不孕不育是生殖系統(tǒng)難治性疾病，男性因素引起的約占50%，而活性氧（ROS）介導(dǎo)的精子損傷是30%～80%不育男性致病原因。研究表明，高水平的氧化應(yīng)激會(huì)引起精子質(zhì)膜脂質(zhì)過(guò)氧化、損傷DNA完整性、破壞線粒體結(jié)構(gòu)，激活凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致精子凋亡率增加、活力下降?？寡趸委熓悄壳爸委熌行圆挥某Ｓ梅椒?，因此尋找安全、有效的新型抗氧化藥物具有重要的實(shí)用價(jià)值。

金絲桃苷是天然黃酮類(lèi)化合物，具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗細(xì)胞凋亡等生物活性，在神經(jīng)系統(tǒng)以及心血管系統(tǒng)等領(lǐng)域的研究報(bào)道較多，研究發(fā)現(xiàn)金絲桃苷通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路抑制6-羥基多巴誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元損傷；減輕過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的L02細(xì)胞損傷也依賴于Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路的激活。金絲桃苷是補(bǔ)腎中藥菟絲子的主要活性成分，菟絲子廣泛應(yīng)用于少弱精子癥的治療，而且金絲桃苷能促進(jìn)精子活力，在精液冷凍保存方面表現(xiàn)出良好的抗氧化應(yīng)激損傷作用，并可通過(guò)激活Keap1-Nrf2 和SIRT1-PGC1α信號(hào)通路減輕雷公藤誘導(dǎo)的睪丸損傷，提示金絲桃苷對(duì)生殖系統(tǒng)氧化損傷有一定的保護(hù)作用，但作用機(jī)制不清。基于上述文獻(xiàn)報(bào)道，我們推測(cè)金絲桃苷對(duì)生殖細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，也是通過(guò)激活Nrf2相關(guān)信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。因此本研究采用HO制備GC-2細(xì)胞氧化損傷模型，考察金絲桃苷對(duì)GC-2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及有效濃度范圍，并從Keap1/Nrf2/HO-1通路角度探討其作用機(jī)制，該研究為其開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)證依據(jù)，為治療男性不育新藥研發(fā)提供新來(lái)源。

這種例子有很多。同樣一件事情，不同的人會(huì)有不同的解讀，也會(huì)引起不同的情緒體驗(yàn)。同樣是報(bào)考英語(yǔ)六級(jí)，結(jié)果L和Y兩個(gè)人都沒(méi)通過(guò)。L覺(jué)得無(wú)所謂，而Y則傷心欲絕。為什么？因?yàn)長(zhǎng)認(rèn)為：這次考試只是試一試，考不過(guò)也沒(méi)關(guān)系，下次可以再來(lái)。Y卻認(rèn)為：我精心準(zhǔn)備了那么長(zhǎng)時(shí)間，竟然沒(méi)過(guò)，我真是太笨了，我還有什么用啊!

1 材料和方法

1.1 材料

金絲桃苷（純度≥98%成都普斯生物科技股份有限公司）、DMEM/High Glucose（Hyclone）、過(guò)氧化氫、氮乙酰半胱氨酸（Sigma）、CCK-8（AbMole）、核蛋白提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司Solarbio）；GSH-PX、CAT、MDA、SOD試劑盒（南京建成生物工程研究所）；雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海貝博生物）；GAPDH、Keap1抗體（成都正能生物技術(shù)有限公司）、Nrf2抗體（CST）、HO-1 抗體（Abcam）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒試劑盒（Thermo Fisher）、熒光定量PCR試劑盒（北京蘭杰柯科技有限公司biosharp）、PCNA抗體（安諾倫生物科技有限公司Abbkine）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將GC-2細(xì)胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）培養(yǎng)于10% FBS 和1%青鏈霉素雙抗的Hyclone培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

與正常組比，模型組的GSH-PX、CAT和SOD的活力顯著降低（＜0.01），MDA的含量明顯升高（＜0.01）；與模型組比，NAC組GSH-PX、CAT和SOD的活力均明顯升高（＜0.01），MDA含量明顯降低（＜0.01），金絲桃苷各組GSH-PX、CAT（＜0.05）和SOD的活力均明顯升高(＜0.01)，MDA含量均明顯降低（＜0.05，圖4）。

