陳智威， 許 然， 鄭小東

(1.中國海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進化研究所， 山東 青島 266003；2. 海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學(xué))， 山東 青島 266003)

長蛸(Octopusminor)廣泛分布于中國沿海，是重要的經(jīng)濟蛸類[1]。由于營養(yǎng)價值高、生長周期短(通常為一年)且生長速度快，因此被認為是一種有推廣前景的養(yǎng)殖品種。長蛸是肉食性動物，其攝取的大量蛋白類物質(zhì)最終代謝產(chǎn)物主要是氨，研究發(fā)現(xiàn)體質(zhì)量相當(dāng)?shù)尿兕惏迸判沽渴囚~類的2～3倍[2]。長蛸與甲殼類的生活環(huán)境類似，都是底棲或表現(xiàn)出掩埋行為的動物，產(chǎn)生的代謝副產(chǎn)物使沉積物中的氨氮水平升高，這可能導(dǎo)致養(yǎng)殖環(huán)境中氨氮含量高于養(yǎng)殖水體的安全濃度[3]。養(yǎng)殖水體中的高濃度氨氮是水生動物死亡的原因之一[4-5]。國內(nèi)外許多研究報道了急性氨氮脅迫對水生動物組織結(jié)構(gòu)的影響，例如張武肖等[6]在研究氨氮脅迫對團頭魴(Megalobramaamblycephala)幼魚鰓、肝和腎組織結(jié)構(gòu)的影響時，發(fā)現(xiàn)不同器官之間損傷程度不同，肝組織損傷最嚴(yán)重，其次是鰓和腎，且隨著脅迫時間延長，組織受損增加，難以恢復(fù)；陳思涵等[7]研究了急性氨氮脅迫對虎斑烏賊(Sepiapharaonis)肝臟、鰓和腦組織結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)氨氮脅迫濃度相同時，不同組織器官的損傷程度有差異，其中肝臟對氨氮脅迫最敏感，損傷程度最大，其次是鰓和腦組織；Feyjoo等[8]闡述了氨氮對真蛸(Octopusvulgaris)幼體細胞色素的影響，結(jié)果顯示隨著氨濃度的增加，色素細胞在受刺激變暗后又回到透明狀態(tài)的時間明顯減少；Cong等[9]研究了氨氮毒性對菲律賓蛤仔(Ruditapesphili-ppinarum)鰓組織造成的損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比實驗組的鰓絲被拉伸或折斷，鰓絲內(nèi)部的基底細胞幾乎消失。大部分研究內(nèi)容都包含了鰓組織，因為鰓是很多水生生物排出氨基酸并將其分解代謝產(chǎn)生氨的重要器官，同時存在被動擴散和主動轉(zhuǎn)運，在氨解毒代謝中具有重要作用[10]。此外，文獻[11]研究表明，虎斑烏賊(Sepiapharaonis)能在鰓組織的幫助下，將體內(nèi)有毒的游離氨轉(zhuǎn)換成無毒的谷氨酰胺儲存在體內(nèi)，以用于其他的機體代謝或最終合成尿素排出體外。

氨氮脅迫對水產(chǎn)動物組織結(jié)構(gòu)損害的研究主要集中于魚類和甲殼類，在頭足類中研究甚少，蛸科幾乎沒有。本文通過對長蛸進行低、中、高3個不同濃度的氨氮脅迫，觀察不同濃度的氨氮脅迫對長蛸鰓、肝臟以及腎臟組織學(xué)的影響，填補了蛸科動物氨毒性組織學(xué)研究方面的空白，為深入研究長蛸氨解毒代謝機制提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

于山東省榮成市月湖海區(qū)采捕野生的、體質(zhì)健壯的成熟長蛸，長蛸的平均體質(zhì)量為 (180.2±30.5) g，在馬山集團育苗廠內(nèi)暫養(yǎng)。自然海水經(jīng)沉淀、曝氣和消毒后使用。水溫為(20.8±0.5)℃, 每天更換的水量約為養(yǎng)殖池水量的 1/3。投喂肉球近方蟹1次/d。暫養(yǎng)期間長蛸活力旺盛, 死亡率低于5%。暫養(yǎng)一周后, 將其轉(zhuǎn)移至長×寬×高為67 cm×45 cm×47 cm 的方桶中, 每桶放置長蛸8只, 養(yǎng)殖環(huán)境和管理方法與養(yǎng)殖池保持一致, 持續(xù)充氧, 暫養(yǎng)一周。實驗前停食一天, 選擇身體健康、活力旺盛的個體隨機分組進行實驗。

