閆飛虹， 李玲蕓， 周 行,3， 黃巖松， 崔榮靜*

(1.蘇州大學材料與化學化工學部，江蘇蘇州 215000；2.常熟理工學院材料工程學院，江蘇常熟 215500；3.河北師范大學化學與材料科學學院，河北石家莊050024)

抗壞血酸(Ascorbic Acid，AA)又名維生素C，它是生物體內最為重要的抗氧化劑之一，在生物體的各種生理、病理活動，如抗氧化損傷、神經保護、神經元細胞功能調控、干細胞增殖以及抗壞血病等過程中起著極為重要的作用[1 - 3]。人體不能自我合成AA，只能通過飲食獲取，很多水果蔬菜，如獼猴桃、冬棗、青椒都富含AA。AA也作為抗氧化劑被廣泛應用于食品加工、制藥制劑、動物飼料、復合維生素片以及化妝品中[4,5]。因此，開發(fā)用于靈敏可靠檢測AA的簡便分析方法至關重要。

相比天然酶，納米酶由于其優(yōu)越的性能受到了廣泛的關注[6,7]。到目前為止，已經有類過氧化物酶、類氧化物酶、類過氧化氫酶、類超氧化物歧化酶等多種納米酶被開發(fā)[8 - 11]。其中，類過氧化物酶由于其在分析檢測和醫(yī)療診斷中的廣泛應用而備受關注[12,13]。金屬納米酶材料以貴金屬為主，包括金、銀、鉑、鈀以及這些金屬的合金材料。高熵合金(HEAs)包含5個或5個以上的主元素，元素具有相似的原子比例[14]，具有功能屬性和結構屬性。納米多孔高熵合金(NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3)具有三維雙連續(xù)的納米多孔結構，有較高的孔隙率，高比表面積，高導電率和高穩(wěn)定性。通過探究NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3的類酶活性，發(fā)現該材料具有類過氧化物酶特性，NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3介導的催化反應可以短時間產生大量信號分子。應用NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3來檢測AA，AA與TMB相比，會優(yōu)先與H2O2發(fā)生氧化還原反應，從而在相同時間內延緩了TMB的開始氧化時間和最后的氧化程度[15]?；谝陨涎芯浚⒘艘环N檢測AA的簡便方法，該方法操作簡易、靈敏度高。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；KKQ-50E超聲波清洗儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；EL204電子分析天平(梅特勒托利多儀器(上海)有限公司)；EVO18掃描電子顯微鏡(德國，ZEISS公司)；Tecnai G220s-TWIN透射電子顯微鏡(美國，FEI公司)；HH-2數顯恒溫水浴鍋(金壇江南儀器廠)；GDJ500C電弧熔煉單旋系統(tǒng)(沈陽科友真空技術有限公司)；pHS -3C酸度計(上海雷磁儀器廠)。

Pt、Pd、Au、Ag、Ru、Al(99.9%，吉林東北有色金屬有限公司)；NaAc、HAc(分析純，江蘇強盛化工有限公司)；30%H2O2、HCl、NaOH、抗壞血酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(TMB)≥99%(GC)、5%Nafion(Sigma-Aldrich公司)；無水乙醇(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)。實驗用水為超純水。

1.2 NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3材料的制備

按物質的量比Pt∶Pd∶Au∶Ag∶Ru∶Al=3∶3∶3∶3∶3∶85，稱量金屬塊Pt、Pd、Au、Ag、Ru、Al(99.99%)，將金屬塊表面仔細打磨后放入樣品腔。在Ar氣氛保護下經電弧熔煉高頻加熱融化，運用電磁攪拌器攪拌熔融態(tài)的液態(tài)合金，當液態(tài)金屬發(fā)生轉動，說明熔煉完成，等合金完全冷卻，為了保證純度，每個樣品在Ar保護下至少還要再熔煉4次，經過熔體快淬得到Pt3Pd3Au3Ag3Ru3Al85合金條帶，最后將合金條帶置于5%HCl中，于50 ℃恒溫水浴鍋下腐蝕48 h，制得納米多孔高熵合金(NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3)。

1.3 NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3使用前處理

將10.0 mg NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3分散于0.05%的Nafion溶液中，使其質量濃度為5 mg/mL,用前超聲處理20 min,使材料分散均勻。

