王曉英 邢宇婷 陳潤(rùn)植 賈雪琦 吳繼華 江進(jìn) 李連勇 常國(guó)慶?

1) (戰(zhàn)略支援部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心,消化科,北京 100101)

2) (中國(guó)科學(xué)院物理研究所,光物理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100190)

3) (戰(zhàn)略支援部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心,病理科,北京 100101)

由飛秒激光驅(qū)動(dòng)的非線性光學(xué)顯微鏡技術(shù)在醫(yī)學(xué)組織成像中具有很多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),包括多種成像模態(tài)、高對(duì)比度、高分辨率和無(wú)標(biāo)記的深層光學(xué)切片能力等.由于缺乏波長(zhǎng)可靈活調(diào)諧的飛秒激發(fā)光源,導(dǎo)致在多模態(tài)成像的同時(shí)難以兼顧每種模態(tài)的對(duì)比度,從而制約了非線性光學(xué)顯微鏡在醫(yī)學(xué)診斷中的廣泛應(yīng)用.本文采用基于自相位調(diào)制光譜選擇的光纖激光光源,獲得了中心波長(zhǎng)在990—1110 nm 范圍內(nèi)可調(diào)諧的高能量飛秒脈沖,并用于驅(qū)動(dòng)非線性光學(xué)顯微鏡.采用990 nm 的飛秒脈沖,通過(guò)雙光子激發(fā)熒光和二倍頻對(duì)胃組織成像,進(jìn)一步結(jié)合圖像拼接技術(shù)成功獲得了胃組織的雙模態(tài)大視場(chǎng)圖像;利用1110 nm 的飛秒脈沖,實(shí)現(xiàn)了無(wú)標(biāo)記自發(fā)熒光多倍頻顯微鏡技術(shù),同時(shí)高效激發(fā)了胃組織的雙光子激發(fā)熒光、三光子激發(fā)熒光、二倍頻和三倍頻信號(hào),獲得了胃組織的多模態(tài)圖像.

1 引言

非線性光學(xué)顯微成像具有亞微米水平的光學(xué)分辨率和光切片的能力,已經(jīng)成為重要的生物醫(yī)學(xué)組織成像手段[1].非線性光學(xué)顯微成像通過(guò)超短脈沖與生物組織之間相互作用可以實(shí)現(xiàn)多種非線性無(wú)標(biāo)記成像過(guò)程,包括雙光子激發(fā)熒光(two-photon excitation fluorescence,2PEF)、三光子激發(fā)熒光 (three-photon excitation fluorescence,3PEF)[2-13]、二倍頻(second-harmonic generation,SHG)[13-20]、三倍頻(third-harmonic generation,THG)[12,13,15-17,19,20]、相干反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-Stokes Raman scattering,CARS)[21-23]和受激拉曼散射(stimulated Raman scattering,SRS)[24,25].SHG 過(guò)程對(duì)有序的非中心對(duì)稱(chēng)分子結(jié)構(gòu)具有高度特異性,因此可為某些細(xì)胞和組織成分(如膠原蛋白、微管和肌球蛋白)提供清晰的成像對(duì)比度[13-20].THG 源于光學(xué)不均勻性,對(duì)組織邊界的折射率變化特別敏感,適合對(duì)透明物質(zhì)的界面和細(xì)胞等細(xì)微結(jié)構(gòu)的輪廓成像[13,15-17,19,20].多光子激發(fā)熒光通過(guò)獲取生物樣品的各種內(nèi)源性物質(zhì)的自發(fā)熒光實(shí)現(xiàn)成像,這些內(nèi)源性物質(zhì)包括視黃醇、輔酶、維生素D、黑色素、彈性蛋白和膠原蛋白等,其中通過(guò)收集還原的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)以及黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)這兩種內(nèi)源性物質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)自發(fā)熒光,可以在圖像中分辨出細(xì)胞[2-9,13].基于分子振動(dòng)的CARS和SRS 成像在獲取圖像的同時(shí)還可以識(shí)別不同的分子結(jié)構(gòu)[21-25].