1.2.3 金絲桃苷對(duì)GC-2細(xì)胞活力影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GC-2細(xì)胞，調(diào)整密度為3×10/mL，100 μL/孔，接種于96孔板。分別設(shè)置正常組，金絲桃苷不同濃度組（25、50、100、200和400 μmol/L），每組3個(gè)復(fù)孔，按1.2.2方法分別培養(yǎng)24、48、72 h，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，確定金絲桃苷的保護(hù)時(shí)間及濃度。

與正常組比，模型組Keap1和Nrf2 mRNA表達(dá)顯著升高（＜0.05）；與模型組比，金絲桃苷200 μmol/L組Keap1 mRNA表達(dá)顯著下降，HO-1 mRNA表達(dá)顯著升高（＜0.01），Nrf2 mRNA表達(dá)升高，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5）。

與正常組比，模型組細(xì)胞活力顯著降低（＜0.01）；與模型組比，NAC組、金絲桃苷各組均能明顯提高HO損傷后的細(xì)胞活力，其中NAC組和200 μmol/L金絲桃苷作用最為明顯（＜0.01，圖2B）。

【設(shè)計(jì)意圖】從具體的例子出發(fā)求距離，相對(duì)來(lái)說(shuō)，計(jì)算量更小，學(xué)生有更充裕的時(shí)間去發(fā)現(xiàn)解法的多樣性，為后續(xù)求抽象的點(diǎn)線距離做好準(zhǔn)備.

觀察組神經(jīng)外科患者中男性25例,女性15例,年齡范圍在37-70歲之間,平均年齡為52.35±2.43歲,其中顱腦損傷患者20例,腦出血患者5例,腦腫瘤患者1例,腦積水患者10例,其他患者4例。

1.2.8 金絲桃苷對(duì)HO損傷GC-2細(xì)胞Keap1、Nrf2和HO-1 蛋白水平的影響 細(xì)胞分組、造模及給藥同1.2.7。收集各組細(xì)胞，洗滌、離心，加入含PMSF的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，離心吸取上清液為提取的總蛋白，細(xì)胞核蛋白提取按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，加入Loading buffer，煮沸變性，-20 ℃保存。SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PⅤDF膜上，5%奶粉封閉2 h，分別加入Keap1一抗（1∶2000），Nrf2一抗（1∶1000），HO-1 一抗（1∶1000），GAPDH 一抗（1∶5000），PCNA（1∶1000）4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次10 min，分別加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶10 000）和HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1∶10 000），室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，10 min/次。避光條件下滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑于成像系統(tǒng)檢測(cè)條帶信號(hào)。采用Image J軟件分析各條帶的灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

4、在120天后，模型土體表層總沉降量為0.6m，沉降速度進(jìn)一步下降，平均每日沉降量下降至0.40cm。

1.2.9 金絲桃苷對(duì)HO損傷GC-2細(xì)胞Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GC-2細(xì)胞，調(diào)整密度為3×10/mL，每孔1 mL，接種于24孔板。細(xì)胞分組、造模及給藥同1.2.7。棄去上清，PBS洗滌3次，用4%多聚甲醛室溫下固定15 min；PBS洗滌3次，加0.5%Triton X-100室溫孵育20 min；PBS洗3次，加入10%羊血清室溫封閉30 min；加入Nrf2抗體（1∶200），4 ℃孵育過(guò)夜；次日PBS洗3 次，加入Alexa Fluor 488（1∶200），室溫避光孵育1 h；PBS 洗3 次，加入DAPI 染色液，室溫避光染色10 min；吸去染液，PBS洗3次，每孔滴加50 μL抗熒光猝滅劑封片，熒光倒置顯微鏡下觀察Nrf2核轉(zhuǎn)位情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行描述，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-T檢驗(yàn)，以＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GC-2細(xì)胞氧化損傷模型的建立

