肝細(xì)胞癌（HCC）近幾十年來發(fā)病率上升，雖然在臨床和實(shí)驗(yàn)性癌癥治療方面取得了很大進(jìn)展，但由于術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高，HCC患者的總體預(yù)后較差。肝癌的發(fā)生發(fā)展可能是一個(gè)多因素、多步驟的過程，但目前關(guān)于其具體的分子機(jī)制尚不清楚。因此，更好地了解HCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對肝癌靶向治療具有重要意義。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）由多種大分子組成，包括膠原蛋白、纖維連接蛋白、彈性蛋白、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸和蛋白多糖。ECM作為腫瘤微環(huán)境中含量最豐富的成分，可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞行為和腫瘤進(jìn)展，膠原蛋白是ECM的主要成分，具有促進(jìn)腫瘤發(fā)展的作用，例如I型膠原是主要的纖維膠原，在多種癌癥中高表達(dá)，通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和化療耐藥促進(jìn)癌癥的進(jìn)展。Ⅳ型膠原是基底膜形成所需的非纖維性膠原，它促進(jìn)腫瘤細(xì)胞粘附和遷移。

賦礦層礁灰?guī)r礁灰?guī)r存在許多孔隙，如沉積物原生孔洞（隙）、砂（礫）之間空隙、巖石（層）之間差異收縮裂（空）隙、層間裂隙等，這些孔洞（隙）成為儲礦空間含礦。

脯氨酸4-羥化酶II（P4HA2）是膠原蛋白形成的關(guān)鍵酶，可以催化膠原蛋白中的脯氨酸羥化，形成羥脯氨酸，促進(jìn)膠原蛋白形成正確的空間結(jié)構(gòu)。P4HA2可以通過增加膠原的生成來調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的行為，P4HA2與缺氧、膠原蛋白的沉積、糖酵解以及癌細(xì)胞的遷移侵襲有很大的相關(guān)性，并且P4HA2在許多腫瘤中表達(dá)增加，如乳腺癌、前列腺癌和宮頸癌。有研究表明阿司匹林通過抑制NF-κB 和LMCD1-AS1/let-7g軸靶向調(diào)控P4HA2來抑制肝癌的進(jìn)展，但現(xiàn)有研究未進(jìn)一步闡明P4HA2與肝癌之間的分子機(jī)制。

本研究利用數(shù)據(jù)庫對P4HA2的表達(dá)及預(yù)后進(jìn)行預(yù)測，之后構(gòu)建P4HA2沉默模型，通過功能缺失性實(shí)驗(yàn)來觀察P4HA2在肝癌細(xì)胞系中的增殖、遷移侵襲作用，旨在闡明P4HA2通過激活PI3K/AKT/mTOR通路來促進(jìn)肝癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展，為肝癌的診斷及治療尋求新的腫瘤標(biāo)志物及腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

在哈貝馬斯看來，只有到了晚期資本主義社會，科學(xué)技術(shù)才成為一種意識形態(tài)，而不是馬爾庫塞所認(rèn)為的任何社會階段。在晚期資本主義社會中，科學(xué)技術(shù)成為意識形態(tài)并具有了與舊意識形態(tài)不同的新意識形態(tài)特點(diǎn):

1 材料和方法

1.1 材料

5'-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3'。

1.2 方法

造成列車通信網(wǎng)絡(luò)故障的原因多種多樣。從表面上來看，故障主要表現(xiàn)為整個(gè)網(wǎng)絡(luò)通信不穩(wěn)定、多個(gè)設(shè)備頻繁離線，或者某一個(gè)設(shè)備離線。對于第一種故障情況，故障原因往往較為復(fù)雜，這里不做詳述，本文將重點(diǎn)針對第二種故障情況進(jìn)行研究和分析，結(jié)合現(xiàn)場實(shí)際發(fā)生的故障深入探究。

其一，履行判決。依據(jù)《行政訴訟法》第78條，行政機(jī)關(guān)不依法履行、未按照約定履行行政協(xié)議的，人民法院判決行政機(jī)關(guān)承擔(dān)繼續(xù)履行、采取補(bǔ)救措施或者賠償損失等責(zé)任。依據(jù)《稅收征管法》的規(guī)定，納稅人在提起行政訴訟之前存在著“納稅前置”。如法院認(rèn)為預(yù)約裁定合法有效且納稅人的交易事項(xiàng)確乎符合裁定約定的，應(yīng)判決稅務(wù)機(jī)關(guān)履行預(yù)約裁定，稅務(wù)機(jī)關(guān)應(yīng)向納稅人返還多繳納的稅款并且向納稅人賠償多繳納的稅款在此期間所產(chǎn)生的利息損失(建議按同期銀行貸款利率計(jì)算)。另外，如果稅務(wù)機(jī)關(guān)在預(yù)約裁定中對稅法作出的行政解釋與上位法相抵觸，但納稅人屬于善意不知情的情況下，基于信賴保護(hù)原則，法院仍應(yīng)作出履行判決。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞系（SMMC-7721、Hep-G2、HUH7、SNU-449和Hep3B）和人正常肝細(xì)胞（L-02）分別在含10%胎牛血清、1%的青霉素-鏈霉素的RPMI 1640或DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，放置于37 ℃，含5%CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，1～2 d換液，待細(xì)胞長到90%以上傳代或繼續(xù)其他實(shí)驗(yàn)。

