要意義和良好前景。

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