乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。臨床上通過腫瘤細(xì)胞的雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人類表皮生長因子受體－2（HER2）和Ki67增殖指數(shù)將乳腺癌患者分為4 種類型：Luminal A 型（ER+、PR+、HER2-），Luminal B型（ER+、PR+、HER2+），HER2過表達(dá)型（ER-、PR-、HER2+）和三陰性乳腺癌（ER-、PR-、HER2-）。在乳腺癌患者中，HER2陽性的患者約占到20%～30%。相較于其他類型的乳腺癌，HER2陽性乳腺癌進(jìn)展速度更快、惡性程度更高，同時(shí)也更容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后情況相對較差。針對HER2的靶向治療，無論是針對胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體類；如曲妥珠單抗、帕妥珠單抗及抗體－藥物結(jié)合體T-DM1，還是針對胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的酪氨酸激酶抑制劑；如拉帕替尼、諾拉替尼及阿法替尼等，都能有效地降低死亡風(fēng)險(xiǎn)或復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。但在靶向治療中還是4位患者中就有一位會(huì)復(fù)發(fā)，研究表明聯(lián)用結(jié)合HER2不同部位的帕妥珠單抗及選用抗體－藥物結(jié)合體T-DM1可進(jìn)一步提高療效，但部分患者原發(fā)性的耐藥以及大部分患者治療1年左右出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥，仍然成為治療的瓶頸。

糖尿病與乳腺癌的發(fā)生有著復(fù)雜的關(guān)系?；继悄虿〉呐耘c沒有糖尿病的女性相比，前者患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加15%～20%，二甲雙胍作為臨床治療2型糖尿病的常用降糖藥，在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)具有一定的抗腫瘤作用，例如胃癌、食道癌和肺癌。尤其在乳腺癌中，大量數(shù)據(jù)分析表明，二甲雙胍能顯著降低乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，延長乳腺癌患者的生存時(shí)間。其機(jī)制可能與二甲雙胍可降低乳腺癌合并糖尿病患者的血糖水平，改善患者胰島素抵抗，發(fā)揮抑癌作用有關(guān)，另外，也有研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍還可以直接作用于乳腺癌細(xì)胞株MCF7，下調(diào)mTOR 信號通路，影響其增殖和遷移。盡管如此，二甲雙胍對不同類型乳腺癌細(xì)胞株的作用和機(jī)制并不完全清楚，本研究檢測二甲雙胍對HER2陽性乳腺癌細(xì)胞株SKBR3增殖和凋亡的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人HER2 陽性乳腺癌細(xì)胞株SKBR3 購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（美國馬里蘭州洛克維爾ATCC）。用含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶消化傳代，每3 d傳代1次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2 細(xì)胞活力測定

SKBR3細(xì)胞以5000/孔的細(xì)胞密度接種在96孔板上，每孔150 μL培養(yǎng)基。分為3組，空白組：未接種細(xì)胞，僅加入DMEM高糖完全培養(yǎng)基；對照組：接種細(xì)胞且常規(guī)培養(yǎng)；二甲雙胍（Solarbio，中國）組：分別用0、20、40、60、80、100、120 μmol/L二甲雙胍處理并孵育24、48、72 h。使用CCK8試劑（Solarbio，中國）在檢測吸光度，與空白相比，根據(jù)值計(jì)算細(xì)胞活力。每個(gè)處理?xiàng)l件重復(fù)4次，每次至少3個(gè)重復(fù)孔。IC使用GraphPad Prism軟件計(jì)算。

綜上所述，當(dāng)前我國的環(huán)境污染以及土地資源的利用問題比較嚴(yán)重，人們應(yīng)該引起足夠的重視。在經(jīng)濟(jì)快去發(fā)展的今天，人們生活水平不斷提高，但這種現(xiàn)象應(yīng)該是可持續(xù)發(fā)展的，所以相關(guān)部門應(yīng)該注意在經(jīng)濟(jì)建設(shè)的發(fā)現(xiàn)過程中注意環(huán)境的保護(hù)，重視土地資源可持續(xù)發(fā)展，實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)的持續(xù)、健康的發(fā)展。

1.3 單細(xì)胞集落形成試驗(yàn)

張員外的一家老小都上了天。眾位神仙早在南天門外等候，請張員外當(dāng)老天爺，他推辭不了，從此就當(dāng)上了老天爺，這就是張玉皇。他的七個(gè)閨女就成了七仙女了。張玉皇也遇到了麻煩事：種田的要雨，賣菜的要曬蔥，撐船的要風(fēng)，種果樹的要露水。張玉皇一聽，就下了一道圣旨：“黑夜下雨白天晴，夜?jié)睬f稼日曬蔥。果樹園里降甘露，河里刮風(fēng)催帆行?！?/p>

