卓雨欣,徐文娟,程 源,宋 丹,韓向峙,龍 峰

倏逝波光纖傳感器快速檢測諾氟沙星

卓雨欣,徐文娟,程 源,宋 丹,韓向峙,龍 峰*

(中國人民大學環(huán)境學院,北京 100872)

基于間接競爭免疫分析原理,利用倏逝波光纖生物傳感平臺研發(fā)了一種諾氟沙星檢測方法,實現(xiàn)了水中諾氟沙星的快速?靈敏檢測.研究表明,諾氟沙星檢測的優(yōu)化條件為:抗體濃度為1μg/mL?預反應時間為1min,反應時間為4min.優(yōu)化條件下,諾氟沙星檢測限可達1.89μg/L.包被抗原修飾的光纖探頭與熒光標記諾氟沙星抗體具有良好的特異性和穩(wěn)定性,可重復使用400次以上.自來水?景觀水?二沉池出水等水樣的加標回收實驗結果表明,該傳感器具有良好的精密度和準確性,受環(huán)境基質的影響較小,能夠用于實際水樣中諾氟沙星的快速檢測.

諾氟沙星；抗生素；倏逝波生物傳感器；免疫分析；環(huán)境監(jiān)測

諾氟沙星(norfloxacin, NOR)為第三代喹諾酮類抗生素,在臨床醫(yī)學、畜禽養(yǎng)殖、水產(chǎn)養(yǎng)殖等領域被廣泛應用.地表水、地下水、飲用水、河流底泥及土壤等環(huán)境介質中都頻繁地檢出NOR[1-3].環(huán)境中的NOR除了會誘導“超級細菌”的產(chǎn)生,導致抗藥性[4],還具有“三致效應”等危害,其生態(tài)毒理效應正在逐漸凸顯[5-7].研究顯示,ppb級的NOR就可能對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生顯著影響.高靈敏檢測NOR是實現(xiàn)其有效處理處置的前提條件[8].目前NOR的主要檢測技術包括色譜-質譜檢測法[9-10]、微生物測定法[11]及免疫測定法[12]等.然而,各種方法都存在不同的局限性,如預處理復雜、檢測成本高、耗時長、存在假陽性、無法實現(xiàn)原位檢測等.因此,發(fā)展適用于NOR現(xiàn)場高靈敏快速檢測的新方法勢在必行.

近年來,生物傳感器因具有高特異性、高靈敏度、快速、可適用現(xiàn)場檢測等優(yōu)勢,已成為環(huán)境監(jiān)測、食品安全、醫(yī)療診斷等領域的發(fā)展前沿[13-14],其中,倏逝波光纖生物傳感器是結合生物親和反應原理,利用光波在光纖中以全內反射方式進行傳播時形成的倏逝波可激發(fā)結合到其表面的熒光分子標記生物分子,根據(jù)熒光強度與待測物濃度的線性關系來實現(xiàn)其定量檢測[15].倏逝波光纖生物傳感器因具有檢測速度快,靈敏度高、體積小、質量輕、抗電磁干擾、可重復利用等特點[16],已被廣泛應用于小分子有機污染物[17]、病原菌[18]、重金屬污染物[19]等的檢測,但應用于抗生素檢測還比較少見.本研究基于倏逝波熒光原理和間接競爭免疫分析原理,利用課題組研發(fā)的倏逝波光纖生物傳感平臺,研發(fā)了用于NOR現(xiàn)場快速檢測的新方法,并分析了NOR在環(huán)境水樣中的檢測效果,其具有靈敏度高、特異性強、操作簡單等顯著優(yōu)點.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3-巰丙基三甲氧基硅烷(MPTS)、NOR標準品、30%氫氟酸、牛血清蛋白(BSA)均購自Sigma中國公司,NOR單克隆抗體購自北京維德維康生物技術有限公司,濃硫酸、鹽酸、30%過氧化氫、甲苯、4-馬來酰亞胺基丁酸 N-羥基琥珀酰亞胺酯(GMBS)、乙醇、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉均購自北京化學試劑公司,試劑純度均為分析純. pH=1.9的0.5%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液、pH=7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)、抗體稀釋液均由本實驗室自行配制.NOR包被抗原(OVA-NOR)和Cy5.5熒光染料標記的NOR抗體(Cy5.5-NOR抗體)均為本實驗室自行制備.