在無(wú)標(biāo)記成像中,利用上述多種非線性成像過(guò)程實(shí)現(xiàn)多模態(tài)成像有兩種方案.一種是采用不同的激發(fā)條件依次實(shí)現(xiàn)多種非線性成像過(guò)程[26-28].由于該種方案需要變換激發(fā)條件,所以很難實(shí)現(xiàn)快速成像;并且激光長(zhǎng)時(shí)間聚焦到一個(gè)位置會(huì)增加樣品光損壞的風(fēng)險(xiǎn);另外在變換激發(fā)條件時(shí)樣品的移動(dòng)導(dǎo)致多個(gè)模態(tài)的圖像無(wú)法完美重疊而產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)偽影.另一種方案是以單個(gè)激發(fā)配合多個(gè)檢測(cè)通道,在單次激發(fā)條件下同時(shí)實(shí)現(xiàn)多種非線性成像過(guò)程[13,29-32].該方案雖然能避免出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)偽影和光損傷,但是由于無(wú)法對(duì)每個(gè)信號(hào)獨(dú)立優(yōu)化,所以難以高效激發(fā)多個(gè)非線性成像過(guò)程.為了解決該問(wèn)題,必須選擇波長(zhǎng)合適的超快驅(qū)動(dòng)激光,不僅保證能夠同時(shí)激發(fā)多個(gè)非線性成像過(guò)程,而且確保這些非線性過(guò)程所產(chǎn)生的光學(xué)信號(hào)能夠被高效檢測(cè),從而實(shí)現(xiàn)快速成像.超快光纖激光由于結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、光束質(zhì)量高、能適應(yīng)相對(duì)惡劣的工作環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于驅(qū)動(dòng)非線性光學(xué)顯微鏡[33].最常用的光纖超快激光器是摻鐿光纖激光器和摻鉺光纖激光器,其脈沖中心波長(zhǎng)分別在1.03 μm 和1.55 μm 附近.受限于增益帶寬,這兩種光纖激光所產(chǎn)生的飛秒脈沖都不能在大范圍內(nèi)波長(zhǎng)調(diào)諧,大大限制了在非線性顯微成像中的應(yīng)用.為了解決該難題,人們發(fā)展了多種基于非線性光纖光學(xué)技術(shù)的波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換手段以產(chǎn)生波長(zhǎng)可以大范圍內(nèi)調(diào)諧的飛秒脈沖,用以?xún)?yōu)化無(wú)標(biāo)記的非線性顯微成像過(guò)程.傳統(tǒng)的非線性波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換技術(shù)包括孤子自頻移[34-36]、色散波產(chǎn)生[37-40]、超連續(xù)譜[41]和四波混頻[42],但這些方式的能量可擴(kuò)展性差而且轉(zhuǎn)換效率較低.

為解決這些問(wèn)題,提出了一種新的波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換方法—基于自相位調(diào)制(self-phase modulation,SPM)的光譜選擇技術(shù)(self-phase modulation enabled spectral selection,SESS)[43-48].在這種方法中,高能量的窄帶飛秒脈沖在很短(<10 cm)的光纖內(nèi)傳輸即可獲得足夠的光譜展寬,展寬光譜由一系列相互獨(dú)立的光譜旁瓣構(gòu)成,其中最左側(cè)和最右側(cè)的旁瓣包含大量的脈沖能量.利用光學(xué)濾波器濾出最左/最右的光譜旁瓣,可以獲得波長(zhǎng)可大范圍調(diào)諧的近變換極限飛秒脈沖.在本文中,首次利用SESS 飛秒光源驅(qū)動(dòng)非線性光學(xué)顯微鏡實(shí)現(xiàn)胃組織的多模態(tài)顯微成像.該光源使用重復(fù)頻率為43 MHz 的摻鐿光纖激光器作為前端,利用非線性波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換技術(shù)產(chǎn)生波長(zhǎng)在990 nm、脈沖能量約為7 nJ、脈寬約為84 fs 的脈沖.我們使用該光源驅(qū)動(dòng)非線性光學(xué)顯微鏡,通過(guò)2PEF 和SHG這兩種成像模態(tài)對(duì)胃組織進(jìn)行了成像,并將單張小視場(chǎng)的圖像拼接后獲得了大視場(chǎng)雙模態(tài)的胃組織圖像.另外,還獲得了波長(zhǎng)在1110 nm、脈沖能量大于10 nJ、脈寬約為48 fs 的脈沖,我們使用該飛秒光源獲得了胃組織的2PEF,3PEF,SHG 和THG的多模態(tài)圖像.

