周婷榮， 宋蔓婷， 羅思宇， 鄧 睿， 楊志國(guó)， 渠陸陸， 楊國(guó)海

(江蘇師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，江蘇徐州 221116)

石墨烯是一種獨(dú)特的二維薄膜材料，由密集堆積的碳原子以sp2的雜化方式排列成平面六邊形蜂窩狀網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。2004年，英國(guó)曼徹斯特大學(xué)Novoselov等[1]用微機(jī)械剝離法，成功從石墨中分離出石墨烯。石墨烯獨(dú)特的結(jié)構(gòu)決定了其具有較好的物理和化學(xué)性質(zhì)，在光學(xué)、電學(xué)、熱學(xué)和機(jī)械以及其他方面都表現(xiàn)出優(yōu)異的性能[2 - 5]。石墨烯的制備方法一般包括:微機(jī)械剝離法、液相剝離法、化學(xué)氣相沉積法、氧化還原法和自下而上合成法[6 - 12]等多種方法。目前最常用的是剝離石墨氧化物的化學(xué)還原法，它的成本較低而且可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的制備。石墨烯具有疏水性，且石墨烯納米片之間存在強(qiáng)烈的范德華力[13]，使其趨向于團(tuán)聚甚至重新形成石墨，但石墨烯的一些獨(dú)特性質(zhì)是與它的單層結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的[14]，因此防止石墨烯納米片的團(tuán)聚，使其保持單層的結(jié)構(gòu)是合成高質(zhì)量石墨烯的關(guān)鍵因素。在以往的合成當(dāng)中，通常利用功能化試劑通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)作用來(lái)防止石墨烯的團(tuán)聚[15 - 17]。制備過(guò)程中一般使用水合肼等還原劑，通常具有毒性和腐蝕性，影響了它在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用。近年來(lái)，科研工作者在研究采用環(huán)境友好的方法制備石墨烯等領(lǐng)域取得了一定的進(jìn)展。如利用葡萄糖、明膠、牛血清白蛋白等作為還原劑，同時(shí)不需要其它功能化試劑，得到穩(wěn)定分散的石墨烯溶液[18 - 21]。另一方面，各種碳納米材料憑借其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，成為了生物醫(yī)藥分析領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。相比于其它材料，碳納米材料容易穿過(guò)細(xì)胞膜等特點(diǎn)[22]，使其成為一種理想的藥物載體。氧化石墨烯納米片作為石墨烯的一種衍生物，表面修飾了含氧等官能團(tuán)，增加了其親水性和生物相容性，在藥物傳輸?shù)阮I(lǐng)域的研究取得了一定的進(jìn)展。而石墨烯由于疏水性的特點(diǎn)，其在生理緩沖體系條件下的穩(wěn)定性較差，限制了其在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用[23 - 26]。因此，尋找新的既可做還原劑又可做穩(wěn)定劑的物質(zhì)，建立綠色合成石墨烯的方法，提高其生物相容性，使其可達(dá)到更高的藥物負(fù)載量，實(shí)現(xiàn)藥物的高效運(yùn)輸和可控釋放，具有重要的意義和廣闊的應(yīng)用前景。

已有報(bào)道將半胱氨酸、天冬氨酸等氨基酸用于石墨烯的制備[27,28]，但是所得產(chǎn)物在水或緩沖溶液中容易團(tuán)聚，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。奶粉廉價(jià)易得，環(huán)境友好，其主要成分之一蛋白質(zhì)，含有多種氨基酸殘基等還原性官能團(tuán)[29]，同時(shí)有大量的π-π共軛結(jié)構(gòu)和疏水作用賦予其一定的吸附性[30]，可以有效防止納米片團(tuán)聚。在這些特性的共同作用下，奶粉具有既作還原劑又可作穩(wěn)定劑的潛力，可用于石墨烯的制備并應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究。本文通過(guò)一種簡(jiǎn)便的方法合成了奶粉功能化的石墨烯納米片(mp-GNS)，并證實(shí)了其具有良好的生物相容性和穩(wěn)定性。另外，以羅丹明6G(R6G)為抗癌藥物模型，考察了mp-GNS對(duì)R6G的吸附和釋放行為。結(jié)果表明mp-GNS/R6G對(duì)R6G的釋放具有pH響應(yīng)和緩釋作用，因此，mp-GNS有望成為一種新型的抗癌藥物遞送載體。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