1.2 樣品前處理

二沉池污水采集于中國人民大學低碳水環(huán)境中心污水處理中試裝置,景觀水采集于圓明園景觀水,礦泉水為農(nóng)夫山泉瓶裝水,自來水樣為中國人民大學自來水,以上水樣采集后均于4℃保存,保存期限為30d.

取100mL容量瓶,加入1mL 1000mg/L NOR標準溶液,用所取水樣定容至100mL.得到濃度為10mg/L的加標水樣作為儲備液.隨后使用儲備液及空白水樣配制得到所需的加標濃度水樣.

1.3 光纖探頭的制備

將5.5cm長、芯徑600μm的石英光纖(北京首量)去除3cm長的涂覆層,放入30%氫氟酸中腐蝕適當時間,得到錐角度為0.37,錐形部分長約0.5cm,芯徑為220μm的組合錐型光纖探頭.配制Piraha溶液(濃H2SO4/H2O2=3/1),將光纖探頭浸入其中30min,以使光纖探頭表面羥基化.然后用超純水進行充分清洗至清洗液的pH值為中性,在室溫下用氮氣吹干或者在105℃的干燥箱中干燥3h.將光纖探頭放入含2% MPTS的甲苯溶液中反應2h使光纖探頭表面硅烷化,然后用甲苯清洗光纖3次,氮吹至干;將光纖探頭放入0.002mol/L GMBS的乙醇溶液里反應1h,取出后用10mM PBS清洗干凈,在光纖探頭表面引入偶聯(lián)基團;將連接了偶聯(lián)基團的光纖探頭浸入0.5μg/L的OVA-NOR中過夜,使光纖探頭表面連接上OVA-NOR,用超純水沖洗后,放入2μg/L的BSA溶液中反應2h以封閉非特異性吸附位點,制備好的光纖探頭放在4℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.4 倏逝波光纖生物傳感平臺及其檢測原理

倏逝波光纖生物傳感平臺如圖1所示.半導體激光器產(chǎn)生的激發(fā)光經(jīng)由單多模光纖耦合器進入光纖探頭,激發(fā)光在光纖探頭以全內反射的方式傳播,并在表面形成有效滲入深度為數(shù)十納米的倏逝波場.當熒光標記的生物分子結合到光纖探頭表面,其被倏逝波激發(fā)產(chǎn)生熒光,部分熒光耦合回光纖探頭,經(jīng)單多模光纖耦合器的多模光纖收集與傳輸,然后由光電探測器將光信號轉換成電信號.通過軟件系統(tǒng)的處理,最終的檢測信號顯示在用戶界面[20-21].由于倏逝波場滲入深度有限,因此僅有通過因免疫反應結合到光纖探頭的熒光標記生物分子被激發(fā),而樣品中游離的熒光染料標記抗體貢獻極少,可以忽略不計.

圖1 倏逝波光纖生物傳感平臺

1.5 NOR生物傳感檢測機制

基于間接競爭免疫反應原理的NOR生物傳感機制如圖2所示.首先,將表面修飾OVA-NOR的光纖探頭置入樣品檢測池.然后將一定濃度的Cy5.5- NOR抗體和含不同濃度NOR的樣品預反應一定時間,使NOR與抗體充分結合.再將此混合物通入到樣品池,未結合NOR的游離抗體與光纖探頭上修飾的OVA-NOR結合.光纖探頭表面形成的倏逝波激發(fā)熒光分子發(fā)出熒光,部分熒光耦合回光纖探頭,經(jīng)單多模光纖耦合器的收集與傳輸,由光電探測器探測并轉換成電信號.經(jīng)軟件處理后,熒光信號值顯示在用戶界面.樣品中NOR 濃度越高,結合到光纖探頭的熒光標記抗體越少,檢測到的熒光信號越弱.利用熒光信號值與樣品濃度的反比關系,即可實現(xiàn)NOR的定量檢測.