2 實(shí)驗(yàn)裝置

2.1 基于SESS 的光纖激光光源

基于SESS 的非線性光學(xué)顯微鏡實(shí)驗(yàn)裝置如圖1 所示.摻鐿光纖振蕩器產(chǎn)生重頻43 MHz、中心波長(zhǎng)在1040 nm、能量約0.2 nJ 的超短脈沖.該脈沖經(jīng)過(guò)光纖展寬器展寬后,脈沖能量由兩級(jí)摻鐿光纖放大器放大到100 nJ 以上,圖2(a)為放大后的光譜.圖2(b)中紅色曲線是壓縮后脈沖的自相關(guān)曲線,半高全寬為253 fs,假設(shè)該脈沖為雙曲正割型,對(duì)應(yīng)的脈寬則為164 fs.圖2(b)中黑色曲線是放大后光譜對(duì)應(yīng)的變換極限脈沖的自相關(guān)曲線,與測(cè)量得到的自相關(guān)曲線重合,表明獲得了近變換極限脈沖.

圖1 基于SESS 的非線性光學(xué)顯微鏡實(shí)驗(yàn)裝置.ISO:隔離器,LD:二極管泵浦激光源,WDM:波分復(fù)用器,Amp:光纖放大器,HWP:半波片,PBS:偏振分束器,L:透鏡,LPF:長(zhǎng)通濾波器,NLOM:非線性光學(xué)顯微鏡Fig.1.Schematic setup of the nonlinear optical microscopy driven by SESS.ISO:isolator,LD:laser diode,WDM:wavelength-division multiplexing,Amp:amplifier,HWP:half-wave plate,PBS:polarization beam splitter,L:lens,LPF:long pass filter,NLOM:nonlinear optical microscopy.

圖2 放大脈沖的光譜和自相關(guān)軌跡 (a)光譜;(b)自相關(guān)軌跡.紅色曲線:測(cè)量得到的自相關(guān)軌跡,黑色曲線:通過(guò)光譜計(jì)算得到的變換極限脈沖的自相關(guān)軌跡Fig.2.Spectrum and autocorrelation trace of the amplified pulse:(a) Spectrum;(b) autocorrelation trace.Red curve:measured autocorrelation trace.Black curve:calculated from the transform-limited pulses allowed by the amplified pulse spectrum.

為了實(shí)現(xiàn)SESS,將壓縮后的脈沖耦合到5.5 cm長(zhǎng)的單模光子晶體光纖中,該光纖的模場(chǎng)直徑為10.3 μm,在1030 nm 處的群速度色散為—30 ps/(nm·km).光纖耦合模塊包括光纖支架(HFV001,Thorlabs)、三軸平移臺(tái)(MAX313 D,Thorlabs)和有效焦距為15 mm 的非球面透鏡(C260 TMD-C,Thorlabs).低功率下光纖的耦合效率為72%.如圖3(a)所示,當(dāng)耦合到光纖里的能量為44 nJ 時(shí),展寬光譜中最左側(cè)的光譜旁瓣的峰值波長(zhǎng)移至990 nm,使用截止波長(zhǎng)在1000 nm 的短通光濾波器(#64337,Edmund Optics)濾出最左側(cè)旁瓣,得到的脈沖功率為298 mW,能量為6.9 nJ,轉(zhuǎn)換效率為16%.濾出來(lái)的脈沖經(jīng)過(guò)光柵對(duì)壓縮,圖3(b)中紅色曲線是壓縮后脈沖的自相關(guān)曲線,半高全寬為129 fs,假設(shè)該脈沖為雙曲正割型,對(duì)應(yīng)的脈寬則為84 fs.圖3(b)還顯示了左旁瓣光譜對(duì)應(yīng)的變換極限脈沖的自相關(guān)曲線(黑色曲線),與測(cè)量得到的自相關(guān)曲線幾乎重合,表明我們獲得了近變換極限脈沖.

