金城

(北京積水潭醫(yī)院 口腔科， 北京 100000)

平足蛋白(podoplanin)為一種跨膜唾液酸黏蛋白樣糖蛋白，在腫瘤細胞中表達上升，被認為與多種惡性腫瘤關(guān)系密切，主要參與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移等生物學功能[1-3]。口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一[4]。有研究顯示Podoplanin高表達于低分化的OSCC中，表達水平與腫瘤侵襲能力相關(guān)[5]；Alvarez等[6]研究表明在OSCC細胞中，Podoplanin的單克隆抗體及外源凝集素可抑制Podoplanin的表達，進而破壞線粒體膜的通透性，誘導細胞凋亡，提示Podoplanin可參與OSCC的侵襲及凋亡。因此，Podoplanin的表達是否與OSCC相關(guān)、能否成為預后標志物，是值得關(guān)注的研究方向；除細胞凋亡外，Podoplanin的表達是否影響OSCC細胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移，進而影響OSCC的進展及預后，也是值得探討的方向。有鑒于此，本研究先選取76例OSCC患者，探討Podoplanin與其臨床特征及預后的關(guān)系；再選取人OSCC CAL-27細胞株探討Podoplanin在OSCC中的具體作用機制，現(xiàn)將結(jié)果匯報如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞及組織來源 人OSCC CAL-27細胞株購自上海生命科學研究院細胞資源中心，同時收集2017年1月—2018年7月OSCC手術(shù)患者的組織病理標本蠟塊，入選標準為首次確診的、未接受過放化療的OSCC患者，預計生存期>12周，患者均充分知情且簽署知情同意書；共納入OSCC患者76例，男45例、女31例，年齡42～79歲、平均(57.36±8.67)歲，組織分化程度高、低各有50、26例，腫瘤分期(tumor，lymphnode and metastasis stage，TNM)為T1、T2、T3及T4期分別有19、24、20及13例，臨床分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期分別有29、20、及27例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例、無轉(zhuǎn)移26例?；颊咝g(shù)后均電話或門診做生存期隨訪，每半年1次。

1.1.2主要試劑與儀器 噻唑藍染料(美國Sigma)，Podoplanin抗體、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)抗體、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(phospho-phosphatidylinositol 3-kinase，p-PI3K)抗體、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)抗體及磷酸化AKT(phospho-AKT，p-AKT)抗體(美國Cell Signaling Technology)，Podoplanin及β-actin引物(上海生工生物工程)，聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒(日本Takara)，Trizol及 Lipofectamine3000試劑盒(美國Invitrogen)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(立陶宛Fermentas)，其余試劑(上海碧云天生物)；細胞培養(yǎng)箱(美國賽默飛世爾)，實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)儀(立陶宛 Fermentas)，倒置熒光顯微鏡(日本Olympus)。

1.2 實驗方法

1.2.1人體口腔癌標本免疫組織化學染色 收集的標本固定于10%福爾馬林，石蠟包埋后切片機4 μm切片，梯度乙醇洗脫，石蠟包埋，60 ℃烤片；切片室溫封閉、檸檬酸組織抗原緩沖液中染色、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗，過氧化物酶阻斷劑孵育、再次沖洗、加一抗4 ℃孵育過夜、清洗，加鼠單克隆二抗、孵育沖洗；使用二氨基聯(lián)苯胺顯色，沖洗后蘇木精復染，脫水固定并封片；顯微鏡下選擇5個不同區(qū)域觀察Podoplanin染色陽性細胞數(shù)量，陽性細胞的比例≤20%時計0分、>20%時計1分，同時染色無著色、淡黃色、棕黃色及以上分別計0、1及2分，2項得分合計≤1分即為低表達組，>1分為高表達組。