1.4 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡和周期分布

實(shí)驗(yàn)分組如下：對照組，常規(guī)培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組，給予不同濃度（0～100 μmol/L）二甲雙胍的DMEM 高糖完全培養(yǎng)基。收集各組細(xì)胞，通過使用補(bǔ)充有蛋白酶抑制劑（Thermo Fisher Scientific）的RIPA 緩沖液從細(xì)胞中提取總蛋白。等量的蛋白通過10%SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PⅤDF）（Millipore）。所用一抗為YAP（1∶1000;Abways）TAZ（1∶1000 稀釋度；Proteintech），二抗為HRP偶聯(lián)的抗鼠抗兔IgG（PⅤ-9000；北京中山金橋）。使用ECL檢測試劑（PerkinElmer）觀察蛋白質(zhì)條帶。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）反應(yīng)

使用SPSS22.0軟件（SPSS，Inc，芝加哥，伊利諾伊州，美國）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD方法，＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 蛋白質(zhì)印跡

取對數(shù)生長期的SKBR3細(xì)胞，以5×10/孔細(xì)胞接種于6孔板各孔中，每孔3 mL培養(yǎng)基。分成2組：對照組：常規(guī)培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組，給予含終濃度96.25 μmol/L二甲雙胍的DMEM高糖完全培養(yǎng)基。48 h后，使用0.25%胰酶將其消化成單細(xì)胞懸液，PBS緩沖液800 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)2次。重懸細(xì)胞于500 μL PBS（pH7.2）緩沖液中，緩慢加入500 μL預(yù)冷75%乙醇，4 ℃固定并保存。若檢測細(xì)胞凋亡，離心棄去固定液，3 mL PBS重懸5 min，1000 r/min離心5 min，棄去PBS，加入Annexin Ⅴ-熒光素（FTIC）/碘化丙啶（PI）染液雙染后上機(jī)；若檢測周期，1500 r/min離心5 min，棄上清，3 mL的PBS洗滌1次，加入400 μL PI和100 μL RNase A，4 ℃避光孵育過夜，流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測。

不斷更新發(fā)展的技術(shù)對現(xiàn)代人類社會(huì)的沖擊和影響，是前所未有的。日新月異的生活源于科學(xué)技術(shù)的不斷創(chuàng)新。金融科技行業(yè)是近幾年最具發(fā)展前景的行業(yè)之一。正如經(jīng)濟(jì)學(xué)家楊濤先生所說：“金融科技能夠使我們看到新金融的活力與魅力，我們應(yīng)該重新審視金融科技。”區(qū)塊鏈技術(shù)作為金融科技的一員，廣受全球各國各行業(yè)的追捧，由于其去中心化、匿名性、自治性、數(shù)據(jù)不可篡改、透明性的特點(diǎn)，突破了以往的信任體系，該技術(shù)的應(yīng)用場景也不斷被挖掘拓寬，涉及到金融領(lǐng)域、實(shí)體經(jīng)濟(jì)領(lǐng)域的方方面面。該技術(shù)更是可以與包括大數(shù)據(jù)、人工智能、物聯(lián)網(wǎng)等技術(shù)相融合應(yīng)用。各個(gè)國家的政府、投資機(jī)構(gòu)都大量投入資金用于區(qū)塊鏈在各領(lǐng)域的應(yīng)用研究。

1.7 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

纖連蛋白的相對表達(dá)量從1.053降低到0.893，N－鈣粘蛋白的相對表達(dá)量從1.017降低到0.603，波形蛋白的相對表達(dá)量從1.083降低到0.447，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，圖3）。E－鈣粘蛋白（E-cadherin）的相對表達(dá)量從0.823升高到1.43，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)分組如下：對照組，常規(guī)培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組，給予含終濃度96.25 μmol/L二甲雙胍的DMEM高糖完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，使用RNA Isolation Kit（南京華贊生物科技有限公司）從培養(yǎng)細(xì)胞中提取總RNA。使用SYBR Green PreMix HS qPCR Kit（ACCURATE BIOTECHNOLOGY HUNAN CO，LTD）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RTPCR。所有實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)，并以GAPDH為內(nèi)參。本研究中使用的引物對如下：

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍抑制SKBR3細(xì)胞的增殖

流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測結(jié)果顯示：對照組的凋亡細(xì)胞比例僅為3.92%，而經(jīng)二甲雙胍處理的細(xì)胞凋亡比例明顯增多，達(dá)到24.5%(圖2A）。與對照組比較，SKBR3細(xì)胞經(jīng)二甲雙胍處理后，G1期的細(xì)胞比例明顯增多，而G2/M期的細(xì)胞比例減少（圖2B）。