圖3 當(dāng)耦合到光纖里的能量為44 nJ 時(shí)輸出的展寬光譜以及990 nm 處濾波得到的脈沖光譜和自相關(guān)軌跡 (a)展寬光譜;(b)自相關(guān)軌跡.紅色曲線:測(cè)量得到的自相關(guān)軌跡,黑色曲線:通過(guò)光譜計(jì)算得到的變換極限脈沖的自相關(guān)軌跡.插圖:990 nm 處濾波得到的脈沖光譜Fig.3.Spectrum broadening with coupled energy of 44 nJ,spectrum and autocorrelation trace of the filtered pulses at 990 nm:(a) Broadened spectrum;(b) autocorrelation trace.Red curve:measured autocorrelation trace.Black curve:calculated from the transform-limited pulses allowed by the spectrum at 990 nm.Inset:filtered spectrum at 990 nm.

如圖4(a)所示,當(dāng)耦合到光纖里的脈沖能量為50 nJ 時(shí),展寬光譜中最右側(cè)的光譜旁瓣的峰值波長(zhǎng)移至1110 nm.我們使用1150 nm 的長(zhǎng)通濾波器(#89661,Edmund Optics)濾出最右側(cè)的兩個(gè)旁瓣,得到的脈沖功率為640 mW,能量為15 nJ,轉(zhuǎn)換效率為28%.同樣,濾出來(lái)的脈沖經(jīng)過(guò)光柵對(duì)壓縮,圖4(b)紅色曲線展示了壓縮后脈沖測(cè)量得到的自相關(guān)曲線,半高全寬為74 fs,假設(shè)該脈沖為雙曲正割型,對(duì)應(yīng)的脈寬則為48 fs.同一圖中還展示了計(jì)算得到的右旁瓣光譜對(duì)應(yīng)的變換極限脈沖的自相關(guān)曲線(黑色曲線),變換極限脈沖的脈寬為44 f s,表明獲得了近變換極限脈沖.

圖4 當(dāng)耦合到光纖里的能量為50 nJ 時(shí)輸出的展寬光譜以及1110 nm 處濾波得到的脈沖光譜和自相關(guān)曲線(a)展寬光譜;(b)自相關(guān)軌跡.紅色曲線:測(cè)量得到的自相關(guān)軌跡,黑色曲線:通過(guò)光譜計(jì)算得到的變換極限脈沖的自相關(guān)軌跡,插圖:1110 nm 處濾波得到的脈沖光譜Fig.4.Spectrum broadening with coupled energy of 50 nJ,spectrum and autocorrelation trace of the filtered pulses at 1110 nm:(a) Broadened spectrum; (b) autocorrelation trace.Red curve: measured autocorrelation trace.Black curve:calculated from the transform-limited pulses allowed by the spectrum at 1110 nm.Inset:filtered spectrum at 1110 nm.

進(jìn)一步,我們驗(yàn)證了濾波得到的兩個(gè)不同波長(zhǎng)脈沖的長(zhǎng)期穩(wěn)定性.在沒(méi)有任何反饋控制的情況下,4 h 內(nèi)測(cè)量輸出脈沖功率的變化小于3%;在對(duì)光纖耦合進(jìn)行主動(dòng)調(diào)節(jié)時(shí),4 h 以上能實(shí)現(xiàn)低于1% 的功率改變,從而能保證在成像期間功率改變可忽略不計(jì),不影響成像結(jié)果.

