胃癌是消化系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率高，目前手術(shù)治療是胃癌根治術(shù)的首選方法，但是由于胃癌發(fā)現(xiàn)時多屬于晚期，手術(shù)療效差，導(dǎo)致術(shù)后生存率較低。胃癌的轉(zhuǎn)移和癌細(xì)胞的惡性增殖是影響其預(yù)后的重要因素，腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為受多種基因調(diào)控。近年的研究已報道多種蛋白分子在胃癌組織中異常表達(dá)與胃癌患者生存率低相關(guān)，但是仍存在特異性較低，無法在臨床中應(yīng)用并推廣等問題。因此，尋找特異性強(qiáng)且預(yù)測價值高的分子標(biāo)志物并應(yīng)用于臨床是目前亟待解決的問題。乙醛脫氫酶3B1（ALDH3B1）是乙醛脫氫酶家族的重要成員，研究表明ALDH3B1在肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌和卵巢癌等癌組織中異常表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)ALDH3B1在人肺腺癌中高表達(dá)與患者預(yù)后不良密切相關(guān)，可作為肺腺癌的獨立預(yù)后生物標(biāo)志物。但是，ALDH3B1在胃癌組織中的表達(dá)、與患者遠(yuǎn)期預(yù)后的關(guān)系及其對胃癌細(xì)胞惡性行為的影響尚未見報道。本研究通過采用免疫組織化學(xué)分析ALDH3B1在胃癌組織中的表達(dá)情況，進(jìn)一步分析其對手術(shù)遠(yuǎn)期預(yù)后的評估價值以及對胃癌細(xì)胞的作用，以期為胃癌的發(fā)病機(jī)制及預(yù)后評估指標(biāo)提供線索，為臨床診療提供新的視角。

1 資料和方法

1.1 資料采集方法

納入分析2013年1月～2016年11月在我院接受胃癌根治術(shù)的患者101例。所有患者均經(jīng)臨床及病理檢查明確診斷為原發(fā)性胃癌并成功施行D2胃癌根治術(shù)；患者術(shù)前均未接受過放療或化療，診斷無其他組織起源的惡性腫瘤。采集患者3種疾病相關(guān)資料，包括住院期間臨床資料：通過永久保存的電子病歷系統(tǒng)采集性別、年齡、腫瘤臨床分期、手術(shù)病理診斷、術(shù)前腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)癌胚抗原（CEA）及糖抗原19-9（CA19-9）等；生存資料：通過電話隨訪采集患者術(shù)后生存情況，確定術(shù)后5年腫瘤相關(guān)性死亡是否發(fā)生及時間；手術(shù)病理蠟塊：從病理科調(diào)取癌組織及癌旁組織蠟塊，并進(jìn)行ALDH3B1免疫組織化學(xué)染色。本項目經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：倫科批字[2021]第221號）。另于我院《消化系統(tǒng)腫瘤生物標(biāo)本庫系統(tǒng)》中調(diào)取15例胃癌患者癌組織和癌旁組織冰凍標(biāo)本（液氮保存）用于驗證ALDH3B1 的基因表達(dá)（倫理批件號：2020KY022）。

2.5 腹腔灌注并發(fā)癥的防治 腹腔化療最常見的并發(fā)癥是大容量化療藥液注入腹腔后有腹脹感，但可耐受。其次為化學(xué)性腹膜炎，一般與藥物的種類和劑量有關(guān)，表現(xiàn)為腹疼、腹脹、腹瀉，重者可有發(fā)熱。另外還可見有惡心、嘔吐、白細(xì)胞減少、藥物外滲、持續(xù)性腸麻痹，嚴(yán)重者可出現(xiàn)腸瘺、吻合口瘺和腸粘連、粘連性腸梗阻。應(yīng)避免選擇對腹腔有較強(qiáng)刺激的藥物，充分的腹腔灌注量，灌注液中加利多卡因、地塞米松，反復(fù)活動變換體位等，均可減少腹腔粘連和化學(xué)性腹膜炎的發(fā)生［2］。

