萬嘉峻， 孟凡華， 代先東， 范崇旭， 曹 瑛*

(國民核生化災害防護國家重點實驗室，北京 102205)

海洋生物貝類毒素特指由海洋生物產(chǎn)生、能夠在海洋生物尤其是雙殼貝類中富集的一類小分子有毒化學物質(zhì)[1]，可對其他生物包括人類產(chǎn)生危害。這類海洋生物貝類毒素根據(jù)其溶解性可分為水溶性貝類毒素和脂溶性貝類毒素，其中脂溶性貝類毒素主要為含聚醚結(jié)構(gòu)的化合物，具有一定的熱穩(wěn)定性，易溶于甲醇、乙醚等有機溶劑[2]。目前，常見的脂溶性貝類毒素主要有大田軟海綿酸毒素(Okadaic Acid,OA)，以及其衍生物鰭藻毒素(Dinophysistoxin,DTX)組、蝦夷扇貝毒素(Yessotoxin,YTX)組、原多甲藻酸毒素(Azaspiracid,AZA)組、蛤毒素(Pectenotoxin,PTX)組、環(huán)亞胺毒素(Cyclic Imine,CI)組[3]，結(jié)構(gòu)如圖1所示。貝類毒素易通過食物鏈傳遞并累積在濾食性的雙殼類軟體動物中，消除半衰期長達數(shù)十天甚至數(shù)月，給消費者帶來潛在危害[4]。美國對OA組和AZA組毒素的安全限量為160 μg/kg[5]，歐盟在此基礎上還設置了PTX組和YTX組的安全限量，分別為160 μg/kg(PTX)和3 750 μg/kg(YTX)[6]。我國對貝類毒素在食品中安全限量的相關(guān)研究起步較晚，目前國家標準以毒性為計量單位，將OA組毒素安全限量設定為0.05 MU/g[7]。

圖1 常見脂溶性貝類毒素的基本結(jié)構(gòu)Fig.1 The basic structure of common lipophilic shellfish toxin

目前脂溶性貝類毒素分析方法主要有小鼠毒性分析法、細胞毒性分析法、免疫分析法、高效液相色譜法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法[8]。其中，HPLC-MS/MS法在貝類毒素分析中具有靈敏度高、特異性強、分析時間短、能夠準確定量不同毒素組分等特點[9]，被各國推薦用作脂溶性貝類毒素檢測的標準方法。2015年，歐盟制定了HPLC-MS/MS法測定軟體動物中脂溶性貝類毒素的統(tǒng)一標準操作程序[10]，我國規(guī)定HPLC-MS/MS法為測定貝類中腹瀉性貝類毒素的標準方法[11]。近年來，隨著新材料與新方法的引入，對脂溶性貝類毒素分析檢測方法的研究越來越多，檢測方法也在不斷完善[12 - 15]。

HPLC-MS/MS法在分析脂溶性貝類毒素時具有靈敏度高、檢出限低、重復性好和檢測速度快等特點，但貝類基質(zhì)嚴重影響目標物的質(zhì)譜響應，導致樣品預處理流程復雜、耗時長，使得該方法在應用中受到一定限制。本研究采用甲醇提取，利用正己烷液-液萃取除油脂，結(jié)合固相萃取柱富集凈化，建立了HPLC-MS/MS同時檢測貝類中10種脂溶性貝類毒素的方法。10種脂溶性貝類毒素包括OA組的OA、DTX1、DTX2，YTX組的YTX、hYTX，AZA組的AZA1、AZA2、AZA3，CI組的米氏裸甲藻毒素(Gymnodimine,GYM)以及PTX組的PTX2，涵蓋了目前海產(chǎn)品中常見的脂溶性貝類毒素。該方法前處理后的溶液更加澄清，減少了對液相色譜和質(zhì)譜儀的污染，降低了基質(zhì)干擾，提高了目標物的質(zhì)譜響應。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

Agilent 1260-6400Triple Quad高效液相色譜-質(zhì)譜儀(美國，Agilent公司)；12位固相萃取裝置(美國，Agilent公司)；RVC 2-18 CD plus真空離心濃縮儀(德國，Christ公司)；Lab Dancer旋渦混合器(德國，IKA公司)；Sigma 3-16PK高速離心機(德國，Sigma公司)；Oasis HLB固相萃取小柱(60 mg/3mL，美國Waters公司)、Strata-X固相萃取小柱(30 mg/3mL，美國Phenomenex公司)、Bond Elut-C18固相萃取小柱(200 mg/3mL，美國Agilent公司)。