2.2 掃描顯微鏡

基于SESS 的飛秒光源出射的光束由8 kHz的共振掃描儀進(jìn)行掃描,并由水浸物鏡(XLPLN25 XWMP2,NA=1.05,Olympus)聚焦到樣品上,產(chǎn)生非線性信號(hào).雙色鏡(F665-Di02-25×36,Semrock)將激發(fā)光束和由物鏡收集的發(fā)射信號(hào)后向分離.采用三個(gè)濾波模塊區(qū)分不同的非線性信號(hào),每個(gè)濾波模塊包含一個(gè)雙色鏡和兩個(gè)帶通濾波器.在1110 nm 激發(fā)下,檢測(cè)2PEF/3PEF/SHG/THG 信號(hào) 時(shí),濾波模塊1(#34731,#12152,#12096,Edmund Optics)可區(qū)分SHG/THG 信號(hào),濾波模塊2(#34731,#86953,#86949,Edmund Optics)用以區(qū)分2PEF/3PEF 信號(hào).在990 nm 激發(fā)下,檢測(cè)2PEF/SHG 信號(hào)時(shí),濾波模塊3(#34739,#86953,#12152,Edmund Optics)能夠區(qū)分2PEF/SHG 信號(hào).PMT1 和PMT2(PMT2100,Thorlabs)用來(lái)探測(cè)信號(hào).在1110 nm 激發(fā)下,收集2PEF/3PEF/SHG/THG 信號(hào)時(shí),以30 FPS 的速度獲取1248 μm×1248 μm 視場(chǎng)的圖像,每幀 1024×1024像素,每十幀平均一次.在990 nm 激發(fā)下,收集2PEF/SHG 信號(hào)時(shí),同樣速度獲取400 μm×400 μm 視場(chǎng)的圖像,每十幀平均一次,通過(guò)電動(dòng)平移臺(tái)(PLS-XY,Thorlabs)平移樣品獲取多張小視場(chǎng)圖像,用ImageJ軟件進(jìn)行小視場(chǎng)圖像的拼接.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了證明我們的顯微鏡系統(tǒng)在人體胃組織中進(jìn)行多模態(tài)無(wú)標(biāo)記成像的能力,使用990 nm 脈沖驅(qū)動(dòng)非線性光學(xué)顯微鏡對(duì)胃組織未染色石蠟切片(厚度10 μm)進(jìn)行成像(圖5),并且使用1110 nm脈沖對(duì)胃組織冰凍切片(厚度50 μm)進(jìn)行成像(圖6).

3.1 離體人體胃組織的2PEF/SHG 成像

使用中心波長(zhǎng)在990 nm 的脈沖對(duì)胃組織未染色石蠟切片進(jìn)行成像,由于顯微鏡系統(tǒng)的衰減,物鏡后的最大激發(fā)功率為55 mW,考慮到重頻為43 MHz,對(duì)應(yīng)的脈沖能量約1.3 nJ,最終獲得了視場(chǎng)大小為400 μm×400 μm 的胃組織2PEF/SHG圖像.如圖5 所示,由十張小視場(chǎng)圖像拼接得到的胃組織的2PEF/SHG 圖像顯示了正常胃粘膜主要由胃腺和結(jié)締組織的基質(zhì)組成.細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有FAD 這種內(nèi)源性熒光團(tuán),細(xì)胞核內(nèi)不含有FAD.在2PEF 圖像中,通過(guò)收集FAD 的內(nèi)源性自發(fā)熒光,可以識(shí)別出位于基底膜表面的單個(gè)上皮細(xì)胞核(圖5(a)中的白色箭頭),并且可以輕松檢測(cè)到由上皮細(xì)胞組成的單個(gè)胃腺.膠原蛋白基質(zhì)是形成粘膜基質(zhì)的基本框架,SHG 圖像主要顯示膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)(圖5(b)中的黃色箭頭).從圖5(c)的2PEF 和SHG 的疊加圖像中可以看到基底膜是圍繞單個(gè)腺體的細(xì)帶,并且基質(zhì)中的網(wǎng)狀纖維形成了支持胃腺的細(xì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu).