1.2.2細胞沉默及過表達模型構(gòu)建 為獲得Podoplanin 沉默及過表達的CAL-27細胞模型，首先將CAL27細胞放入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)期CAL27細胞接種至6孔板中，待細胞貼壁后，使用OPTI-MEM用于稀釋Lipofectamine 3000，混勻、靜止孵育8 min，分別設(shè)置4個不同轉(zhuǎn)染的質(zhì)量濃度(1 ∶0.02、1 ∶0.04、1 ∶0.06及1 ∶0.08)，轉(zhuǎn)染后利用熒光倒置顯微鏡查看熒光情況，確定1 ∶0.06為最合適轉(zhuǎn)染質(zhì)量濃度。Podoplanin沉默組模型構(gòu)建：設(shè)置空白組、空白沉默組及沉默組，空白組細胞不做任何處理；空白沉默組細胞清洗之后加OPTI-MEM 2 mL，與1 ∶0.06的OPTI-MEM-Lipofectamine 3000混合物、避光培養(yǎng)6 h，清洗細胞，加無抗細胞培養(yǎng)液3 mL/孔、繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞；沉默組細胞清洗之后加入合成的Podoplanin si-RNA與1 ∶0.06的OPTI-MEM-Lipofectamine 3000混合物、避光培養(yǎng)6 h，清洗細胞，加無抗細胞培養(yǎng)液3 mL/孔、繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞。Podoplanin過表達組模型構(gòu)建：設(shè)置空白組、空白過表達組及過表達組，空白組細胞不做任何處理；空白過表達組細胞清洗后加 OPTI-MEM 2 mL，與1 ∶0.06的OPTI-MEM-Lipofectamine 3000混合物、避光培養(yǎng)6 h，清洗細胞，加無抗細胞培養(yǎng)液3 mL/孔、繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞；過表達組細胞清洗之后，加入合成的Podoplanin 質(zhì)粒與1 ∶0.06的OPTI-MEM-Lipofectamine 3000混合物、避光培養(yǎng)6 h，清洗細胞，加無抗細胞培養(yǎng)液3 mL/孔、繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞。

1.2.3細胞沉默及過表達模型驗證 取1.2.2項下的空白組、空白沉默組(空白過表達組)及沉默組(過表達組)細胞，使用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction ，qPCR)及Western blot驗證沉默及過表達效果。(1)qPCR方法：收集細胞之后，使用Trizol試劑盒提取細胞總核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)，保證提取的總RNA的純度；qPCR總反應體系為10 μL，其中Syber GreenⅠ 5 μL、上下游引物各0.6 μL、互補脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid，cDNA) 0.5 μL、 ddH2O 3.9 μL；擴增條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、54 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s、72 ℃ 10 min，共40個循環(huán)；Podoplanin上游序列為5′- TGACTCCAGGAACCAGCGAAG -3′，下游序列為5′- GCGAATGCCTGTTACACT -3′; β-actin上游序列為5′-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3′，下游序列為5′-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3′。(2)Western blot方法：收集各組細胞用于提取總蛋白，100 ℃煮沸10 min，冷凍保存； Western blot時配制10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠，待膠凝固，拔出上樣梳，上樣細胞蛋白20 μL/孔，設(shè)置80 V、30 min及120 V、2 h跑膠；據(jù)Marker指示及Podoplanin等目標蛋白分子量切膠，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，稍清洗之后脫脂牛奶封閉4 h；清洗PVDF膜，分別加Podoplanin及β-actin抗體，4 ℃孵育過夜；次日取膜清洗，加二抗，孵育1 h，洗膜后顯影，觀察顯影條帶，使用Image J軟件測量條帶灰度值。驗證成功后，分別選取上述沉默組及過表達組用于后續(xù)實驗。

1.2.43-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽比色法[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]法檢測細胞增殖 取對數(shù)期生長的CAL-27細胞接種至96孔板，設(shè)置對照組，并按照1.2.2項下沉默組及過表達組中獲得的細胞分別為沉默組及過表達組，將細胞置于細胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24及48 h；棄培養(yǎng)液，清洗細胞，每孔加配制好的5 g/L MTT溶液20 μL，細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄上清；加二甲基亞砜150 μL/孔，上酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔的光密度(optical density，OD)值。

1.2.5細胞集落形成實驗 取對數(shù)期生長的CAL-27細胞接種至6孔板，設(shè)置對照組，取1.2.2項下沉默組及過表達組獲得的細胞分別為沉默組及過表達組，培養(yǎng)48 h后細胞集落形成后即停止培養(yǎng)；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer salt, PBS)沖洗，結(jié)晶紫染色，再次PBS沖洗，拍照記錄。

1.2.6細胞遷移能力測定 取對數(shù)期生長的CAL-27胞接種至24孔板，接種密度為4×104個/孔，設(shè)置對照組，將1.2.2項下沉默組及過表達組中獲得的細胞為沉默組及過表達組，各組細胞于Matrige l4 ℃冰箱融化過夜，1 ∶6與無血清培養(yǎng)液混合，transwell 板上室加混合液30 μL，置于細胞培養(yǎng)箱中使其形成膠狀物質(zhì)，將細胞消化制成單細胞懸液，于Transwell上室加細胞懸液100 μL和無血清培養(yǎng)基300 μL，置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；干棉簽擦去上層細胞，將聚碳酯膜下表面的細胞用10%甲醛溶液固定，結(jié)晶紫染液， PBS清洗、干燥，拍照，計數(shù)。