脂溶性貝類毒素標準品：AZA1(1.30±0.07 μg/mL)、AZA2(1.22±0.06 μg/mL)、AZA3(1.18±0.05 μg/mL)、PTX2(4.40±0.13 μg/mL)、GYM(2.50±0.13 μg/mL)、YTX(5.10±0.24 μg/mL)、hYTX(5.75±0.31 μg/mL)、OA(8.40±0.4 μg/mL)、DTX1(7.80±0.5 μg/mL)、DTX2(3.80±0.2 μg/mL)，均購自加拿大海洋生物科學研究所；甲酸、甲酸銨(質(zhì)譜純，德國CNW公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國Sigma公司)；氨水、正己烷(分析純，上海麥克林生化科技有限公司)。實驗用水均來自Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

實驗所用貝類樣品購買于海產(chǎn)品市場。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理用清水沖洗新鮮貽貝外殼，去除雜質(zhì)，切開閉殼肌，取出全部軟體組織并用超純水沖洗，去除泥沙后，瀝干水分并充分均質(zhì)。稱取樣品1.0±0.05 g于50 mL離心管中，加入4.5 mL甲醇，渦旋振蕩2 min，10 000 g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至50 mL離心管中；向沉淀中加入4.5 mL甲醇，重復提取1次，合并兩次上清液，加超純水定容至15 mL并混勻，加入15 mL正己烷，渦旋振蕩2 min，靜置待其分層，移除正己烷層，再加入15 mL正己烷，重復除油一次，用超純水定容至35 mL。

固相萃取(SPE)柱依次用3 mL甲醇、3 mL 25%甲醇水溶液進行活化，將提取液緩慢上樣后，用3 mL 25%甲醇水溶液淋洗，6 mL 1%氨水-甲醇洗脫，合并洗脫液，真空離心濃縮至干，1 mL 30%乙腈水溶液充分溶解，10 000 g離心10 min，取上清液進行HPLC-MS/MS檢測。

1.2.2 高效液相色譜條件Kinetex XB-C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，2.6 μm)；流動相A為水，B為95%乙腈水溶液，均含0.1%甲酸和10.0 mmol/L甲酸銨。正離子模式梯度下洗脫程序：0～3.0 min，30%～90%B；3.0～9.0 min，90%B；9.0～11.0 min，90%～30%B，11.0～16.0 min，30%B；負離子模式下梯度洗脫程序：0～1.0 min，40%～50%B；1.0～8.0 min，50%～70%B，8.0～10.0 min，70%B，10.0～12.0 min，70%～40%B，12.0～16.0 min，40%B。進樣體積10.0 μL；柱溫30.0 ℃；流速0.200 mL/min。

1.2.3 質(zhì)譜條件電噴霧電離(ESI)源；正負離子模式掃描；多反應監(jiān)測模式(MRM)檢測；毛細管電壓4.0 kV；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流量：10 L/min；霧化氣壓力：103.42 kPa；分辨率：單位分辨。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

AZA1、AZA2、AZA3、PTX2、GYM采用正離子模式；OA、DTX1、DTX2、YTX、hYTX采用負離子模式。使用200 μg/L毒素標準溶液對質(zhì)譜條件進行優(yōu)化，分別在正、負離子模式下進行全掃描，得到目標化合物的分子離子峰，將其作為母離子，以目標物響應為參數(shù)優(yōu)化碎裂電壓(Fragmentor)。對選取母離子進行二級質(zhì)譜分析，以豐度高的兩個碎片離子分別作為定性與定量分析的特征離子對，再以確定的母離子和子離子進行MRM掃描，優(yōu)化碰撞能。10種毒素經(jīng)優(yōu)化后的質(zhì)譜條件如表1所示。