熱水器的進(jìn)水流量是影響加熱時間的重要因素，也會影響熱水器加熱過程中熱水所能達(dá)到的最終溫升。同樣將熱水溫升與加熱時間的數(shù)學(xué)模型導(dǎo)入MATLAB軟件進(jìn)行模擬計算，進(jìn)水流量按文獻(xiàn)[5]確定的合理進(jìn)水流量區(qū)間9～16 L/min以2為步長進(jìn)行劃分，其余參數(shù)見表1，熱水溫升與加熱時間的關(guān)系曲線如圖4所示。

1.2 診斷及標(biāo)準(zhǔn)

胃癌的最終診斷依據(jù)手術(shù)標(biāo)本病理檢查結(jié)果，臨床診斷及病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國腫瘤聯(lián)合會（AJCC）及國際抗癌聯(lián)盟（UICC）制定的第7版胃癌診斷及分期系統(tǒng)。

1.3 檢測方法

1.3.1 腫瘤標(biāo)志物檢測 CA19-9及CEA采用雅培全自動化學(xué)發(fā)光分析儀及其配套試劑檢測完成，CA19-9的陽性閾值為≥37 kU/L，CEA的陽性閾值為≥5 μg/L。

數(shù)據(jù)分析采用SPSS Statistics 26.0軟件，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用檢驗分析；計數(shù)資料的組間比較采用χ檢驗，樣本量小于5采用Fisher精確檢驗法；相關(guān)性分析采用Spearman檢驗；術(shù)后生存率采用Kaplan-Meier（K-M）曲線表示，組間比較采用Log-rank χ檢驗；影響胃癌術(shù)后5年生存率的多因素分析采用Cox比例風(fēng)險回歸模型（Enter法）；ALDH3B1預(yù)測胃癌術(shù)后5年癌性致死的診斷價值采用受試者工作曲線（ROC）分析，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。

隨著互聯(lián)網(wǎng)的進(jìn)程加快，數(shù)據(jù)量日益需求，使數(shù)據(jù)形態(tài)多樣化，不僅有傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)化數(shù)據(jù)，更多的是非結(jié)構(gòu)和半結(jié)構(gòu)化數(shù)據(jù)。

現(xiàn)代學(xué)徒制在具體的實踐過程中，必須有企業(yè)的參與，不論是人才培養(yǎng)模式的修訂、人才培養(yǎng)方案的制定等，都是建立在學(xué)校和企業(yè)深度合作的基礎(chǔ)上的。目前校企合作的方式主要有校辦企業(yè)、引企入校和建立合作企業(yè)等多種方式。

1.3.4 ALDH3B1調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖檢測（CCK-8） 胃癌細(xì)胞系（MGC-803）來源于國家生物醫(yī)學(xué)實驗細(xì)胞資源庫（資源編號：1101HUM-PUMC000660），使用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃的5%CO培養(yǎng)箱中。對MGC-803細(xì)胞采用慢病毒特異性干擾和過表達(dá)ALDH3B1（吉凱基因），使用過表達(dá)ALDH3B1載體和對照空載體（質(zhì)粒GⅤ358）、干擾ALDH3B1載體（siRNA：GCTGAAGCCATCGGAGATTAG）和對照空載體（質(zhì)粒GⅤ248）進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染MGC803細(xì)胞。將MGC803細(xì)胞接種到6孔板中，待細(xì)胞貼壁達(dá)到70%～80%后，加入含有慢病毒（1×10TU/mL）及感染增強(qiáng)液HitransG P 的完全培養(yǎng)基進(jìn)行感染以及嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，經(jīng)免疫印跡法驗證基因調(diào)控效果。CCK8 實驗分為正常對照組（NC）、干擾組（Si-ALDH3B1）和過表達(dá)組（LⅤ-ALDH3B1），將基因調(diào)控后的MGC-803細(xì)胞接種于96孔板中，置于37 ℃的5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，采用CCK-8試劑盒（索萊寶：CA1210）檢測細(xì)胞增殖情況，測定。

1.3.5 ALDH3B1調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲檢測 將以上3組MGC-803 細(xì)胞接種于Transwell 小室（8 μm 孔徑，Corning）中，將1 mL完全培養(yǎng)液加入下室，培養(yǎng)48 h，Transwell小室細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min，1%結(jié)晶紫染色30 min，計數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)量。對于侵襲檢測，將100 μL的基質(zhì)膠均勻地分布在Transwell小室上，同樣檢測侵襲的細(xì)胞數(shù)量。