1.4 檢測方法

依次向離心管中加入適量的0.1 mol/L HAc-NaAc緩沖溶液(pH=4.0)、NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3、H2O2、AA 和TMB溶液，總體積3 mL,使NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3、H2O2、TMB質量濃度分別為20 μg/mL、500 μmol/L、300 μmol/L，AA濃度范圍是0.5～150 μmol/L。將混合液放在40 ℃水浴鍋中反應10 min后冰水浴5 min，然后將溶液置于TU-1901紫外分光光度計中，測量波長652 nm處的吸光度。

1.5 實際樣品前處理

21金維他多維元素片購于當地藥房。稱取1 g藥片，研磨成細粉后，置于16 mL的HAc-NaAc緩沖溶液(pH=4.0)中，超聲溶解10 min。然后將樣品溶液離心(13 000 r/min),取上層清液，用于實際樣品中AA的檢測。

2 結果與討論

2.1 NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3的掃描電鏡和透射電鏡表征

通過掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)表征，揭示了制得的NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3的形態(tài)。有趣的是，NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3具有類似小花的形態(tài)，從SEM圖可以看出，材料已經形成了三維貫通的孔隙結構。而從TEM圖中可看出材料內部的晶格條紋呈明暗交替、均勻分布，證明形成了多孔形貌。

圖1 NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3的(A、B)掃描電鏡(SEM)圖和(C、D的透射電鏡)(TEM)圖Fig.1 SEM images (A，B) and TEM images (C，D) of the NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3

2.2 NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3的X射線衍射和能譜分析

NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3的X射線衍射(XRD)圖和能譜(EDS)圖見圖2。從圖2(A)可以看見，脫合金后的NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3一些復雜的衍射峰消失，出現了三個明顯的衍射峰，這可能是由于六元高熵合金脫合金后形成難以區(qū)分的物相。其中標準卡片為：Pt(JCPDS 04-0802),Pd(JCPDS 46-1043)，Au(JCPDS 04-0784)，Ag(JCPDS 87-0720)，Ru(JCPDS 88-2333)和Al(JCPDS 85-1327)。與純Pt標準卡片對比，(111)、(200)和(220)晶面高熵合金的特征峰在2θ=39.76°、46.24°、67.45°。由于NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3中原子半徑較大元素的摻雜，使NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3衍射峰向小角度偏移。從圖2(B)可以看出，在EDS圖中，Pt3Pd3Au3Ag3Ru3Al85六元高熵合金條帶被酸腐蝕后，形成了與之前不同的相，而且被腐蝕后鋁含量明顯降低，直接證實了大部分的Al被腐蝕掉，與SEM圖中觀察到的基本一致，表明較成功制備了NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3催化劑。

圖2 NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3的X射線衍射(XRD)圖(A)和能譜(EDS)圖(B)Fig.2 XRD patterns (A) and EDS (B) of the NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3

2.3 NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3的類酶活性研究

2.3.1 pH值對高熵材料催化活性的影響圖3(A)為吸光度和pH值的關系曲線，可見在pH為4.0時吸光度最大，即在相對酸性環(huán)境中，NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3具有較高的催化活性。因此，將pH=4.0作為后續(xù)反應的最佳pH值。

2.3.2 溫度對高熵材料催化活性的影響由圖3(B)可知，反應體系吸光度隨溫度升高而增大，當溫度為60 ℃時，體系吸光度最大。但是當溫度高于40 ℃時，AA本身不太穩(wěn)定，而且由圖可知，在40 ℃時，體系吸光度并不低。因此，選擇40 ℃為后續(xù)實驗溫度。在圖中還可以看出，在40～70 ℃區(qū)間內，材料仍具有很好的催化活性，證明NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3在較寬的溫度范圍內具有較高的催化活性，這拓寬了它的實際應用范圍。

2.3.3 高熵材料濃度對其催化活性的影響由圖3(C)可知，模擬酶質量濃度達到20 μg/mL時,吸光度趨于平穩(wěn)，因此在接下來的實驗中，模擬酶NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3的濃度皆為20 μg/mL。

圖3 pH(A)、溫度(B)和NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3濃度(C)對NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3類過氧化物酶催化活性的影響Fig.3 Effect of pH (A)，temperature (B) and concentration of NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3 (C) on the peroxidase -like activity of the NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3