1.2 實驗方法

參考陳智威等[12]的實驗結(jié)果, 選擇48 h作為脅迫時間，同時從中選取3個適宜濃度(即脅迫48 h長蛸不會完全死亡的濃度)用于實驗。本實驗設(shè)低、中、高3個濃度實驗組和1個對照組, 其總氨氮(Total-NH3, TAN)濃度分別為: 87.0 mg/L(低濃度組)、143.5 mg/L(中濃度組)、204.0 mg/L(高濃度組)和0(對照組, 自然海水養(yǎng)殖下氨氮濃度)。使用NH4Cl控制3個實驗組的總氨氮濃度，將NH4Cl放入加水的方桶中，攪拌均勻，利用氨氮儀(哈納 HI96715)檢測至要求濃度。每個方桶分為一組，每組個體數(shù)均為 8 只，每個濃度組設(shè)2個平行重復(fù)組。每天檢測總氨氮濃度, 維持實驗環(huán)境的氨氮濃度不變。實驗期間，長蛸處于停食狀態(tài), 每24 h更換1/2體積的水, 持續(xù)充氧，及時撈出死亡的個體，脅迫48 h后取樣，每一濃度取樣6只。

為減少樣品痛苦并嚴(yán)格遵守科研道德程序，在解剖組織之前采用7.5%氯化鎂對個體進行麻醉[13-14]。解剖取出鰓、肝臟和腎臟，波恩氏液固定，然后酒精梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，連續(xù)切片(厚度4～5 μm)，蘇木精-伊紅(HE)染色(染色步驟參照文獻[15])。光鏡觀察、拍攝，用Photoshop軟件測量細胞形態(tài)數(shù)據(jù)，每一濃度組取6張不同個體的片子，計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

87.0 mg/L的氨氮溶液脅迫下，實驗初期長蛸活力旺盛，與對照組無差別，游泳能力正常，直至48 h時出現(xiàn)死亡(見表1)，水體未出現(xiàn)顏色變化和異味；143.5 mg/L的氨氮溶液脅迫下，實驗初期長蛸偶爾出現(xiàn)躁動現(xiàn)象，即突然地竄動，水體顏色未有明顯變化，48 h時長蛸出現(xiàn)噴墨現(xiàn)象，開始有長蛸死亡(見表1)，存活個體臥于方桶底部或蜷縮至角落，幾乎不能游動，水體顏色變黃；204.0 mg/L的氨氮溶液脅迫下，實驗初期長蛸就出現(xiàn)躁動不安的情況，大部分長蛸出現(xiàn)急速游泳和噴墨的現(xiàn)象，24 h時長蛸開始死亡，48 h時出現(xiàn)大量死亡(見表1)，水面浮有泡沫，水體渾濁，帶有腥味。

表1 氨氮脅迫48 h后不同濃度組的死亡率Tabel 1 Mortality of O. minor at 48 h in different concentration of ammonia

表1顯示，在脅迫24 h時，87.0和143.5 mg/L實驗組中均無死亡個體，意味著其氨毒性未積累到一定程度，對長蛸而言可以忍受；脅迫48 h時，3個濃度的氨溶液中均有長蛸死亡，且隨著脅迫濃度的升高而逐漸增加，組織學(xué)結(jié)果顯示氨毒已經(jīng)對長蛸的組織器官產(chǎn)生了影響(見圖1～3)。

(a. 對照組; B. 87.0 mg/L脅迫組; C. 143.5 mg/L脅迫組; D. 204.0 mg/L脅迫組。 N: 細胞核; NH: 細胞核腫大; CV: 細胞空泡化; K:細胞核溶解。 標(biāo)尺=20 μm。A. The control group; B. 87.0 mg/L stress group; C. 143.5 mg/L stress group; D. 204.0 mg/L stress group. N: Nuclear; NH: Nuclear hypertrophy; CV: Cellular vacuolation; K:Karyolysis. Scale bar=20 μm.)圖1 氨氮脅迫下長蛸鰓的組織切片圖Fig.1 Details of the gill micrographs in O. minor under the stress of ammonia