原子力顯微鏡(AFM)圖在Agilent 5500儀器上，SPI3800控制器，采用輕敲模式獲得；透射電子顯微鏡(TEM)在JEOL 2100儀器上進(jìn)行分析，操作電壓為200 kV；掃描電子顯微鏡(SEM)在HitachiS-4800型儀器上獲得照片；X-射線粉末衍射(XRD)的測(cè)定在Shimadzu XRD -6000衍射儀上進(jìn)行；紫外-可見(jiàn)光譜(UV-Vis)圖采用UV-3600(日本)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量；MTT法中的吸光度使用Bio-Rad680酶標(biāo)儀(美國(guó))在490 nm進(jìn)行測(cè)定。

石墨粉、H2SO4(98%)、KMnO4、NaNO3、H2O2(30%)、HCl、BaCl2和二甲亞砜購(gòu)自南京試劑有限公司。阿霉素(DOX)、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)購(gòu)自Sigma-Aldrich。細(xì)胞培養(yǎng)液3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，其它均為分析純?cè)噭?。?shí)驗(yàn)所用去離子水通過(guò)Millipore Autopure系統(tǒng)得到。

奶粉(雀巢脫脂成人奶粉)購(gòu)自當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 氧化石墨烯(GO)的合成

采用Hummers的方法[31]合成GO。將250 mL圓底燒瓶浸入冰水浴中，向燒瓶中加入濃H2SO4、4 g石墨粉和2 g NaNO3的混合物。在劇烈攪拌的同時(shí)，向懸浮液中分多次添加12 g KMnO4(小心控制加入速率)，反應(yīng)過(guò)程中溫度始終保持在20 ℃以下。在不斷攪拌下將溶液升溫至40 ℃。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行溶液逐漸變稠，呈現(xiàn)棕灰色，氣泡逸出的速率明顯下降。35 min后，邊攪拌邊緩慢加入約180 mL去離子水，有大量氣泡逸出，經(jīng)過(guò)20 min后，顯棕色。接著加入H2O2至溶液呈亮黃色。在溶液保持余熱的時(shí)候過(guò)濾，得到一個(gè)黃棕色的濾餅，用5%的HCl和去離子水洗滌，從而制得GO。

1.3 mp-GNS的制備

將10 mL 0.5 mg/mL剝離的GO加入盛有30 mL去離子水的圓底燒瓶中，充分?jǐn)嚢杈鶆颍尤? g奶粉，滴加NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至中性，升溫至80 ℃攪拌30 min使其混合均勻。將混合物在油浴環(huán)境下保持95 ℃恒溫加熱攪拌6 h。將得到的黑色反應(yīng)溶液冷卻至室溫，經(jīng)過(guò)多次離心洗滌后，備用。

1.4 R6G的負(fù)載和釋放

為了將熒光探針R6G裝載在mp-GNS上，先將R6G和不同量的mp-GNS溶液分別混合，室溫振蕩反應(yīng)2 h，離心洗滌后，用熒光光譜儀測(cè)量上清液中R6G的熒光強(qiáng)度變化，根據(jù)計(jì)算得到飽和吸附量。為了研究R6G從mp-GNS/R6G復(fù)合物上的釋放過(guò)程，將飽和吸附的mp-GNS/R6G復(fù)合物，加入到不同pH的緩沖溶液或無(wú)水乙醇中。在37 ℃振蕩不同的時(shí)間，離心分離后，用熒光光譜儀測(cè)定上清液中熒光強(qiáng)度的變化，研究不同pH條件下復(fù)合物上R6G的釋放行為。

1.5 細(xì)胞毒性和藥物運(yùn)輸

將DOX與不同量的mp-GNS溶液分別混合均勻，在室溫下振蕩2 h，離心10 min后，在480 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，于500～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定上清液中DOX的熒光光譜，確定DOX的飽和吸附量。將得到的mp-GNS/DOX復(fù)合物在超聲輔助下重新分散到水中，于4 ℃下保存，備用。

細(xì)胞增長(zhǎng)的抑制通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)獲得。即在96孔板中接入100 μL 1.0×104cells/孔的MCF-7細(xì)胞溶液，接著加入一系列濃度梯度的mp-GNS、DOX和mp-GNS/DOX，分別培養(yǎng)24 h和48 h。通過(guò)噻唑藍(lán)方法驗(yàn)證細(xì)胞存活情況，為了保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，需要重復(fù)4次。對(duì)照實(shí)驗(yàn)在其他條件都相同時(shí)，以5 μL MTT(5 mg/mL)代替復(fù)合物，在對(duì)照孔中培養(yǎng)4 h，然后離心10 min。保留滴液，接著在每個(gè)孔中加入二甲基亞砜，于振蕩培養(yǎng)箱中充分振蕩后，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)570 nm下測(cè)量得光強(qiáng)度值，通過(guò)計(jì)算得到細(xì)胞相對(duì)存活率。