式中，|[Hvr(r2,r1，ωi)|描述了幅頻特性；φvr(r2,r1，ω)描述了相頻特性。φvr(r2,r1，ω)的計(jì)算公式為

1.2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染 以攜帶特異性針對人P4HA2基因的shRNA 重組慢病毒載體（shP4HA2-1、shP4HA2-2、shP4HA2-3）感染Hep3B和SNU449細(xì)胞，構(gòu)建P4HA2低表達(dá)的SNU-449和Hep3B細(xì)胞，以shRNA-陰性對照為對照組（NC），轉(zhuǎn)染后用嘌呤霉素篩選。干擾序列見表1。

1.2.4 qRT-PCR 細(xì)胞經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后使用Trizol提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如下：

5'-GTGGACATCCGCAAAGAC-3'，

5'-GGCCTGGTTTGGTGTCCTG3'，

等效電流源iP(t)繼續(xù)減小,當(dāng)電流源為負(fù)半周期時(shí),VA>VB時(shí),PMOS管MP 1截止,比較器CMP2輸出低電平,NMOS管MN2也截止。同理,整流電路可以被劃分為與輸入信號正半周期對應(yīng)的3種操作狀態(tài)。

P4HA2-Reverse:

5'-GCCCAGCTCTTAATCTTGGAAAG3'。

β-Actin-Forward:

P4HA2-Forward:

（3）冷卻結(jié)晶。四鉬酸銨溶于氨溶液后生成正鉬酸銨溶液，通過自然冷卻，鉬即以七鉬酸銨結(jié)晶析出。其反應(yīng)式如下：

2001-2012年海南省入境旅游者人均天消費(fèi)總體呈波動上升趨勢，增長了30.03美元，排名從第二十五名上升至第二十名。人均天消費(fèi)與全國平均值差距越來越小，縮小了9.3美元。其中外國游客人均天消費(fèi)增長了20.9美元，港澳臺游客人均天消費(fèi)增長了146.6美元。同時(shí)，港澳臺游客人均天消費(fèi)的增長量大于外國游客，約是外國游客的5倍。其12年間增長的速度也比外國游客增長的速度快，增長了8.65%。海南省入境旅游者人均天消費(fèi)構(gòu)成中，長途交通所長比重較大。2012年海南省入境旅游者人均天消費(fèi)主要在提高層次方面的消費(fèi)，在購物和娛樂方面消費(fèi)較多，說明海南省旅游業(yè)發(fā)展越來越健康。

β-Actin-Reverse:

人肝癌細(xì)胞系SNU-449、Hep-3B（武漢普諾賽公司）。sh-P4HA2 慢病毒構(gòu)建由武漢漢恒生物公司構(gòu)建完成，胎牛血清（clark）；DMEM、1640 培養(yǎng)基（Gibco）；CCK-8 試劑盒（碧云天）。Tranwell 小室（Corning），P4HA2、E-cadherin、N-cadherin、snail、β-actin、p-Akt 抗體（Proteintech）；p-PI3K（ABcam）；p-mTOR（Cell Signaling Technology）。

采用qRT-PCR和Western blot法檢測肝癌細(xì)胞株和正常肝細(xì)胞中P4HA2的表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常肝細(xì)胞L-02相比，P4HA2在肝癌細(xì)胞株SNU-449、HepG2、Huh7、Hep3B中的表達(dá)均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中Hep3B中的表達(dá)增強(qiáng)最為明顯（＜0.01，圖1E、F）。因此選擇Hep3B和SNU-449細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞接種于六孔板中，24 h后用10 μL短槍頭劃痕，PBS洗滌后加入完全培養(yǎng)基，觀察0 h、24 h 后遷移情況，用顯微鏡拍攝細(xì)胞間隙，用ImageJ軟件分析。