與正常組比，50、100、150、200、250、300、350 μmol/L HO作用2、4、6 和8 h均顯著降低GC-2 細(xì)胞活力（＜0.01）。以細(xì)胞活力下降至50%左右為選取標(biāo)準(zhǔn)，150 μmol/L HO刺激2 h、100 μmol/L刺激4 h或6 h，以及50 μmol/L HO刺激8 h均符合條件。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們選取150 μmol/L HO作用2 h建立GC-2細(xì)胞氧化損傷模型（圖1）。

1.2.6 金絲桃苷對(duì)HO損傷GC-2細(xì)胞GSH-PX、CAT、SOD活力及MDA含量的影響 細(xì)胞分組、造模及給藥同1.2.4。無(wú)菌PBS清洗細(xì)胞3遍，收集細(xì)胞到EP管，1000 r/min，離心10 min，收集細(xì)胞沉淀加入PBS，超聲破碎后，取細(xì)胞上清液，按照SOD、GSH、CAT和MDA試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)各組細(xì)胞GSHPX，CAT，SOD活力及MDA含量。

2.2 金絲桃苷對(duì)GC-2細(xì)胞活力的影響

與正常組比，不同濃度金絲桃苷預(yù)保護(hù)24 h，對(duì)GC-2細(xì)胞活力沒(méi)有影響；50、100和200 μmol/L金絲桃苷預(yù)保護(hù)48 h，顯著升高細(xì)胞活力，400 μmol/L明顯降低細(xì)胞活力（＜0.05）；預(yù)保護(hù)72 h，50 μmol/L和100 μmol/L顯著升高細(xì)胞活力（＜0.05）。故選取金絲桃苷50、100、200 μmol/L濃度預(yù)處理48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖2A）。

1.2.7 金絲桃苷對(duì)HO損傷GC-2 細(xì)胞HO-1、Nrf2、Keap1mRNA水平的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GC-2細(xì)胞，調(diào)整密度為5×10/mL，2 mL/孔，接種于6孔板。設(shè)置正常組、模型組、金絲桃苷50、100、200 μmol/L組，各組孵育48 h后，除正常組外其余各組細(xì)胞加入HO（150 μmol/L）處理2 h，正常組給予等容量培養(yǎng)基。收集各組GC-2細(xì)胞按照TRIzol 試劑的說(shuō)明書(shū)提取總RNA，按照Thermo Scientific逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再進(jìn)行PCR反應(yīng)。以GAPDH 為內(nèi)參，引物如下：GAPDH 正義5'-G GTGAAGGTCGGTGTGAACG-3'，反 義5'-CTCGCT CCTGGAAGATGGTG-3'；Keap1正義5'-TGCTCAAC CGCTTGCTGTATGC-3'，反義5'-TCATCCGCCACTC ATTCCTCTCTG-3'；Nrf2 正義5'-CAGCCATGACTG ATTTAAGCAG-3'，反義5'-CAGCTGCTTGTTTTCG GTATTA-3'；HO-1 正義5'-TCCTGTACCATATCTACA CGG-3'，反義 5'-GAGACGCTTTACATAGTGCTG T-3'。采用2方法計(jì)算Keap1、HO-1及Nrf2的相對(duì)表達(dá)量。

2.3 金絲桃苷對(duì)H2O2損傷GC-2細(xì)胞活力的影響

1.2.5 金絲桃苷對(duì)HO損傷GC-2細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞分組、造模及給藥同1.2.4。用不含EDTA的胰酶消化GC-2細(xì)胞，低溫離心收集細(xì)胞。用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，加入400 μL 1×Annexin Ⅴ-FITC染色液，輕輕混勻后于2～8 ℃避光孵育15 min，再加入10 μL PI染色液后輕輕混勻，于2～8 ℃避光孵育5 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)GC-2細(xì)胞凋亡率。