1.2.7PI3K/AKT信號通路蛋白的表達 收集對照組、沉默組及過表達組細胞用于提取總蛋白，100 ℃煮沸10 min，冷凍保存；配制10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠，待膠凝固，拔出上樣梳，上樣細胞蛋白20 μL/孔，設(shè)置80 V、30 min及120 V、2 h跑膠；據(jù)Marker指示及目標蛋白分子量切膠，轉(zhuǎn)至PVDF膜，稍清洗之后脫脂牛奶封閉4 h；清洗PVDF膜，分別加一抗及β-actin抗體，4 ℃孵育過夜；次日取膜清洗，加二抗，孵育1 h，洗膜后顯影，觀察顯影條帶，使用Image J軟件測量條帶灰度值。

1.2.8臨床及隨訪資料收集 從患者住院病歷及檢查報告中收集年齡、性別等基本信息及TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、分化程度等信息；患者術(shù)后均電話或門診做生存期隨訪，每半年1次，隨訪截止時間為2020年12月31日，患者從明確診斷為OSCC至患者死亡或隨訪終止的時間定為總生存期(overall survival, OS)。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 OSCC患者Podoplanin的表達

免疫組織化學染色結(jié)果顯示，低分化OSCC患者口腔癌組織Podoplanin染色陽性細胞數(shù)量多于于高分化患者。見圖1。

高分化 低分化圖1 不同分化程度OSCC患者的Podoplanin表達(免疫組織化學，×100)Fig.1 Podoplanin expression in OSCC patients with different degrees of differentiation (immunohistochemistry,×100)

2.2 OSCC患者Podoplanin表達與臨床特征、預后的關(guān)系

低分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移OSCC患者的Podoplanin高表達率高于高分化及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與低表達組相比，Podoplanin高表達組OSCC患者的OS降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1和圖2。

表1 Podoplanin表達水平與OSCC 患者臨床特征的相關(guān)性Tab.1 Correlation between Podoplanin expression and clinicopathological features of OSCC patients

圖2 OSCC患者Podoplanin表達與預后的關(guān)系Fig.2 Relationship between Podoplanin expression and OS of OSCC patients

2.3 CAL27細胞中沉默或過表達Podoplanin模型驗證

Werstern blot及qRT-PCR測定結(jié)果顯示，與空白組相比，沉默組CAL-27細胞中Podoplanin的蛋白及mRNA表達下降(P<0.05)，過表達組CAL-27細胞中Podoplanin的蛋白及mRNA表達升高(P<0.05)，但空白沉默組及空白過表達組CAL-27細胞中Podoplanin蛋白及mRNA比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3。

注：A、B為空白組、空白沉默組及沉默組CAL27細胞中Podoplanin蛋白表達及其定量結(jié)果，C、D為空白組、空白過表達組及過表達組細胞中Podoplanin蛋白表達及其定量結(jié)果，E、F為Podoplanin mRNA相對表達量；(1)與空白組比較，P<0.05。圖3 各組CAL-27細胞中Podoplanin蛋白和mRNA表達Fig.3 Podoplanin protein and mRNA expression levels in CAL-27 cells of each group

2.4 細胞增殖、集落形成及細胞周期

與對照組相比，Podoplanin過表達組CAL-27細胞24 h時細胞增殖明顯，48 h時沉默組細胞增殖及集落形成能力降低，過表達組細胞增殖及集落形成能力增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；細胞周期結(jié)果表明，與對照組相比，Podoplanin沉默組CAL-27細胞G1/S比值升高，過表達組G1/S比值降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

注：A為12、24及48 h時各組細胞增殖能力，B為各組細胞48 h集落形成能力(結(jié)晶紫染色，×100)，C為各組細胞周期變化，D為細胞周期分布；(1)與對照組比較，P<0.05。圖4 各組CAL-27細胞的增殖、集落形成及細胞周期Fig.4 Proliferation, colony formation, and cell cycle of CAL-27 cells in each group

2.5 細胞遷移能力

Transwell實驗表明，與對照組相比，Podoplanin沉默組CAL-27細胞遷移能力降低、過表達組CAL-27細胞遷移能力升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5。

注：A為細胞遷移的結(jié)晶紫染色結(jié)果(100×)，B為細胞遷移能力的定量結(jié)果；(1)與對照組比較，P<0.05。圖5 各組CAL-27細胞的遷移能力Fig.5 Migration ability of CAL-27 cells in each group

2.6 PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達

與對照組相比，Podoplanin沉默組CAL-27細胞中p-AKT/AKT和p-PI3K/P13K比值降低，過表達組p-AKT/AKT及p-PI3K/P13K比值升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖6。

注：A為蛋白表達，B為蛋白表達的定量結(jié)果；(1)與對照組比較，P<0.05。圖6 各組CAL-27細胞中PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達Fig.6 Expression of PI3K/AKT signaling pathway related proteins in CAL-27 cells in each group