1.2.7 Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲 用胰酶消化各組細(xì)胞并計(jì)數(shù)，在無血清培養(yǎng)基中制備細(xì)胞懸液，密度為5×10/孔。對于細(xì)胞侵襲，Matrigel解凍后用基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋10倍，然后加到上層小室，放入37 ℃培養(yǎng)箱中1～2 h。之后將細(xì)胞接種于涂有Matrigel的上室，下室加入800μL完全培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h。對于細(xì)胞遷移，使用無Matrigel的小室，同樣方法培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，然后用純水洗滌漂浮色，棉簽拭去未穿過的細(xì)胞并在光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

(1) F1斷層：位于區(qū)內(nèi)近東西向山梁的東側(cè)、西側(cè)山溝的西部邊緣，走向北北東10°～20°，傾向南東，傾角50°～70°。正斷層，斷層帶兩側(cè)地層明顯錯(cuò)動，巖層破碎，地形上多呈陡坎或沖溝，富水性好。

1.2.8 克隆形成實(shí)驗(yàn) 將shP4HA2組和NC組按500/孔接種到六孔板中，培養(yǎng)5 d左右，待長出可見的細(xì)胞團(tuán)即可固定染色，拍照計(jì)數(shù)。

1.2.9 熒光克隆實(shí)驗(yàn) 將兩組細(xì)胞分別接種到96孔板中（2000/孔），并在溫箱中孵育5 d，每天用熒光顯微鏡拍照測定。

1.2.1 生物信息學(xué)分析 通過GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/）、Human Protein Atlas（https://www.proteinatlas.org/）分析P4HA2的表達(dá)及相關(guān)指標(biāo)，KM plotter（http://kmplot.com/analysis/）數(shù)據(jù)庫評估P4HA2的預(yù)后作用。

1.2.10 Western blot 收取shP4HA2組和NC組細(xì)胞，加入適量RIPA、PMSF冰上裂解，BCA法蛋白定量。SDSPAGE電泳分離后，然后轉(zhuǎn)至PⅤDF膜上。室溫下快速封閉液封閉15 min，隨后一抗（1∶1000）在4 ℃下?lián)u床過夜，次日用二抗孵育2 h，TBST洗膜3次之后ECL顯影，檢測蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0、Graph Pad軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，定量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采取獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P4HA2在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況與預(yù)后關(guān)系

GEPIA數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，P4HA2在肝癌組織表達(dá)上調(diào)（160例為癌旁組織，369例為肝癌組織）（＜0.05，圖1A）。HPA數(shù)據(jù)庫P4HA2在蛋白水平表達(dá)上也顯示升高（圖1B）。在線數(shù)據(jù)庫GEPIA、Kaplan-Meier Plotter評估P4HA2在HCC患者中的預(yù)后,結(jié)果顯示，P4HA2的表達(dá)越高，HCC患者的總生存率和疾病特異性生存期越短（＜0.05，圖1C、D）。

1.2.5 CCK-8實(shí)驗(yàn) 在Hep-3B細(xì)胞中，將shP4HA2組和NC 組按2000/孔接種到96 孔板中，SNU-449 細(xì)胞3000/孔。復(fù)孔5個(gè)/組，分別于24、48、72、96 h加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃培養(yǎng)4 h后，檢測吸光度值。

2.2 構(gòu)建P4HA2沉默模型

攜帶P4HA2 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，qRTPCR和Western blot檢測在Hep3B和SNU-449細(xì)胞系中shP4HA2組的P4HA2 mRNA和蛋白表達(dá)效果，其中shP4HA2-3組的沉默效果最好（＜0.05，圖2）。因此選擇shP4HA2-3進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 沉默P4HA2抑制Hep3B和SNU-449細(xì)胞的增殖

熒光克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，shP4HA2組細(xì)胞較NC組細(xì)胞增殖能力下降（＜0.05，圖3A）；CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，沉默P4HA2 基因抑制Hep3B 和SNU-449細(xì)胞系的增殖活力（＜0.05，圖3B）；細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，shP4HA2組細(xì)胞的集落數(shù)目較NC組明顯減少，集落數(shù)目差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.01，圖3C）。

2.4 沉默P4HA2抑制Hep3B和SNU-449細(xì)胞的遷移和侵襲能力

創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)顯示，與NC 組相比，shP4HA2 組24 h劃痕寬度較寬，沉默P4HA2降低了Hep3B和SNU-449細(xì)胞的創(chuàng)傷愈合能力（＜0.01，圖4）。Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，shP4HA2組與NC組相比，24 h穿過小室膜的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯減少（＜0.01，圖5）。

2.5 沉默P4HA2阻礙肝癌細(xì)胞系上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

Western blot結(jié)果顯示，shP4HA2組E-cadherin的蛋白表達(dá)水平較NC組增加，而N-cadherin和Snail的表達(dá)下降（＜0.05，圖6）。