圖5 離體人體胃組織的2PEF/SHG 圖像 (a) 2PEF 圖像;(b) SHG 圖像;(c) 2PEF 和SHG 的疊加圖像.白色箭頭:上皮細(xì)胞;黃色箭頭:膠原蛋白.比例尺:100 μmFig.5.2PEF/SHG images of ex vivo human gastric tissue:(a) 2PEF image;(b) SHG image;(c) merging of 2PEF and SHG images.White arrow:epithelial cells;yellow arrow:collagen.Scale bar:100 μm.

3.2 離體人體胃組織的2PEF/SHG/3PEF/THG 成像

使用中心波長(zhǎng)在990 nm 的脈沖對(duì)胃組織進(jìn)行成像,由于激發(fā)光波長(zhǎng)靠近FAD 熒光團(tuán)的激發(fā)峰,所以?xún)H需要很少的能量就可以高效激發(fā)2PEF,同時(shí)也可以收集到強(qiáng)的SHG 信號(hào).但想獲得更多模態(tài)的生物信息,例如THG 和3PEF 信號(hào),就需要波長(zhǎng)更長(zhǎng)、能量更高、脈寬更窄的脈沖.You 等[13]發(fā)明了無(wú)標(biāo)記自發(fā)熒光多倍頻顯微鏡技術(shù)(simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy,SLAM),該技術(shù)旨在單次激發(fā)條件下分辨發(fā)射光譜重疊的內(nèi)源性熒光團(tuán),并同時(shí)激發(fā)倍頻過(guò)程.實(shí)現(xiàn)該技術(shù)需要波長(zhǎng)可調(diào)諧的飛秒激光驅(qū)動(dòng)源以?xún)?yōu)化特定的多模態(tài)過(guò)程.NADH 和FAD 是細(xì)胞中參與氧化還原反應(yīng)的兩個(gè)主要輔酶,與能量產(chǎn)生和細(xì)胞代謝密切相關(guān).在飛秒激光照射下,通過(guò)多光子吸收可以激發(fā)NADH 和FAD 的自發(fā)熒光,該熒光可以用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞的代謝活動(dòng),進(jìn)而能非侵入性地監(jiān)測(cè)干細(xì)胞分化、癌癥發(fā)展和神經(jīng)退行性疾病等過(guò)程.在非線性光學(xué)顯微鏡成像過(guò)程中,NADH 和FAD 通常在750 nm 和880 nm 處被依次激發(fā)[2-9,13],成像速率隨著激發(fā)波長(zhǎng)的數(shù)量降低,而且難以確保成像通道之間圖像的重疊.為了解決該難題,You 等[13]提出使用1110 nm 飛秒脈沖作為激發(fā)光,同時(shí)實(shí)現(xiàn)雙光子激發(fā)FAD、三光子激發(fā)NADH.實(shí)驗(yàn)中,他們利用光子晶體光纖產(chǎn)生超連續(xù)光譜,之后從中濾出中心波長(zhǎng)在1110 nm 的飛秒脈沖用來(lái)驅(qū)動(dòng)非線性光學(xué)顯微鏡,結(jié)合多個(gè)檢測(cè)通道得到了較強(qiáng)的2PEF,3PEF,SHG 和THG的信號(hào),實(shí)現(xiàn)了對(duì)生物組織中多種成分的同步成像.但是目前該SLAM 系統(tǒng)的驅(qū)動(dòng)光源基于固態(tài)超快光源產(chǎn)生超連續(xù)譜,并且需要空間光調(diào)制器實(shí)現(xiàn)濾波和脈沖相位補(bǔ)償,導(dǎo)致整個(gè)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜且對(duì)環(huán)境波動(dòng)十分敏感,限制了SLAM 在生物醫(yī)學(xué)成像中的應(yīng)用.相較而言,利用SESS 產(chǎn)生1110 nm飛秒脈沖,方案簡(jiǎn)單易行、脈沖能量更高,而且將來(lái)有望實(shí)現(xiàn)全光纖化.為了驗(yàn)證SESS 光源可用于驅(qū)動(dòng)SLAM 成像,我們把脈沖波長(zhǎng)調(diào)諧到1110 nm,濾出兩個(gè)光譜旁瓣以獲得更強(qiáng)的能量和更窄的脈寬,對(duì)胃組織冰凍切片進(jìn)行SLAM 成像.由于顯微鏡系統(tǒng)的衰減,物鏡后最大的激發(fā)功率為225 mW,重頻為43 MHz,對(duì)應(yīng)的脈沖能量約5.2 nJ,最終獲得了胃組織的2PEF/SHG/3PEF/THG 圖像,視場(chǎng)為1248 μm×1248 μm.如圖6 所示,在2PEF圖像中可以觀察到胃組織中的彈力纖維(圖6(a)中的粉色箭頭),SHG 圖像中顯示出胃組織中的膠原纖維(圖6(b)中的黃色箭頭),在THG/3PEF中可以辨別出一些脂肪細(xì)胞(圖6(c)和圖6(d)中的白色箭頭).