以ALDH3B1相對表達(dá)量的中位數(shù)（4.66）為界將患者分為ALDH3B1 低表達(dá)組（=50）和高表達(dá)組（=51）。兩組患者性別、年齡及腫瘤大小差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）；ALDH3B1高表達(dá)組患者CEA≥5 μg/L、CA19-9≥37kU/L、T分期為3～4期及N分期為2～3期的比例高于ALDH3B1低表達(dá)組（＜0.05，表1）。

1.4 觀察指標(biāo)

采用免疫組化法和熒光定量PCR 法分析ALDH3B1 在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)差異以及與Ki67表達(dá)量的相關(guān)性；分析ALDH3B1的表達(dá)量與患者術(shù)前CEA 及CA19-9 間的相關(guān)性；以患者癌組織中ALDH3B1表達(dá)量的中位數(shù)為界將患者分為ALDH3B1高表達(dá)組及低表達(dá)組，并比較兩組術(shù)后5年生存率；納入患者性別、年齡、腫瘤體積大小、T分期等因素，采用單因素及多因素回歸模型分析ALDH3B1表達(dá)量是否為影響胃癌患者術(shù)后5年生存率的獨立危險因素以及預(yù)測癌性致死的價值；細(xì)胞水平觀察ALDH3B1對胃癌細(xì)胞系（MGC-803）惡性行為（增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲）的影響。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

1.3.2 ALDH3B1、Ki67免疫組織化學(xué)檢測 ALDH3B1與Ki67在胃癌組織中的表達(dá)及細(xì)胞定位采用免疫組織化學(xué)法評估。胃癌和癌旁組織蠟塊，制作為4 μm厚度連續(xù)切片，60 ℃烘干及脫蠟后標(biāo)記ALDH3B1（兔抗人多克隆抗體；1∶200；Proteintech）或Ki67（兔抗人多克隆抗體；1∶400；Abcam）。采用積分光密度（IOD）對ALDH3B1和Ki67進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 ALDH3B1在胃癌組織及癌旁組織中的細(xì)胞定位與表達(dá)

免疫組化及熒光定量PCR結(jié)果顯示胃癌組織中ALDH3B1的表達(dá)量高于癌旁組織（＜0.05），且主要表達(dá)于癌細(xì)胞胞質(zhì)（圖1A、C、D）；IOD值分析顯示胃癌組織內(nèi)Ki67的表達(dá)量顯著高于癌旁組織（＜0.05），且主要表達(dá)于癌細(xì)胞核（圖1B、E）。

2.2 胃癌組織中ALDH3B1相對表達(dá)量與外周血腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性

通過Western blot驗證過表達(dá)和干擾ALDH3B1的效果，結(jié)果顯示ALDH3B1過表達(dá)組和干擾組與其各自對照組相比有明顯效果（圖5A～D）；CCK-8結(jié)果顯示，敲低ALDH3B1可顯著抑制胃癌細(xì)胞（MGC-803）的增殖能力，而過表達(dá)ALDH3B1可顯著增強(qiáng)其增殖能力（＜0.05，圖5E）。

2.3 胃癌組織中ALDH3B1的表達(dá)量與臨床及病理參數(shù)間的關(guān)系

1.2.2 不同扦插密度發(fā)病率和病情指數(shù)調(diào)查 2017年在試驗地隨機(jī)抽取不同扦插密度(株距×行距)20cm×30cm、20cm×40cm、20cm×50cm、20cm×60cm的3年生青楊苗木，抽樣小區(qū)面積667m2，重復(fù)3次，以傳統(tǒng)扦插密度(株距×行距)20cm×20cm處理為對照(CK)。10月中旬每小區(qū)隨機(jī)抽取青楊苗木1000株，調(diào)查葉銹病發(fā)病率和病情指數(shù)。