表3還表明，在不同分位點(diǎn)上，β的估計(jì)值存有比較明顯的差異：第一，不同分位點(diǎn)上，對于不同期貨合約下，β存在明顯差異；第二，隨著分位數(shù)的增大，不同期貨合約下，β有變小的趨勢，由此說明，隨著原油期貨價(jià)格的上漲，期貨價(jià)格對現(xiàn)貨價(jià)格的引導(dǎo)作用不斷下降。

2.2 二甲雙胍促進(jìn)SKBR3細(xì)胞凋亡并影響其細(xì)胞周期

與空白對照相比，二甲雙胍以劑量和時(shí)間依賴的方式抑制SKBR3細(xì)胞的生長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01），IC值為96.25 μmol/L（72 h）（圖1A）。克隆形成實(shí)驗(yàn)同樣顯示，隨著二甲雙胍濃度的增加，克隆形成的數(shù)量減少（圖1B）。

2.3 二甲雙胍能夠降低SKBR3細(xì)胞中EMT的轉(zhuǎn)錄活性

取對數(shù)生長期的SKBR3細(xì)胞，以2×10/孔接種于提前鋪有滅菌爬片的24孔板內(nèi)，待細(xì)胞長至70%密度時(shí)，對照組常規(guī)培養(yǎng)，加藥組給予終濃度為96.25 μmol/L二甲雙胍，培養(yǎng)48 h后，使用PBS洗2次，4%多聚甲醛固定30 min后，PBS洗3次；0.1%Triton X-100作用30 min，PBS洗3次；山羊血清封閉1 h后，加入一抗抗體（YAP，1∶100），4 ℃孵育過夜；PBS洗3次，室溫加入熒光二抗（1∶100）孵育2 h，避光加入DAPI（每孔10 μL）染核5 min后，PBS洗3次，取出細(xì)胞爬片放于滴有抗熒光淬滅劑的載玻片上，熒光顯微鏡下拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

將SKBR3細(xì)胞接種在6孔板（100/孔）中并使其貼壁過夜。細(xì)胞用指定濃度的二甲雙胍處理72 h，并用不含藥物的新鮮培養(yǎng)基替換。在孵育10 d結(jié)束時(shí)，將平板用4%多聚甲醛固定并用0.2%結(jié)晶紫染色。

2.4 二甲雙胍下調(diào)了YAP/TAZ的表達(dá)

定量PCR檢測結(jié)果顯示二甲雙胍能夠抑制YAP/TAZ mRNA水平的表達(dá)，YAP的相對表達(dá)量從1.077降低到0.293，TAZ的相對表達(dá)量從1.027降低到0.22，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，圖4A）。同時(shí)，三個(gè)主要的YAP/TAZ下游基因EGFR相對表達(dá)量從1.013降低到0.47、CTGF 相對表達(dá)量從1.027 降低到0.28，CYR61相對表達(dá)量從1.04降低到0.13，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，圖4B）。Western blot結(jié)果顯示隨著二甲雙胍濃度的增高，SKBR3細(xì)胞中YAP和TAZ蛋白水平的表達(dá)逐漸降低。當(dāng)二甲雙胍濃度＞80 μmol/L時(shí)，YAP和TAZ表達(dá)的降低具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，圖4C～E）。

2.5 二甲雙胍處理降低SKBR3細(xì)胞中YAP/TAZ的核定位

與對照組相比，二甲雙胍處理后的SKBR3細(xì)胞中無論是熒光標(biāo)記的YAP或者TAZ，其熒光的定位更多地聚集于胞漿，而細(xì)胞核中熒光的量明顯的減少（圖5）。相對于對照組，實(shí)驗(yàn)組中YAP和TAZ的細(xì)胞內(nèi)分布發(fā)生改變，YAP和TAZ更多的分布于胞漿，而核內(nèi)轉(zhuǎn)移減少（圖5）。

為適應(yīng)隱藏層輸入的特點(diǎn),構(gòu)建短時(shí)間輸入序列,通過固定步長來確定時(shí)間序列的長度。設(shè)步長取值為L,則模型輸入為