圖6 離體人體胃組織的2PEF/SHG/3PEF/THG 圖像 (a) 2PEF 圖像;(b) SHG 圖像;(c) 3PEF 圖像;(d) THG圖像;(e) 2PEF/SHG/3PEF/THG 的疊加圖像.粉色箭 頭:彈力纖維;黃色箭頭:膠原纖維;白色箭頭:脂肪細(xì)胞.比例尺:100 μm.Fig.6.2PEF/SHG/3PEF/THG images of ex vivo human gastric tissue:(a) 2PEF image;(b) SHG image;(c) 3PEF image;(d) THG image;(e) merging of 2PEF/SHG/3PEF/THG images.Pink arrow:elastic;yellow arrow:collagen;white arrow:adipocyte.Scale bar:100 μm.

4 結(jié)論

我們的光纖超快激光源通過(guò)新型波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換技術(shù)SESS 能提供靈活可變的多種波長(zhǎng)用于驅(qū)動(dòng)非線性光學(xué)顯微鏡,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)多模態(tài)成像.其中,990 nm 的飛秒脈沖可以驅(qū)動(dòng)2PEF/SHG 顯微鏡,激發(fā)胃組織中內(nèi)源性熒光團(tuán)FAD 的雙光子熒光,收集膠原纖維的SHG 信號(hào),實(shí)現(xiàn)對(duì)胃組織未染色石蠟切片的雙模態(tài)成像;1110 nm 的飛秒脈沖可以驅(qū)動(dòng)SLAM,激發(fā)胃組織中彈性蛋白的雙光子熒光和脂肪細(xì)胞的三光子熒光,收集膠原纖維的SHG信號(hào)和一些細(xì)微結(jié)構(gòu)輪廓界面的THG 信號(hào),實(shí)現(xiàn)對(duì)新鮮胃組織冰凍切片的多模態(tài)成像.