2.4 胃癌組織中ALDH3B1的表達(dá)量對根治術(shù)后5年生存率的影響

K-M生存分析顯示ALDH3B1高表達(dá)組患者術(shù)后5年生存率顯著低于低表達(dá)組（Log-rank χ=22.121，＜0.01，圖3）。

2.5 影響胃癌根治術(shù)后5 年生存期的單因素及多因素分析

ROC曲線顯示，以ALDH3B1相對表達(dá)量4.67為截點值，預(yù)判術(shù)后5年死亡的敏感性為76.47%，特異性為76.00%，曲線下面積為0.794（0.01，圖4A），與Ki67的相對表達(dá)量的ROC曲線相比（圖4B），ALDH3B1預(yù)判術(shù)后5年生存情況的預(yù)判價值較高。

2.6 ALDH3B1表達(dá)量對胃癌根治術(shù)后5年生存情況的預(yù)判價值

單因素分析顯示，ALDH3B1高表達(dá)、CEA≥5 μg/L、CA19-9≥37 kU/L、腫瘤≥5 cm、T分期為3～4期、N分期為2～3期可能是影響胃癌根治術(shù)后5年生存期的危險因素（均＜0.01）。將以上病理參數(shù)納入Cox回歸模型，最終得ALDH3B1高表達(dá)、CEA≥5 μg/L、CA19-9≥37 kU/L、T分期為3～4期、N分期為2～3期為影響胃癌根治術(shù)后5年生存期的獨立危險因素（表2）。

1.3.3 熒光定量PCR檢測胃癌中mRNA表達(dá) 制備樣品勻漿，使用Trizol（ambion）法提取總RNA，提取的RNA 使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以GAPDH 為內(nèi)參基因，使用PCR 試劑盒（Takara）在QuantStudio DX 系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量PCR，通過計算ALDH3B1的2值評估其mRNA的表達(dá)。使用的引物均由上海生工公司合成，引物序列如下：GAPDH上游：5'-TGACCTCAACTACATGGTCTACA-3'，下游：5'-CTTCCCATTCTCGGCCTTG-3'；ALDH3B1 上游：5'-GCCCTGGAACTATCCGCTG-3'，下游：5'-CGTTCTT GCTAATCTCCGATGG-3'。

2.7 ALDH3B1對胃癌細(xì)胞增殖的影響

胃癌組織中ALDH3B1相對表達(dá)量與外周血CEA及CA19-9 間均存在正相關(guān)[CEA（=0.714，＜0.01），CA19-9（=0.549，＜0.01），圖2A、B]。

2.8 ALDH3B1對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

Transwell 小室結(jié)果顯示，敲低ALDH3B1可顯著抑制胃癌細(xì)胞（MGC-803）的遷移和侵襲能力（＜0.05，圖6A～C），而過表達(dá)ALDH3B1可顯著增強(qiáng)其遷移和侵襲能力（＜0.05，圖5C）。

3 討論

胃癌預(yù)后評估與生存分析對于提高患者生存率，改善患者術(shù)后生存質(zhì)量具有重要意義。ALDH3B1在正常組織及多種腫瘤組織中表達(dá)，但是其與腫瘤之間還沒有明確的關(guān)系。有研究證實，ALDHs家族可作為多種腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物，重要的是，ALDH3B1在胃癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后中的作用尚未見報道，因此我們擬明確ALDH3B1在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義，并進(jìn)一步探討其對胃癌細(xì)胞的作用。

目前，墾區(qū)數(shù)字農(nóng)業(yè)技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到多個領(lǐng)域，以紅星農(nóng)場為例，其應(yīng)用數(shù)字農(nóng)業(yè)技術(shù)，建立了農(nóng)機(jī)集中管理指揮調(diào)度系統(tǒng)，實現(xiàn)了農(nóng)機(jī)管理指揮調(diào)度網(wǎng)絡(luò)化，使各級管理部門通過國際互聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，可及時掌握紅星農(nóng)機(jī)管理信息，了解農(nóng)機(jī)當(dāng)前作業(yè)的情況，對農(nóng)場農(nóng)田的地理位置、土壤信息、種植作物情況等信息進(jìn)行查詢，提高農(nóng)機(jī)管理的科技水平。在建三江管局部分農(nóng)場亦有應(yīng)用，通過電腦語音自動答詢系統(tǒng)、電視播報系統(tǒng)、文字傳媒系統(tǒng)、專家演繹系統(tǒng)、基地展示系統(tǒng)、信息交流與市場服務(wù)系統(tǒng)，可為生產(chǎn)經(jīng)營者提供全方位、多渠道的技術(shù)信息服務(wù)。