2 結(jié)果與討論

2.1 mp-GNS的表征

本實(shí)驗(yàn)由Hummer法制得GO，然后以奶粉為還原劑和穩(wěn)定劑得到石墨烯，如圖1所示。反應(yīng)過(guò)程中，奶粉釋放出還原性的自由電子，然后自由電子對(duì)GO進(jìn)行還原。反應(yīng)的最終產(chǎn)物為CO2和H2O等無(wú)毒無(wú)害小分子，同時(shí)未反應(yīng)的奶粉以及氧化得到的有機(jī)小分子均安全無(wú)毒且容易通過(guò)水洗除去。

圖1 mp-GNS的制備示意圖Fig.1 Illustration of the green synthesis of mp-GNS

圖2(A)中曲線a為GO的吸收曲線，在231 nm處出現(xiàn)吸收峰，是C=C的π-π*躍遷，另外300 nm處的肩峰是由于C=O的n-π*躍遷，表明生成了GO；曲線b為mp-GNS的吸收曲線，通過(guò)奶粉還原GO之后，吸收峰由231 nm紅移至267 nm處，而267 nm處的吸收峰說(shuō)明GO被還原成了石墨烯，這是由于石墨烯的大π鍵恢復(fù)導(dǎo)致的；同時(shí)300 nm左右處的肩峰消失，則進(jìn)一步說(shuō)明含氧官能團(tuán)被除去[32]。

圖2(B)和2(C)分別是對(duì)mp-GNS納米片通過(guò)AFM進(jìn)行的形貌的表征和厚度分析圖。mp-GNS的厚度明顯比純石墨烯納米片的理論值要厚[16]，這是由于奶粉吸附到石墨烯納米片上導(dǎo)致mp-GNS的厚度有所增加，mp-GNS呈片層狀結(jié)構(gòu)，片層間距增大。說(shuō)明奶粉的修飾有效阻止了石墨烯的團(tuán)聚，拉開(kāi)了層間距，因此mp-GNS具有較好的分散性和穩(wěn)定性。

如圖2(D)所示，通過(guò)對(duì)mp-GNS納米片的TEM進(jìn)行形貌表征分析，可以觀察到mp-GNS呈半透明薄紗狀，紋理清晰，表面存在一些褶皺，但沒(méi)有發(fā)生團(tuán)聚。表明奶粉均勻牢固地附著在石墨烯片層上，保持了mp-GNS的穩(wěn)定性。

如圖2(E)所示，當(dāng)石墨被氧化后，在2θ=10.04°處出現(xiàn)了GO的晶面衍射峰，表明生成了氧化石墨晶體結(jié)構(gòu)。當(dāng)氧化石墨摻雜奶粉并還原后，在2θ為10.4°處的衍射峰消失，并在2θ為24°左右處出現(xiàn)新的衍射峰，表明GO被還原成了石墨烯[15]。石墨烯的衍射峰變寬，強(qiáng)度減弱，主要是由于奶粉的加入阻礙了石墨烯片層團(tuán)聚現(xiàn)象的產(chǎn)生，制備成較多為單層結(jié)構(gòu)的石墨烯，使其層間距增加，而導(dǎo)致衍射現(xiàn)象不明顯[33]。

同時(shí)，為了探究石墨烯納米片在各種環(huán)境下的穩(wěn)定性，將GO和mp-GNS分別在水和PBS中于室溫下培養(yǎng)24 h。通過(guò)圖2(F)和2(G)可以看出，GO在水中呈現(xiàn)出較好的分散性和穩(wěn)定性，但在PBS中發(fā)生了嚴(yán)重的團(tuán)聚；而mp-GNS在水中和PBS中都表現(xiàn)出好的分散性和穩(wěn)定性，且在觀察時(shí)間內(nèi)無(wú)任何團(tuán)聚現(xiàn)象。這就說(shuō)明奶粉吸附到石墨烯表面形成mp-GNS，有效改變了石墨烯納米片表面的疏水性，使納米片不易發(fā)生團(tuán)聚，且在緩沖溶液環(huán)境下能夠長(zhǎng)時(shí)間的保持穩(wěn)定。