2.3.4 底物為H2O2時高熵材料的表觀Km值圖4(A)是TMB濃度對NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3催化活性的影響。由圖可知，體系吸光度隨著TMB濃度增大而增大，后面趨于平緩。實驗選擇TMB的濃度為300 μmol/L。圖4(B)為H2O2濃度對NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3催化活性的影響。由圖可知，體系吸光度隨著H2O2濃度的增大而增大，其變化規(guī)律符合Michaelis-Menten動力學理論。實驗選擇H2O2的濃度為500 μmol/L。圖4(C)為NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3模擬酶對TMB底物的Lineweaver-Burk線性擬合圖，可得NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3對TMB的米氏常數Km=0.213 mmol/L。圖4(D)為NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3模擬酶對H2O2的Lineweaver-Burk線性擬合圖，可得NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3對H2O2的米氏常數Km=0.197 mmol/L。該米氏常數較小，說明H2O2對NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3親和力較強。

圖4 NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3對TMB(A)和H2O2(B)的米氏曲線圖；NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3對TMB(C)和H2O2(D)的Lineweaver-Burk線性擬合圖。其中(A)和(C) H2O2濃度固定為500 μmol/L，改變TMB濃度；(B)和(D)TMB濃度固定為300 μmol/L，改變H2O2濃度Fig.4 Steady-state kinetic assys for NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3.(A) The concentration of H2O2 was 500 μmol/L and TMB concentration varied;(B) The concentration of TMB was 300 μmol/L and H2O2 concentration varied;(C) and (D) the corresponding Lineweaver-Burk plots of the double reciprocal of the Michaelis-Menten equation

2,3.5 米氏常數對比同樣，在相同反應條件下測得HRP對TMB和H2O2底物的穩(wěn)態(tài)動力學常數。Km值越小，表明酶對底物的親和力越強。由表1可知，NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3模擬酶比HRP對TMB和H2O2底物的親和力強，這是由于NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3模擬酶可以提供多個催化活性位點[16]，而HRP分子只可以提供一個反應活性位點。

表1 表觀Km值比較

2.4 NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3比色檢測抗壞血酸

圖5(A)是AA濃度和吸光度的關系曲線，AA濃度為0.5～150 μmol/L，吸光度隨AA濃度的增大而變小，AA濃度到150 μmol/L時,吸光度接近于0，說明此時TMB還沒有參與氧化還原反應。由圖5(B)可以得出，體系檢測AA的檢出限(S/N=3)為0.09 μmol/L，其線性范圍為0.5～60 μmol/L。與其他材料相比(表2)，以NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3構建的比色傳感器檢測AA具有更低的檢出限。

圖5 (A) AA濃度和吸光度的關系曲線；(B) AA在0.5～60 μmol/L濃度范圍內的線性曲線Fig.5 Typical absorption profiles of TMB in the presence of different concentration of AA

表2 其他材料對抗壞血酸檢測的比較

2.5 抗干擾性測試

為了證明NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3-TMB-H2O2體系比色檢測AA具有優(yōu)越的抗干擾能力，將一些物質，如K+、Ca2+、Cl-、尿酸(UA)、丙酮(Ace)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ace)、葡萄糖(Glu)加入體系中，檢測他們的響應。如圖6所示，與空白樣品相比，加入其他物質，體系在波長652 nm處的吸光度稍稍有變化，而加入AA后，體系在652 nm處吸光度急劇下降。說明上述物質對AA的檢測基本不產生影響，NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3-TMB-H2O2體系可以選擇性比色檢測AA。

圖6 干擾物質存在時NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3-TMB-H2O2體系的紫外-可見光譜(K+，Ca2+，Cl-，UA，Ace，Gly，Ace，Glu，AA在體系中濃度都為100 μmol/L)Fig.6 UV-Vis spectra of NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3-TMB-H2O2 system in the presence of some common interference substances (K+,Ca2+,Cl-,UA,Ace,Gly,Ace,Glu,AA with a concentration of 100 μmol/L,respectively)

2.6 實際樣品檢測

在21金維他多維元素片樣品溶液中進行回收實驗，探討了以NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3為基礎構建的靈敏比色傳感器在實際樣品分析中的應用。經計算,該比色傳感器的回收率介于97.8%～100.9%之間,表明該方法構建的傳感器可用于實際樣品中的AA的檢測。

表3 21金維他多維元素片樣品檢測結果

3 結論

本文采用脫合金法合成了納米多孔高熵合金(NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3)。探究發(fā)現該材料具有很好的類過氧化物酶催化活性，在較寬的酸堿和溫度范圍內都具有較高的催化活性。利用高熵合金材料的類過氧化物酶特性，采用比色法檢測AA，其檢出限為0.09 μmol/L。該方法靈敏度高、操作簡易，可應用于AA的實際檢測。