本研究，采用免疫組織化學(xué)染色及熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)ALDH3B1在胃癌組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，提示ALDH3B1可能參與了胃癌的進(jìn)展。目前有關(guān)胃癌診斷及預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物研究有很多，最常用的就是血清中CA19-9和CEA的應(yīng)用，對于一些標(biāo)記物其敏感性和特異性還有待進(jìn)一步證實，因此需要研究特異性強(qiáng)且預(yù)測價值高的分子標(biāo)志物。我們進(jìn)一步將胃癌組織中ALDH3B1表達(dá)量與患者外周血CEA及CA19-9 等腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)ALDH3B1與CEA和CA19-9的表達(dá)量具有正相關(guān)性，我們推測，ALDH3B1能否作為胃癌的獨立危險因素。接下來，我們采用單因素分析法，評估胃癌組織中ALDH3B1的表達(dá)量與患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系，ALDH3B1高表達(dá)組與低表達(dá)組患者在性別、年齡、腫瘤大小上比較無顯著性差異，而ALDH3B1高表達(dá)組患者CEA≥5 μg/L、CA19-9≥37 kU/L、T分期為3～4期及N分期為2～3期的比例顯著高于ALDH3B1低表達(dá)組，我們的結(jié)果也證實了ALDH3B1可作為胃癌的獨立危險因素。ALDH3B1的基因表達(dá)水平與急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）預(yù)后相關(guān)，ALL患者中ALDH3B1基因表達(dá)水平降低，且表達(dá)低的患者預(yù)后不良。為了探究胃癌組織中ALDH3B1的表達(dá)量是否對胃癌根治術(shù)后5年生存率產(chǎn)生影響，我們使用K-M生存分析方法，結(jié)果顯示ALDH3B1高表達(dá)組患者術(shù)后5年生存率顯著低于低表達(dá)組。文獻(xiàn)報道，ALDH3B1可作為肺腺癌預(yù)后差的標(biāo)志物。我們在胃癌中采用Cox回歸分析，得出ALDH3B1可作為影響胃癌根治術(shù)后5年生存期的獨立危險因素，以上結(jié)果與其在肺癌中的研究相似。另外，我們采用ROC曲線分析ALDH3B1、Ki67對胃癌5年生存期的預(yù)判價值，證明ALDH3B1預(yù)判胃癌術(shù)后5年死亡的敏感性為76.47%，特異性為76.00%，曲線下面積為0.794，表明ALDH3B1對胃癌根治術(shù)后5年生存情況具有預(yù)判價值。

ALDH基因家族廣泛參與體內(nèi)各種脂質(zhì)的代謝，可以降解細(xì)胞內(nèi)有毒物質(zhì)，對細(xì)胞有保護(hù)作用。ALDH 基因家族還被證實與惡性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如ALDH2與再生障礙性貧血及白血病的進(jìn)展相關(guān)；我們的數(shù)據(jù)證明ALDH3B1高表達(dá)是胃癌根治術(shù)后5年生存率的獨立危險因素，然而ALDH3B1影響胃癌預(yù)后的功能學(xué)途徑尚不清楚。胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等惡性行為是影響胃癌術(shù)后的重要病理過程。因此，我們深入分析ALDH3B1對胃癌惡性行為的影響。我們采用ALDH3B1基因干預(yù)胃癌細(xì)胞系MGC-803，經(jīng)CCK-8 分析細(xì)胞增殖能力改變，結(jié)果顯示敲低ALDH3B1可抑制胃癌細(xì)胞增殖，而過表達(dá)ALDH3B1細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)；進(jìn)一步Transwell小室結(jié)果顯示，ALDH3B1 可以顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。我們的體外實驗證明了ALDH3B1高表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲過程，此研究也是對ALDH3B1功能和臨床意義的重要補(bǔ)充。

綜上所述，我們的研究顯示ALDH3B1在胃癌組織中高表達(dá)并與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，其可能通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等病理過程，影響胃癌根治術(shù)后5年生存率，對胃癌患者預(yù)后評估具有重要的臨床價值。