圖2 (A)GO(a)和mp-GNS(b)的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖;(B)mp-GNS的AFM圖；(C)厚度分析圖；(D)TEM圖像;(E)GO(a)和mp-GNS(b)的XRD譜圖;(F)GO和mp-GNS(G)在水和PBS中的穩(wěn)定性比較Fig.2 (A) UV-Vis absorption spectra of GO (a) and mp-GNS (b);(B) AFM image of mp-GNS；(C) Cross-section analysis along with the line in AFM image of mp-GNS;(D) TEM image of mp-GNS;(E) XRD patterns of GO (a) and mp-GNS (b);(F) Dispersibility of GO and mp-GNS (G) in water and PBS

2.2 R6G的負(fù)載和釋放

為了研究mp-GNS作為藥物載體的作用，選擇R6G作為熒光探針對(duì)mp-GNS進(jìn)行標(biāo)記。R6G是一種陽(yáng)離子染料，而mp-GNS呈電負(fù)性，它們通過(guò)靜電作用吸引在一起，形成mp-GNS/R6G復(fù)合物，如圖3(A)所示。實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)mp-GNS的不同加入量在550 nm下對(duì)R6G的熒光猝滅來(lái)監(jiān)控整個(gè)負(fù)載過(guò)程。隨著mp-GNS加入量的增加，上清液中的熒光強(qiáng)度逐漸減小，為激發(fā)態(tài)的R6G和mp-GNS表面之間發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移從而導(dǎo)致的熒光猝滅，說(shuō)明了R6G已經(jīng)負(fù)載在mp-GNS上[34]。在mp-GNS加入量為100 μL時(shí)，R6G達(dá)到了飽和吸附量。通過(guò)計(jì)算，R6G的吸附容量為85 μg/mg。R6G在mp-GNS上具備高度負(fù)載能力可以歸因?yàn)閙p-GNS具有較高的比表面積，以及R6G與mp-GNS之間存在強(qiáng)烈的π-π共軛作用和氫鍵相互作用[35]。

進(jìn)一步研究了mp-GNS/R6G在不同pH緩沖溶液中的釋放性行為。釋放的R6G由于遠(yuǎn)離mp-GNS，不再發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，因而R6G熒光得到恢復(fù)[36]。如圖3(B)所示，R6G在不同pH值時(shí)都經(jīng)歷了一個(gè)持續(xù)釋放的過(guò)程，并且在開(kāi)始階段釋放速度較快，幾乎與時(shí)間呈指數(shù)型關(guān)系，后面釋放速度趨于平緩。但是在不同的pH值下R6G的釋放量不同。在pH=7.4時(shí)，R6G的釋放速度很慢，10 h只釋放了約20%，40 h后釋放量為27%。而pH=4.6和pH=2.0時(shí)，10 h內(nèi)R6G的釋放量分別達(dá)到32%和50%，之后R6G的釋放量隨時(shí)間的增加而緩慢減少。這表明在相同的時(shí)間內(nèi)，酸性條件下R6G的釋放量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于中性條件下的釋放量。

圖3 (A)mp-GNS(1.0 mg/mL)的加入量(a-j：0，10，20，30，40，50，60，80，100，120 μL)對(duì)R6G(4 μg/mL)的熒光光譜；(B)mp-GNS/R6G在pH=2.0、4.6和7.4下的釋放量；(C)mp-GNS/R6G在乙醇(a)和水溶液(b)中的熒光光譜Fig.3 (A)Fluorescence spectra of R6G solution (4 μg/mL) with increasing amounts of mp-GNS with a concentration of 1.0 mg/mL (from a to j:0,10,20,30,40,50,60,80,100,120 μL) using the excitation wavelength of 350 nm;(B) R6G release profiles for mp-GNS/R6G measured in PBS at pH 2.0,4.6 and 7.4 at 37 ℃;(C) Fluorescence spectra of mp-GNS/R6G in ethanol (a) and water (b)

為了分析在不同極性溶液中mp-GNS/R6G的釋放行為，以乙醇為介質(zhì)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。如圖3(C)所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mp-GNS/R6G在水溶液中發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象(b)，經(jīng)過(guò)乙醇處理后溶液熒光強(qiáng)度得以恢復(fù)(a)。熒光猝滅現(xiàn)象表明R6G和mp-GNS之間除了靜電引力和氫鍵相互作用之外，還存在著強(qiáng)烈的π-π共軛作用，而熒光強(qiáng)度的恢復(fù)則說(shuō)明用乙醇處理之后，R6G和mp-GNS之間的氫鍵發(fā)生了解離，使得R6G在乙醇中的溶解度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在水中的溶解度，導(dǎo)致R6G在乙醇中能很好的釋放卻很難負(fù)載到mp-GNS表面。細(xì)胞中富含有機(jī)化合物如多糖，蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等，它們可以誘導(dǎo)mp-GNS/R6G解離，使其熒光得以恢復(fù)。這種誘導(dǎo)釋放過(guò)程證明mp-GNS是一種在細(xì)胞內(nèi)能夠承擔(dān)運(yùn)輸作用的絕佳材料[37]。