2.6 沉默P4HA2抑制Hep3B和SNU-449細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活

Western blot結(jié)果顯示，與NC組相比，sh-P4HA2組抑制了Hep3B和SNU-449細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt和pmTOR蛋白的表達(dá)（＜0.05，圖7）。

3 討論

肝癌的發(fā)展經(jīng)常與炎癥和纖維化相關(guān)。其中，細(xì)胞外基質(zhì)的沉積在纖維化過程中起著重要作用，例如它可促進(jìn)細(xì)胞生長、存活、遷移、粘附、血管生成，進(jìn)而導(dǎo)致癌癥進(jìn)展。膠原作為細(xì)胞外基質(zhì)中含量最豐富的成分，通過提高組織的硬度和抗拉強(qiáng)度，來維持細(xì)胞外結(jié)構(gòu)。P4HA2是膠原合成的關(guān)鍵蛋白，在促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展中起著重要作用。它參與了多個(gè)生物學(xué)過程，如膠原成熟、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤進(jìn)展中ECM的異常構(gòu)建以及阿爾茲海默癥中淀粉樣蛋白β的沉積。P4HA2與肝纖維化相關(guān)性肝癌的發(fā)生有關(guān)，因此研究P4HA2在肝癌中的表達(dá)具有重要意義。本研究通過GEPIA、Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫顯示，與癌旁組織相比，P4HA2在肝癌組織中表達(dá)增高。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析P4HA2與腫瘤預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示P4HA2表達(dá)越高，預(yù)后越差，總生存率、疾病特異性生存期均顯著縮短。Western blot和QRT-PCR結(jié)果也顯示，與正常肝細(xì)胞L-02相比，P4HA2在其他肝癌細(xì)胞中表達(dá)增加，與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致。

P4HA2在多種腫瘤中表達(dá)增加，其過表達(dá)與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、預(yù)后有密切的相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn)在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，P4HA2的表達(dá)上調(diào)與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，P4HA2可通過誘導(dǎo)膠原沉積促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移。本研究為了驗(yàn)證P4HA2與肝癌細(xì)胞的功能，用攜帶P4HA2 shRNA的慢病毒載體轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系Hep-3B、SNU-449，構(gòu)建沉默表達(dá)模型。CCK-8、克隆斑、劃痕、transwell等實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示沉默P4HA2后肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力降低，提示P4HA2在肝癌的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用。EMT常發(fā)生于腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的早期階段，細(xì)胞經(jīng)歷從上皮極化到間充質(zhì)成纖維細(xì)胞的形態(tài)轉(zhuǎn)化，參與侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移相關(guān)的化療耐藥。已有文獻(xiàn)報(bào)道膠原蛋白的生物合成和沉積與癌癥進(jìn)展中的EMT過程密切相關(guān)。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，P4HA2通過膠原依賴的PI3K/AKT通路激活EMT促進(jìn)癌癥的進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞系Hep3B和SNU-449中沉默P4HA2后，E-cadherin的表達(dá)增加，N-cadherin、Snail的表達(dá)下降，從而抑制腫瘤細(xì)胞EMT的過程，這些發(fā)現(xiàn)揭示了P4HA2通過EMT過程抑制HCC細(xì)胞遷移和侵襲。

PI3K/Akt/mTOR信號通路調(diào)控多種細(xì)胞功能，如增殖、存活、遷移和代謝；并且與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在非小細(xì)胞肺癌中，PI3K/AKT/mTOR通路與腫瘤發(fā)生和疾病進(jìn)展密切相關(guān)。在乳腺癌中，PI3K/AKT/mTOR與細(xì)胞轉(zhuǎn)化、腫瘤發(fā)生、癌癥進(jìn)展和耐藥性相關(guān)。本研究利用Western blot檢測PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，P4HA2基因被敲除后，p-PI3K、p-AKT和p-mTOR均受到抑制，而總蛋白卻沒有發(fā)生明顯改變，表明P4HA2可能通過影響PI3K/AKT/mTOR途徑而調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)對P4HA2和HCC之間做了初步的體外實(shí)驗(yàn)，并且進(jìn)行了部分凋亡方面的預(yù)實(shí)驗(yàn)，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果總是容易反復(fù)，需進(jìn)一步進(jìn)行探索。所以要徹底了解P4HA2其內(nèi)在機(jī)制，需要進(jìn)行包括體內(nèi)實(shí)驗(yàn)在內(nèi)的一系列深入研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明P4HA2在肝癌細(xì)胞中上調(diào)，可能通過PI3K/AKT/mTOR通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展，為肝癌的診斷及治療尋求新的腫瘤標(biāo)志物及腫瘤治療的新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。