(a. 對照組; B. 87.0 mg/L脅迫組; C. 143.5 mg/L脅迫組; D. 204.0 mg/L脅迫組。 N: 細胞核; HC:肝小葉; K:細胞核溶解; CV: 細胞空泡化; HS:肝血竇; SV:中央靜脈。 標(biāo)尺=20 μm。A. The control group; B. 87.0 mg/L stress group; C. 143.5 mg/L stress group; D. 204.0 mg/L stress group. N: Nuclear; HC: Hepatic contour; K: Karyolysis; CV: Cellular vacuolation; HS: Hepatic sinusoid; SV: Central vein. Scale bar=20 μm.)圖2 氨氮脅迫下長蛸肝臟的組織切片圖Fig.2 Detail of the liver micrographs in O. minor under the stress of ammonia

(a. 對照組; B. 87.0 mg/L脅迫組; C. 143.5 mg/L脅迫組; D. 204.0 mg/L脅迫組。 N: 細胞核; RT:腎小管;RC:腎細胞; IF:組織液。 標(biāo)尺=20 μm。A. The control group; B. 87.0 mg/L stress group; C. 143.5 mg/L stress group; D. 204.0 mg/L stress group. N:Nuclear; RT:Renal tubules; RC:Renal cells; IF:Interstitial fluid. Scale bar=20 μm.)圖3 氨氮脅迫下長蛸腎臟的組織切片圖Fig.3 Detail of the kidney micrographs in O. minor under the stress of ammonia

對照組(見圖1A)中鰓組織結(jié)構(gòu)較完整、緊致，鰓細胞排列整齊，無空泡；低濃度脅迫組(見圖1B)中鰓細胞漲大，細胞核腫脹排列不整齊；中濃度脅迫組(見圖1C)中鰓細胞具有空泡化結(jié)構(gòu)，可觀察到細胞間滲出的組織液；高濃度脅迫組(見圖1D)中鰓細胞出現(xiàn)大量空泡結(jié)構(gòu)，鰓細胞排列松散，表現(xiàn)出一定程度的損傷。從對照組到高濃度脅迫組，氨氮脅迫濃度依次升高，細胞核直徑不斷增加，細胞中空泡直徑也不斷增加(見表2)。由此可以認為，不同濃度的氨氮溶液對長蛸鰓組織產(chǎn)生了不同程度的影響和破壞，主要表現(xiàn)為細胞核體積增大，排列不整齊，細胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，排列松散，且空泡的數(shù)量和直徑不斷增加。

表2 氨氮脅迫下長蛸鰓組織結(jié)構(gòu)形態(tài)比較數(shù)據(jù)Table 2 Comparative data on the morphology in the gill structure of O. minor under the stress of ammonia

對照組(見圖2A)中肝組織結(jié)構(gòu)完整，中空部位為中央靜脈，圍繞中央靜脈細胞排列一圈的細胞為中央靜脈管壁，對照組圖片顯示管壁細胞完整、排列整齊；在低濃度脅迫組(見圖2B)中管壁部分細胞核溶解，逐漸產(chǎn)生空泡化結(jié)構(gòu)；與對照組相比，中濃度脅迫組(見圖2C)中樣品中央靜脈管壁細胞核排列松散，但結(jié)構(gòu)依然較完整，其余部位的細胞核有溶解現(xiàn)象；高濃度脅迫組(見圖2D)與中濃度脅迫組相似，中央靜脈管壁細胞排列結(jié)構(gòu)較完整，但組織空泡化較明顯。從對照組到高濃度脅迫組，氨氮脅迫濃度依次升高，細胞核直徑略有增加，但對照組和低濃度脅迫組、中濃度脅迫組和高濃度脅迫組之間的增加趨勢不明顯，中央靜脈管壁的直徑不斷增加(見表3)。以上現(xiàn)象表明，隨著脅迫濃度的增加，細胞排列逐漸松散，中央靜脈管壁的完整度逐漸降低，導(dǎo)致肝組織的部分結(jié)構(gòu)損壞，這可能是導(dǎo)致長蛸死亡的因素之一。

表3 氨氮脅迫下長蛸肝組織結(jié)構(gòu)形態(tài)比較數(shù)據(jù)Table 3 Comparative data on the morphology in the liver structure of O. minor under the stress of ammonia