表1 10種脂溶性貝類毒素的質(zhì)譜多重反應監(jiān)測儀器條件

2.2 色譜條件優(yōu)化

文獻報道的脂溶性貝類毒素的HPLC-MS/MS檢測，流動相多采用含甲酸-甲酸銨的水-乙腈體系或含氨水的水-乙腈體系。比較兩種流動相的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含氨水的水-乙腈體系的流動相用于正離子模式時，會導致離子峰強度顯著降低；含0.1%甲酸-10.0 mmol/L甲酸銨的水-乙腈溶液作為流動相時，10種目標物均出峰，且峰形良好。在選定的10種脂溶性貝類毒素中，OA與DTX2的特征離子對完全相同，需要完全分離才能實現(xiàn)兩者的定性與定量分析。本研究通過調(diào)整流動相比例，實現(xiàn)了OA和DTX2的完全分離。另外，YTX和hYTX的保留時間相近，可以通過質(zhì)譜靶向檢測實現(xiàn)對兩者的定量分析。

10種脂溶性貝類毒素在優(yōu)化后的色譜條件下的色譜圖見圖2。

圖2 10種脂溶性貝類毒素定量離子MRM色譜圖(a.正離子模式下提取離子流圖；b.負離子模式下提取離子流圖)Fig.2 Quantitative ion MRM chromatogram of 10 lipophilic shellfish toxins(a.Extracting ion chromatogram in positive ionization;b.Extraction ion chromatogram in negative ionization)

2.3 除油條件優(yōu)化

甲醇提取脂溶性貝類毒素的過程中，大量脂質(zhì)、色素和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)同時進入提取液，一些低極性的雜質(zhì)在后續(xù)SPE凈化過程中嚴重影響SPE效率。因此，本研究引入正己烷液-液萃取過程，在樣品進行SPE前，預先去除提取液中的低極性雜質(zhì)，以提高SPE效率。本研究均以AZA1(1.30 μg/kg)為代表優(yōu)化除油條件，然后將優(yōu)化后的條件應用到其他毒素檢測中，均有較好的回收率。首先，為提高目標物的回收率，將甲醇提取液用水稀釋至100%、80%、60%后再進行液-液萃取凈化。結(jié)果表明，隨著甲醇濃度的降低，脂溶性貝類毒素回收率呈增加趨勢(圖3a)，60%甲醇水溶液得到AZA1的平均回收率達90.8%。然后，考察萃取次數(shù)對脂溶性貝類毒素回收率的影響，結(jié)果表明兩次萃取后即可得到較高的回收率，增加萃取次數(shù)不能明顯提高回收率(圖3b)，反而會因為操作的增多導致目標物流失。

圖3 (a)提取液甲醇濃度對回收率的影響；(b)正己烷萃取次數(shù)對回收率的影響Fig.3 (a)Effect of methanol concentration of extraction on recovery;(b)Effect of extraction times of n -hexane on recovery

2.4 SPE富集凈化條件的優(yōu)化

本研究選擇常見的三種SPE柱，其填料分別為C18、HLB、Strata-X，比較它們的富集凈化效果，結(jié)果如圖4所示。實驗結(jié)果表明，HLB柱對10種脂溶性貝類毒素的平均回收率均高于C18、Strata-X柱，且經(jīng)過HLB柱處理后的溶液更清澈透明。因此，本實驗最終采用Oasis HLB SPE柱進行富集凈化。本研究所采用的SPE柱易得、便宜、操作方便，且富集凈化效果與特殊填料SPE柱相近[16]。

圖4 不同固相萃取柱對回收率的影響Fig.4 Effect of different solid phase extraction cartridges on recovery

本研究以AZA1(1.30 μg/kg)為代表對SPE過程中的上樣、淋洗進行優(yōu)化。實驗通過調(diào)整上樣體系中甲醇含量，直接進行SPE凈化的方法(即SPE大體積上樣)，既保證了目標物的有效富集，又節(jié)省了上樣前的濃縮時間，兼顧了操作的連續(xù)性與穩(wěn)定性，降低了操作要求。最終確定的最佳上樣條件為25%甲醇，淋洗條件為3 mL 25%甲醇。根據(jù)文獻報道[17]，洗脫液酸堿性會影響洗脫效果。本實驗通過添加1%甲酸或1%氨水改變洗脫液酸堿性，比較不同酸堿條件下的回收率。結(jié)果表明，10種脂溶性貝類毒素在使用堿性洗脫液時的回收率明顯高于酸性洗脫液(圖5)。因此，本研究選擇1%氨水甲醇溶液作為洗脫條件。