目 前,光學(xué)參量振蕩器(optical parametric oscillator,OPO)結(jié)合鈦寶石激光器是非線性光學(xué)顯微鏡主要選擇的光源[49],它也可以輸出1110 nm的脈沖驅(qū)動(dòng)SLAM.但是它出射的脈沖重頻高(80 MHz)、脈沖寬(140—400 fs),導(dǎo)致峰值功率低難以高效激發(fā)自發(fā)熒光和多倍頻信號(hào).You 等[13]提出的基于10 MHz 固態(tài)鐿激光器的超連續(xù)譜光源,通過(guò)脈沖整形器選擇超連續(xù)譜中1110±30 nm 波段用于驅(qū)動(dòng)SLAM,峰值功率足夠高效激發(fā)2PEF/SHG/3PEF/THG 這四個(gè)模態(tài)的信號(hào),但它體積龐大、昂貴、結(jié)構(gòu)復(fù)雜且對(duì)環(huán)境波動(dòng)十分敏感.我們提出的基于SESS 的超快光纖光源相對(duì)鈦寶石OPO 光源重頻低(43 MHz)、脈寬窄(48 fs)、峰值功率高,相對(duì)基于10 MHz 固態(tài)鐿激光器的超連續(xù)譜光源結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、運(yùn)行穩(wěn)定,更加適合驅(qū)動(dòng)SLAM.

腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中的各種成分之間的相互作用已經(jīng)成為了解腫瘤細(xì)胞如何增殖、侵襲、傳播和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵[50].未來(lái),我們可以通過(guò)990 nm脈沖驅(qū)動(dòng)2PEF/SHG 顯微鏡結(jié)合圖像拼接技術(shù),對(duì)癌變和正常胃組織未染色石蠟切片進(jìn)行大視場(chǎng)成像,并與福爾馬林固定、石蠟包埋、蘇木精和伊紅染色的標(biāo)準(zhǔn)組織切片進(jìn)行對(duì)比,在無(wú)標(biāo)記的2PEF/SHG 顯微鏡中實(shí)現(xiàn)輕松分辨癌變和正常的胃組織,用于快速經(jīng)濟(jì)高效地進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估,推進(jìn)胃癌的快速診斷.另外,可以通過(guò)1110 nm 脈沖驅(qū)動(dòng)SLAM,收集癌變組織的2PEF/SHG/3PEF/THG 信號(hào).不同的通道可以收集到不同的細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)的信號(hào),例如3 PAF 可以觀察到基質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、脂肪組織中的脂質(zhì)液泡和呈管狀排列的生物囊泡等;2 PAF 幾乎存在于所有細(xì)胞中,僅微弱地存在于腫瘤細(xì)胞中;THG 主要出現(xiàn)在腫瘤相關(guān)囊泡中,SHG 可以觀察到一些膠原蛋白等.這些成像手段有助于我們了解不同細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)在正常和癌變組織中的變化,可以闡明不同生物成分在癌癥進(jìn)展中的復(fù)雜作用,并發(fā)現(xiàn)可用于癌癥診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物.

非線性光學(xué)顯微鏡技術(shù)具有無(wú)標(biāo)記、多模態(tài)、高分辨率和深層光學(xué)切片能力等優(yōu)勢(shì).本文中,通過(guò)對(duì)厚度為50 μm 的冰凍切片和厚度為10 μm 的石蠟切片進(jìn)行成像,驗(yàn)證該技術(shù)的無(wú)標(biāo)記多模態(tài)成像能力.在未來(lái)的實(shí)驗(yàn)工作中,將利用熒光微球精確測(cè)量成像系統(tǒng)的空間分辨率;還將對(duì)厚的組織塊進(jìn)行成像,獲取顯微成像系統(tǒng)在不同聚焦深度情況的成像結(jié)果,進(jìn)一步驗(yàn)證系統(tǒng)的深層光學(xué)切片能力.

總之,我們提出的基于SESS 的超快光纖光源可以輸出990 nm 和1110 nm 的脈沖,實(shí)現(xiàn)了胃組織中細(xì)胞和細(xì)胞外成分的同時(shí)成像.進(jìn)一步,我們的光源還可靈活調(diào)節(jié)中心波長(zhǎng)、脈寬、脈沖能量和平均功率等所有重要的激光參數(shù),從而有望廣泛應(yīng)用于不同的生物醫(yī)學(xué)成像場(chǎng)景.