對照組(見圖3A)的腎組織結(jié)構(gòu)完整，腎小管之間幾乎不存在縫隙，腎細胞形狀圓潤完整，細胞核基本位于細胞中央；低濃度脅迫組(見圖3B)中腎細胞形狀變扁，部分細胞呈破碎狀態(tài)，細胞核逸出，腎小管之間產(chǎn)生空隙，且組織液滲出，管中央空隙不斷增大；中濃度脅迫組(見圖3C)中腎細胞逐漸拉長、扁平，組織液開始滲出；高濃度脅迫組(見圖3D)中腎細胞不斷縮小，腎小管之間空隙更大，大量組織液滲出，且中央部位產(chǎn)生了更大的空隙。從對照組到高濃度脅迫組，氨氮脅迫濃度依次升高，細胞核直徑無明顯差異，但腎細胞直徑呈降低趨勢，同時細胞擴散，腎小管直徑不斷增加，與對照組相比高濃度組增加值最大(見表4)。

表4 氨氮脅迫下長蛸腎組織結(jié)構(gòu)形態(tài)比較數(shù)據(jù)Table 4 Comparative data on the morphology in the kidney structure of O. minor under the stress of ammonia

3 討論

鰓不僅是水生動物攝取食物、進行呼吸作用的重要器官，在動物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)中也起著重要作用[16-17]。鰓組織病變會影響水生動物攝食、呼吸、排泄以及調(diào)節(jié)酸堿和離子平衡等生理活動[18]。Zhou等[19]發(fā)現(xiàn)氨氮脅迫使草魚(Ctenopharyngodonidella)鰓細胞核顏色逐漸變淺，鰓細胞內(nèi)部出現(xiàn)空白，胞核邊緣不清，并觀察到次級鰓片的水腫和融合；陳思涵等[7]發(fā)現(xiàn)急性氨氮脅迫下虎斑烏賊的鰓組織出現(xiàn)泌氯細胞溶解，上皮細胞核溶解、空泡化、排列紊亂及鰓絲淤血、壞死和脫落的現(xiàn)象。說明氨氮脅迫會破壞水生動物的鰓結(jié)構(gòu)，破壞其上皮細胞核，使其逐漸溶解，產(chǎn)生空泡化。本實驗結(jié)果顯示，鰓細胞核出現(xiàn)溶解，細胞數(shù)量變少，從而導(dǎo)致鰓細胞邊緣開始模糊(見圖1)；氨氮脅迫導(dǎo)致鰓內(nèi)部細胞核腫脹，細胞空泡化嚴(yán)重，且空泡直徑整體呈增加趨勢(見表2)。但表2顯示中濃度脅迫組的空泡平均直徑小于其他各組，推測可能是細胞不斷溶解后，細胞內(nèi)液體堆積，導(dǎo)致鏡檢可見的空泡直徑減小(見圖1C)。長蛸鰓組織損傷情況隨氨氮脅迫濃度的升高和脅迫時間的延長而增加，且高濃度脅迫組與對照組相比較，鰓組織損傷情況較明顯，低、中濃度脅迫組與對照組相比較，鰓組織損傷程度稍小。

肝臟在水生動物的代謝﹑免疫和解毒等方面具有非常重要的作用。在鯉(Cyprinuscarpio)幼魚和羅非魚(Oreochromismossambicus)的研究中發(fā)現(xiàn)，氨氮經(jīng)血液運輸?shù)礁闻K后，利用肝臟中的酶將高毒性的非離子氨通過解毒作用轉(zhuǎn)化為低毒性的尿素釋放出來，且損傷后的肝臟也會影響其體內(nèi)解毒代謝的正常進行[20-21]。陳思涵等[7]研究發(fā)現(xiàn)，急性氨氮脅迫后，肉眼可以觀察到高濃度組虎斑烏賊肝臟顏色鮮紅，出現(xiàn)腫脹、糜爛等現(xiàn)象，鏡檢發(fā)現(xiàn)肝小葉破裂，肝血竇擴張；郝小鳳等[22]對急性氨氮脅迫后的泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)的肝組織進行超微結(jié)構(gòu)觀察，發(fā)現(xiàn)在高氨氮濃度脅迫后，泥鰍肝臟的細胞核形狀異常，細胞空泡化嚴(yán)重，細胞核內(nèi)容物大量外泄。說明氨氮脅迫會破壞水生動物的肝臟結(jié)構(gòu)，使其顏色改變、內(nèi)部結(jié)構(gòu)腫脹破裂，導(dǎo)致肝細胞核變形。本實驗結(jié)果顯示，隨著氨氮濃度的增加，肝小葉排列逐漸松散，邊緣模糊，中央靜脈管壁的完整度逐漸降低(見圖2)，肝血竇、中央靜脈管壁直徑也不斷增加(見表3)。表3顯示，肝細胞核的平均直徑略有變化，其中低濃度脅迫組中核直徑比對照組小，可能是在氨氮脅迫初期，肝細胞中的抗氧化酶活性提高，為了減輕細胞腫大對肝組織影響， 使細胞核直徑略有下降，張武肖等[6]實驗結(jié)果證明抗氧化酶能夠降低氨氮脅迫對團頭魴肝組織的毒性作用。與鰓組織結(jié)構(gòu)損傷情況比較發(fā)現(xiàn)，同種氨氮濃度脅迫下，肝組織的結(jié)構(gòu)損傷較為明顯，可以推測氨毒入侵長蛸體內(nèi)時，肝組織是受到主要損傷的部位之一。