圖5 SPE洗脫液酸堿性對脂溶性貝毒回收率的影響Fig.5 Effect of acidity and alkalinity of SPE eluent on the recovery of lipophilic shellfish toxins

2.5 方法學考察

2.5.1 基質(zhì)效應本研究以目標物在基質(zhì)與溶劑中的響應比考察方法的基質(zhì)效應。圖6是貽貝樣品中，經(jīng)本方法凈化處理和參考歐盟方法[10]處理后(即無正己烷萃取和SPE凈化)的基質(zhì)效應比較。結(jié)果表明未經(jīng)過凈化處理的貽貝樣品對OA組的3種毒素產(chǎn)生了輕微的抑制效應，對其余7種毒素產(chǎn)生了嚴重的抑制效應；經(jīng)過本方法凈化處理后，抑制效應得到改善，顯著降低了基質(zhì)對目標物質(zhì)譜響應的干擾，提高了方法的靈敏度。

圖6 正己烷除油和SPE對基質(zhì)效應的影響Fig.6 Matrix effect after SPE and n-hexane extraction

2.5.2 線性范圍與檢測限按“1.2.1”處理空白貽貝樣品，得到空白基質(zhì)。添加各脂溶性貝類毒素標準溶液，配制各脂溶性貝類毒素的工作溶液，以峰面積為縱坐標，脂溶性貝類毒素添加濃度為橫坐標繪制標準曲線。10種脂溶性貝類毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)(R2)見表2。結(jié)果表明，10種分析物在相應的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)R2均大于0.996，線性良好，滿足儀器分析的需要。方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別以3倍信噪比和10倍信噪比計算，結(jié)果見表2。

表2 脂溶性貝類毒素的線性關(guān)系、檢測限(LOD)與定量限(LOQ)

其中YTX和hYTX的LOD、LOQ略高于其他脂溶性貝毒。分析原因：一是YTX組毒素含有磺酸基，與其他脂溶性貝類毒素結(jié)構(gòu)上差異較大，因此所使用的通用前處理條件對YTX和hYTX的回收率偏低；二是YTX和hYTX保留時間一致，離子化過程存在競爭，效率偏低。兩個因素可能會導致YTX系列的檢出限較高，但該方法的定量限遠小于歐盟制定的限量標準(3 750 μg/kg)，因此使用本研究中的通用前處理條件能夠滿足脂溶性貝類毒素的檢測要求。

2.5.3 回收率及精密度以1.00 g貽貝樣品為空白基質(zhì)，添加低、中、高三種不同濃度的脂溶性貝類毒素標準溶液作為質(zhì)量控制樣品，每個質(zhì)量控制樣品平行實驗6次，計算各分析物對應的平均回收率和精密度，如表3所示。10種分析物的平均回收率為77.54%～116.9%；相對標準偏差(RSD)為1.07%～12.3%。

表3 10種脂溶性貝類毒素的平均回收率和相對標準偏差(RSD)(n=6)

(續(xù)表3)

2.5.4 實際樣品分析為考察方法的適應性和實用性，采用本方法對市場上購買的6種貝類(貽貝、文蛤、青蛤、縊蟶、花蛤和扇貝)進行分析檢測。結(jié)果顯示OA組、YTX組和PTX2在所有樣品中均未檢出，但是在4個樣品(花蛤、青蛤、文蛤和扇貝)中檢出了GYM(0.461～1.610 μg/kg)，在花蛤樣品中檢出了AZA1(0.400 μg/kg)。陽性貝類樣品檢測結(jié)果如圖7所示，均低于脂溶性貝類毒素安全限量。

圖7 陽性貝類樣品色譜圖Fig.7 Chromatograms of positive shellfish sample

3 結(jié)論

采用甲醇提取，正己烷除油脂，HLB固相萃取柱富集凈化，使用HPLC-MS/MS法檢測，建立了貝類樣品中10種脂溶性貝類毒素的同時定量分析方法。該方法回收率高、檢出限低、線性良好，能夠?qū)崿F(xiàn)目標物的痕量檢測。將該方法應用于6種實際貝類樣品的檢測，部分樣品呈陽性，含量均低于毒素安全限量。該方法為海產(chǎn)品安全的檢測方法提供參考。