2.4 金絲桃苷對(duì)H2O2損傷GC-2細(xì)胞凋亡率的影響

與正常組比，模型組細(xì)胞的凋亡率顯著增加（＜0.01）；與模型組相比，NAC組和金絲桃苷組細(xì)胞凋亡率均顯著下降（＜0.01，圖3）。

云城乳業(yè)公司的2個(gè)社會(huì)職能機(jī)構(gòu)分別由市國(guó)資委和云崗區(qū)政府接管，簽訂了移交協(xié)議；完成農(nóng)墾國(guó)有土地使用權(quán)權(quán)籍調(diào)查面積2429.94畝，完成登記發(fā)證6宗，確權(quán)面積2429.94畝，所有農(nóng)用地已完成了發(fā)證工作。云城乳業(yè)公司今年完成了“兩個(gè)3年”任務(wù)，各項(xiàng)改革工作走在了全省、全市前列，被省農(nóng)墾局、市國(guó)資委確定為系統(tǒng)內(nèi)重點(diǎn)國(guó)企改革的標(biāo)桿。

2.5 金絲桃苷對(duì)H2O2損傷GC-2 細(xì)胞GSH-PX、CAT、SOD活力及MDA含量的影響

1.2.2 GC-2細(xì)胞氧化損傷模型的建立 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GC-2細(xì)胞，調(diào)整密度為3×10/mL，100 μL/孔，接種于96孔板。分別設(shè)置正常組、HO不同濃度組（50、100、150、200、250、300、350 μmol/L），每組3 個(gè)復(fù)孔。置于37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2、4、6和8 h，CCK-8法于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各組，計(jì)算細(xì)胞活力，根據(jù)細(xì)胞活力確定HO造模濃度及時(shí)間。

2.6 金絲桃苷對(duì)H2O2損傷GC-2 細(xì)胞Keap1、Nrf2 和HO-1 mRNA的表達(dá)影響

1.2.4 金絲桃苷對(duì)HO損傷GC-2 細(xì)胞活力影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GC-2細(xì)胞，分別設(shè)置正常組、模型組、2.5 mmol/L NAC組、50、100、200 μmol/L金絲桃苷組。各組按劑量加入藥物按1.2.2方法培養(yǎng)48 h后，除正常組外其他各組加入150 μmol/L HO處理2 h，正常組給予等量培養(yǎng)基，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。

2.市級(jí)社會(huì)保險(xiǎn)費(fèi)征收機(jī)構(gòu)。各市設(shè)置社會(huì)保險(xiǎn)事業(yè)局，主要負(fù)責(zé)本市社會(huì)保險(xiǎn)經(jīng)辦業(yè)務(wù)，辦理社會(huì)保險(xiǎn)登記，受理單位和個(gè)人繳費(fèi)申報(bào)、審核并征收各項(xiàng)社會(huì)保險(xiǎn)費(fèi)。

2.7 金絲桃苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)GC-2細(xì)胞Keap1、NEs-Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響

與正常組比，模型組Keap1蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.01），Nrf2、NEs-Nrf2以及HO-1蛋白表達(dá)升高，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比，金絲桃苷100、200 μmol/L組Keap1 蛋白表達(dá)顯著下降（＜0.01），200 μmol/L組細(xì)胞NEs-Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)明顯增加（＜0.05，圖6）。

2.8 金絲桃苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)GC-2細(xì)胞Nrf2核轉(zhuǎn)位影響

由圖7可見(jiàn)正常組Nrf2在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均分布。與正常組比，模型組細(xì)胞由于受到過(guò)氧化氫的氧化損傷，激發(fā)細(xì)胞自身的保護(hù)機(jī)制，Nrf2出現(xiàn)了輕微的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。與模型組相比，金絲桃苷組GC-2細(xì)胞核內(nèi)Nrf2含量增加，與細(xì)胞核的重合度增高，出現(xiàn)了明顯的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象（＜0.05，圖7）。