2.3 藥物負(fù)載和傳輸分析

為了評(píng)估m(xù)p-GNS對(duì)真實(shí)藥物的運(yùn)載能力，將DOX負(fù)載在mp-GNS上，制備得到mp-GNS/DOX復(fù)合物，利用與mp-GNS/R6G類(lèi)似的方法考察其飽和吸附量。圖4(A)所示為不同mp-GNS加入量對(duì)DOX的熒光猝滅結(jié)果，產(chǎn)生最大DOX熒光猝滅的mp-GNS的體積為100 μL，此時(shí)DOX恰好在mp-GNS上達(dá)到飽和吸附。通過(guò)計(jì)算，DOX的吸附容量是170 μg/mg。

為了考察mp-GNS的細(xì)胞毒性，將MCF-7細(xì)胞分別與不同濃度梯度的mp-GNS溶液于37 ℃下分別培養(yǎng)24 h和48 h，然后用MTT測(cè)定相對(duì)細(xì)胞活力(圖4(B))。結(jié)果表明，所制備的mp-GNS對(duì)細(xì)胞的毒性較低，且具有良好生物相容性，有望成為一種藥物輸送的理想納米載體。

以游離的DOX和mp-GNS/DOX溶液作對(duì)比，如圖4(C)所示，在相同條件下，mp-GNS/DOX的毒性要低于DOX，這與mp-GNS/DOX上DOX的釋放過(guò)程有關(guān)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)吞作用發(fā)生之后，DOX逐漸從mp-GNS/DOX上釋放出來(lái)，表現(xiàn)出緩釋效果，表明奶粉在藥物釋放過(guò)程中起到了調(diào)節(jié)作用。由于所得物質(zhì)可以控制藥物在胞內(nèi)的釋放速度，使藥物在一定時(shí)間內(nèi)維持穩(wěn)定的水平，因此具有較好的臨床治療效果前景。

圖4 (A)mp-GNS(1.0 mg/mL)的加入量(a-j：0，10，20，30，40，50，60，80，100，120 μL)對(duì)DOX(8 μg/mL)的熒光光譜；(B)不同濃度的mp-GNS對(duì)MCF-7細(xì)胞毒性的影響；(C)DOX和mp-GNS/DOX對(duì)MCF-7細(xì)胞毒性的影響Fig.4 (A) Fluorescence spectra of DOX solution (8 μg/mL) with increasing amounts of mp-GNS with a concentration of 1.0 mg/mL (from a to j:0,10,20,30,40,50,60,80,100,120 μL) using the excitation wavelength of 350 nm;(B) Relative cell viability of MCF-7 cells treated with different concentrations of mp-GNS after 24 h and 48 h incubation;(C) Cytotoxicity of free DOX and mp-GNS/DOX to MCF-7 cells after 24 h and 48 h incubation

3 結(jié)論

本文采用一種簡(jiǎn)單綠色的合成方法，以廉價(jià)易得的奶粉為功能化試劑，成功制備了mp-GNS。奶粉有效發(fā)揮了還原的作用，同時(shí)作為穩(wěn)定劑防止了石墨烯納米片的團(tuán)聚。結(jié)合石墨烯大的比表面積和良好的生物相容性等特點(diǎn)，mp-GNS可被用于藥物傳輸研究。藥物吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，mp-GNS對(duì)R6G具有較好的吸附容量，同時(shí)mp-GNS/R6G對(duì)R6G的釋放具有pH響應(yīng)性和緩釋作用。另外，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，制備的mp-GNS毒性低，可以作為一種理想的載體用于細(xì)胞內(nèi)的藥物運(yùn)輸、生物成像等其他方面。隨著研究的不斷深入，將還原效果好且綠色的還原劑用于石墨烯的功能化已成為研究趨勢(shì)。本工作為制備高生物相容性和水溶性的石墨烯的合成和應(yīng)用開(kāi)辟了新的道路，具有重要的意義。