對于腎臟組織，研究較多的物種主要是魚類，在頭足類中的研究較少見。腎臟是水生動物較常見的排泄器官，利用腎臟的排泄功能，水生動物可以將其新陳代謝產(chǎn)生的物質(zhì)排出體外，同時腎臟與鰓有著部分相似的功能，即可以調(diào)節(jié)生物體內(nèi)離子平衡和滲透壓，因此水生動物的腎臟損傷程度可以作為檢測環(huán)境污染的指標(biāo)之一[6,23]。張武肖等[6]研究發(fā)現(xiàn)，水中高濃度氨氮使團頭魴幼魚的腎小球萎縮、壞死，腎小管上皮細胞腫大、空泡化、充血嚴(yán)重。說明氨氮脅迫同樣會破壞水生動物的腎臟功能，這在上皮細胞中表現(xiàn)明顯，氨氮脅迫下上皮細胞會不斷腫大，空泡化嚴(yán)重。本實驗中，氨氮對長蛸腎臟產(chǎn)生的主要影響為細胞核逸出，組織液大量滲出(見圖3C、3D)，腎細胞直徑明顯縮短，腎小管之間產(chǎn)生空隙且直徑不斷增加(見表4)。表4顯示不同濃度的氨氮脅迫下，腎細胞核直徑變化不顯著，但細胞直徑逐漸縮短，部分細胞核變?yōu)闄E圓形，導(dǎo)致低濃度實驗組的核直徑大于對照組，但在脅迫濃度升高后，細胞開始破裂，細胞核逸出，其形態(tài)和直徑略有變化，表現(xiàn)為直徑縮短。以上現(xiàn)象表明，隨著氨氮濃度的升高，腎臟的結(jié)構(gòu)損傷會越發(fā)嚴(yán)重，張武肖等[6]也在文章中解釋氨氮脅迫后腎臟的自我恢復(fù)能力較鰓和肝臟差。

研究發(fā)現(xiàn)，氨氮脅迫導(dǎo)致水生動物死亡的原因主要有三種：一是氨氮毒性物質(zhì)導(dǎo)致肝臟和腎臟的器官病變；二是氨氮毒性物質(zhì)擾亂了鰓組織上皮細胞的排列方式，導(dǎo)致鰓細胞中細胞器受損，降低氧氣的輸送效率，通過影響呼吸作用導(dǎo)致生物死亡；三是氨氮毒性物質(zhì)導(dǎo)致腦細胞腫脹破損，從而導(dǎo)致生物死亡[7,21-22]。根據(jù)以上發(fā)現(xiàn)，可以推測高濃度氨氮導(dǎo)致長蛸死亡的原因可能是其使長蛸的鰓、肝臟和腎臟產(chǎn)生了不可逆轉(zhuǎn)的病變，從而使得長蛸在調(diào)節(jié)滲透壓、解毒排泄和呼吸作用方面產(chǎn)生障礙，進而對機體造成損害。

4 結(jié)論

(1)不同濃度的氨氮脅迫48 h后，長蛸組織器官損傷程度與氨氮脅迫濃度呈正相關(guān)，即隨著脅迫濃度的升高，組織損傷程度越來越明顯。

(2)腎臟的組織結(jié)構(gòu)損傷程度較大，鰓和肝臟次之。

(3)隨著氨氮脅迫濃度的升高，鰓和肝組織細胞核直徑逐漸增大，組織細胞排列逐漸松散，部分細胞核開始溶解，導(dǎo)致空泡化不斷加劇，腎組織細胞液外滲。