3 討論

盡管精子的生理功能需要低水平的ROS，但過(guò)度氧化應(yīng)激會(huì)嚴(yán)重影響男性生育能力，造成“男性氧化應(yīng)激不孕癥”。氧化應(yīng)激目前被認(rèn)為是男性不育的主要原因，抗氧化療法已被引入到治療男性不育癥的常規(guī)臨床實(shí)踐中。精子細(xì)胞對(duì)氧化損傷高度敏感，一方面由于精子質(zhì)膜富含不飽和脂肪酸，易受ROS的攻擊，發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)；另一方面精子細(xì)胞質(zhì)少，SOD、GSH-PX、CAT等抗氧化酶含量低，對(duì)MDA等氧化損傷產(chǎn)物的清除能力低。一旦氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而造成精子結(jié)構(gòu)與功能損害。Dorostghoal等研究發(fā)現(xiàn)：男性不育癥患者精漿中SOD、GSH-PX活力顯著下降，MDA含量明顯升高，而且MDA含量與精子活力和正常形態(tài)呈負(fù)相關(guān)。本研究采用HO進(jìn)行處理GC-2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)模型組細(xì)胞活力、SOD、GSH-PX、CAT活力明顯下降，MDA含量和細(xì)胞凋亡率顯著升高，說(shuō)明HO造成了GC-2細(xì)胞氧化損傷；給予不同濃度金絲桃苷進(jìn)行預(yù)保護(hù)，能明顯提高GC-2細(xì)胞SOD、GSH-Px和CAT活力，降低MDA含量和細(xì)胞凋亡率，提示金絲桃苷對(duì)氧化應(yīng)激損傷有一定的保護(hù)作用。

根據(jù)數(shù)字新媒體時(shí)代的背景，有效更新教學(xué)方法是對(duì)視覺(jué)傳達(dá)設(shè)計(jì)教學(xué)的必然要求。由于我國(guó)長(zhǎng)期以來(lái)形成的重理論、輕實(shí)踐的教學(xué)背景，當(dāng)實(shí)踐教學(xué)的要求越來(lái)越高時(shí)，教師往往表現(xiàn)出對(duì)現(xiàn)實(shí)束手無(wú)策的狀態(tài)。首先，教師不能有效地學(xué)習(xí)和借鑒國(guó)外先進(jìn)的教學(xué)方法；其次，教師不能根據(jù)具體教學(xué)問(wèn)題對(duì)教學(xué)方法進(jìn)行必要的創(chuàng)新和改進(jìn)；最后，數(shù)字新媒體對(duì)視覺(jué)傳達(dá)教學(xué)形成的巨大沖擊，使不少教師盲目照搬國(guó)外的教學(xué)方法，完全摒棄了傳統(tǒng)教學(xué)方法的精華，這種做法也是不可取的。

Nrf2是細(xì)胞調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，以維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原的動(dòng)態(tài)平衡。正常生理狀態(tài)下，Nrf2與特異性受體Keap1形成二聚體，存在于細(xì)胞漿中，并在泛素蛋白酶作用下持續(xù)降解而保持較低水平，維持細(xì)胞的酶類(lèi)和抗氧化物處于基礎(chǔ)表達(dá)狀態(tài)；在氧化應(yīng)激等反應(yīng)刺激下，Nrf2從Keap1中解離，易位至細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，激活HO-1、SOD等下游基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，從而增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力；上調(diào)Nrf2/HO-1表達(dá)，可增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化、抗凋亡活性，抑制Nrf2表達(dá)，則細(xì)胞凋亡增加。本研究發(fā)現(xiàn)：HO處理GC-2細(xì)胞，模型組細(xì)胞Keap1、Nrf2和HO-1表達(dá)的增加，可能與氧化應(yīng)激激活細(xì)胞的自身抗氧化系統(tǒng)，促進(jìn)Keap1與Nrf2解離及Nrf2核轉(zhuǎn)位有關(guān)；金絲桃苷預(yù)保護(hù)后，能顯著降低Keap1的表達(dá)，并進(jìn)一步促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位和HO-1的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化作用。

綜上可見(jiàn)，金絲桃苷對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的GC-2細(xì)胞氧化損傷具有明顯保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過(guò)調(diào)控Keap1/Nrf2/HO-1通路，抑制Keap1表達(dá)，促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位，影響下游HO-1等蛋白表達(dá)。由于本次研究?jī)H從細(xì)胞分子水平出發(fā)，缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，后續(xù)研究將采用動(dòng)物模型進(jìn)一步確證其對(duì)男性生殖系統(tǒng)氧化損傷的保護(hù)作用及分子作用機(jī)制，為其開(kāi)發(fā)利用打下基礎(chǔ)。