3 討論

在腫瘤發(fā)展初期，血管生成的同時，淋巴管也參與其中，兩者共同參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[7-8]。Podoplanin作為淋巴管生成的重要組成部分，在侵襲性強的腫瘤中其預后預測價值也逐漸顯現(xiàn)[9]。Podoplanin在多種腫瘤中表達升高[10-12]。在惡性腫瘤的生物學功能中，Podoplanin調(diào)控的生長增殖與遷徙轉(zhuǎn)移機制已被證實[13]。在OSCC中，Podoplanin與腫瘤細胞自分泌的熱休克蛋白A9相互作用，參與細胞的增殖與侵襲[14]；Podoplanin還可促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[15]；在乳腺癌中，Podoplanin的表達可增強惡性腫瘤細胞活性，與不良預后密切相關(guān)[16]；另外，Podoplanin可促進血小板聚集及腫瘤血栓形成，進而促進腫瘤的血液轉(zhuǎn)移[17]。

本研究OSCC患者免疫組織化學染色結(jié)果表明，低分化患者中Podoplanin表達量較高，進一步分析Podoplanin的表達與腫瘤分化程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，且能影響預后。低分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤分期及預后的關(guān)鍵因素，Podoplanin在低分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者表達明顯升高，與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)，進而影響預后，提示Podoplanin的表達可作為OSCC患者預后的標志物。此結(jié)果與Chang等[18]肺鱗癌中研究結(jié)果類似。還有研究表明臥床腫瘤患者中Podoplanin的表達影響靜脈血栓的形成，此機制與Podoplanin參與血小板聚集有關(guān)，靜脈血栓的形成也是影響惡性腫瘤患者的重要因素之一[19]，但在OSCC中Podoplanin影響患者預后是否與靜脈血栓的形成有關(guān)，仍需進一步研究。

細胞無限增殖是惡性腫瘤的核心機制[20]，為了解Podoplanin在OSCC增殖及集落形成中的作用，本研究利用RNA干擾及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默及上調(diào)Podoplanin后，觀察細胞增殖及集落形成能力的變化，結(jié)果表明抑制Podoplanin表達48 h后，細胞增殖明顯減弱，集落形成能力減弱，而上調(diào)Podoplanin之后24 h及48 h呈現(xiàn)相反的結(jié)果，提示Podoplanin的表達可影響OSCC細胞的增殖及集落形成。細胞周期實驗結(jié)果表明沉默Podoplanin后，G1期細胞數(shù)增多，S 期細胞數(shù)減少，沉默Podoplanin后G1/S比值明顯高于對照組，過表達組G1/S比值明顯降低，提示Podoplanin可通過影響細胞周期進而調(diào)控細胞增殖。

眾多研究表明，Podoplanin在惡性腫瘤中最重要的機制為影響細胞遷移，Podoplanin可結(jié)合Ezrin/Radixin/Moesin家族蛋白，促進細胞增殖，在此過程中，伴隨Ras超家族A蛋白的激活，還可誘發(fā)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的形成，導致細胞侵襲轉(zhuǎn)移[21-23]。在OSCC中，Podoplanin可使基質(zhì)金屬蛋白酶9表達升高，降解細胞外基質(zhì)，破壞細胞屏障，促進腫瘤細胞的遷徙轉(zhuǎn)移[24]。本研究結(jié)果顯示沉默Podoplanin后細胞遷移能力減弱，上調(diào)之后細胞遷移能力增強，提示Podoplanin的表達對OSCC的細胞遷移具有一定意義。

PI3K/AKT是腫瘤細胞增殖遷移中重要的信號通路之一，可通過作用于細胞周期蛋白調(diào)控細胞增殖，在鱗癌細胞中，AKT的持續(xù)表達可誘導上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，誘導細胞侵襲轉(zhuǎn)移[25-27]。本研究結(jié)果顯示沉默Podoplanin后，PI3K及AKT的磷酸化水平降低，過表達后二者磷酸化水平升高，提示Podoplanin的表達可影響PI3K/AKT信號通路的水平，但是Podoplanin影響細胞增殖及遷移能力是否通過PI3K/AKT通路，仍需使用通路的抑制劑進一步證明。

綜上所述，Podoplanin與OSCC患者的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，且可影響患者預后，沉默Podoplanin后細胞增殖及集落形成能力呈抑制狀態(tài)，上調(diào)Podoplanin表達后呈現(xiàn)明顯相反的結(jié)果，Podoplanin的表達量也可影響細胞遷移能力，低表達時遷移能力減弱，高表達則遷移能力增強，PI3K/AKT可能是其中的影響機制之一。在后續(xù)實驗中，可采用更大樣本量的OSCC組織標本，闡明Podoplanin與OSCC的關(guān)聯(lián)，還可采用Podoplanin不同表達的體內(nèi)模型，研究Podoplanin在OSCC中的作用機制，為OSCC的臨床診治提供新思路。