3 討論

本研究中，二甲雙胍以劑量和時(shí)間依賴的方式抑制SKBR3細(xì)胞的生長，同時(shí)克隆形成實(shí)驗(yàn)也證實(shí)二甲雙胍處理可抑制乳腺癌細(xì)胞克隆的形成，且與劑量成正比。進(jìn)一步流式細(xì)胞術(shù)檢測證實(shí)SKBR3細(xì)胞經(jīng)二甲雙胍處理后，細(xì)胞凋亡比例增加，G1期細(xì)胞比例增多，而G2/M期細(xì)胞比例減少，提示二甲雙胍能促進(jìn)SKBR3細(xì)胞凋亡，且阻滯細(xì)胞在G1期，進(jìn)而抑制其生長。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）能將細(xì)胞間粘附緊密的不活動(dòng)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為獨(dú)立的活動(dòng)間充質(zhì)細(xì)胞，其激活在HER-2陽性乳腺癌的不良預(yù)后中起著不可或缺的作用。我們研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍處理能顯著改變上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化特征蛋白的表達(dá)。間充質(zhì)蛋白：纖連蛋白、N－鈣粘蛋白和波形蛋白轉(zhuǎn)錄活性的降低以及E－鈣粘蛋白轉(zhuǎn)錄活性的增加。說明二甲雙胍處理能減少HER2陽性乳腺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。這些結(jié)果和其他文獻(xiàn)中二甲雙胍處理的不同類型的乳腺癌細(xì)胞結(jié)果較為一致。

盡管如此，二甲雙胍對乳腺癌細(xì)胞作用的機(jī)制仍不清楚。YAP/TAZ為Hippo信號通路的兩個(gè)主要轉(zhuǎn)錄共激活因子。YAP-Hippo信號通路是由一系列蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子組成的激酶鏈，從低等動(dòng)物到高等動(dòng)物都具有高度的保守性，是一條抑制細(xì)胞生長的信號通路。YAP/TAZ的激活，可以使細(xì)胞克服接觸抑制，進(jìn)入一種不受控制的增殖狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞無限制增殖，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡，加快腫瘤的惡性發(fā)展。YAP的表達(dá)與各種癌癥的預(yù)后不良有關(guān)，YAP可以作為致癌基因在體內(nèi)外促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。近期研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可通過Hippo通路抑制腫瘤細(xì)胞活性。例如，二甲雙胍通過調(diào)節(jié)YAP活性抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞干細(xì)胞和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，還可以抑制黑色素瘤癌細(xì)胞的增殖。本研究，二甲雙胍能顯著降低YAP/TAZ基因的mRNA 和蛋白水平的表達(dá)，并且也能降低EGFR、CTGF和CYR61這3個(gè)主要的YAP/TAZ下游靶向基因的表達(dá)。說明二甲雙胍的處理，可以降低YAP/TAZ的表達(dá)，從而抑制下游通路的活性，減輕其促進(jìn)增殖、抑制凋亡的作用。YAP/TAZ的作用不僅與其表達(dá)量相關(guān)，還和其細(xì)胞內(nèi)定位有關(guān)。在上游信號因子的作用下,YAP/TAZ磷酸化并停留在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生SCFβ-TRCP介導(dǎo)的YAP/TAZ泛素化降解。如果上游信號因子被阻斷或失活，YAP/TAZ 不能被磷酸化，未被磷酸化的YAP/TAZ遷移進(jìn)入細(xì)胞核，并與TEAD等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，促進(jìn)下游靶基因的表達(dá),從而啟動(dòng)YAP/TAZ的促增殖和抗凋亡活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖。免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)二甲雙胍處理后，SKBR3細(xì)胞中YAP/TAZ的亞細(xì)胞定位更多地位于胞漿，而細(xì)胞核中的定位減少。表明，二甲雙胍能明顯抑制YAP/TAZ蛋白向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移，從而抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄。這些結(jié)果說明二甲雙胍可以有效地調(diào)節(jié)該通路，從而影響細(xì)胞的增殖凋亡。

在傳統(tǒng)的Hippo 信號通路中，LATS1/2 直接調(diào)節(jié)YAP/TAZ，促進(jìn)其胞質(zhì)滯留和蛋白酶體降解。我們研究了二甲雙胍對Hippo信號通路核心成分YAP/TAZ的影響，結(jié)果表明二甲雙胍可降低細(xì)胞中YAP/TAZ的表達(dá)，抑制其向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移，但并沒有研究YAP/TAZ上游分子與二甲雙胍的關(guān)系以及二甲雙胍是如何調(diào)節(jié)YAP/TAZ表達(dá)的改變。除了Hippo信號通路，一些其他通路也可以影響YAP/TAZ。例如，ⅤGLL4可以抑制YAP介導(dǎo)的惡性增殖和腫瘤發(fā)生，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制功能。因此，后期實(shí)驗(yàn)中，我們將進(jìn)一步研究二甲雙胍與Hippo通路的關(guān)系。