圖2 倏逝波光纖生物傳感器檢測原理

2 結果與討論

2.1 NOR的免疫分析

為了驗證樣品中的NOR與光纖探頭的OVA- NOR存在對特異性抗體結合位點的競爭關系,設計了在相同抗體濃度下不同NOR濃度的對比實驗.將1μg/mL抗體分別與10mM PBS(NOR濃度為0)、5μg/L NOR、10μg/L NOR等比例混合,預反應1min,然后將混合液通入樣品池中,在樣品池反應240s,隨后通入SDS溶液對光纖探頭進行再生.記錄檢測信號值隨反應時間的變化,數(shù)據(jù)采集間隔為1s.對不同NOR濃度下的反應動力學曲線進行對比分析.

圖3 不同NOR濃度下傳感系統(tǒng)檢測的信號曲線

從圖3中可以看出,當樣品中不含有NOR時,熒光標記的NOR抗體以最大的速度與OVA-NOR修飾的光纖探頭結合,熒光信號值增長最快.但是,增長速度隨反應時間的延長而降低,符合抗原抗體結合的反應動力學規(guī)律.當樣品含有5μg/L NOR時,NOR抗體與光纖探頭的結合受到了明顯影響,信號增長速度明顯放緩,約為空白樣品的二分之一.但是,增長規(guī)律與前一個樣品基本一致,可以認為檢測信號的主要來源仍然是抗原抗體的特異性結合.而當樣品中NOR濃度提高到10μg/L時,抗體與光纖探頭的結合基本被抑制,熒光信號增長緩慢,信號值僅為空白樣品的10%左右.熒光信號軌跡線性增長,符合偽一級反應動力學規(guī)律,可以推測該樣品中的熒光信號主要來自游離的熒光標記抗體及其在光纖探針上的非特異性吸附.由此可以得知,隨著樣品中NOR濃度的增加,更多的熒光標記抗體與游離的NOR結合,導致結合到光纖探針的熒光標記抗體量減少,從而使得檢測到的熒光信號值減少,符合間接競爭免疫原理的反應動力學現(xiàn)象.因此,本研究提出的方法可以用于NOR的定量檢測.為實現(xiàn)光纖探針的重復使用,使用SDS溶液對光纖探頭表面進行再生,再生后的信號均可回落到初始水平,且再生后光纖探頭可以再次與熒光標記抗體結合,證明SDS溶液能夠定向解離結合到光纖探頭上的Cy5.5-NOR抗體,且不會降低光纖探頭表面修飾的OVA-NOR反應活性.

2.2 傳感器的選擇性

對物質的選擇性體現(xiàn)了特異性抗體識別抗生素的能力,是方法可行性的基礎,為了驗證抗體的選擇性:在農(nóng)藥中選取氟蟲腈;在生物毒素中選取黃曲霉毒素;在抗生素中選取硫酸卡那霉素、氨卡西林、培氟沙星和莫西沙星,設計選擇性實驗,驗證抗體對環(huán)境中常見的小分子痕量污染物[22]的選擇性識別能力.分別將50μL的Cy5.5-NOR抗體與50μL 10μg/ L的PBS、NOR、氟蟲腈、黃曲霉毒素、硫酸卡那霉素、氨卡西林、培氟沙星、莫西沙星標準品混合并靜置10min使其充分預反應后通入樣品池,反應4min,收集信號值.將加入不同種類物質時檢測到的信號與加入NOR時的檢測信號對照,分析特異性抗體對不同種類物質的識別能力.每組實驗平行測定2次.

如圖4所示,樣品中加入不同種類抗生素及農(nóng)藥、生物毒素等物質不影響Cy5.5-NOR抗體與光纖探頭上OVA-NOR的結合,其檢測信號值與僅通入Cy5.5-NOR抗體時基本持平.培氟沙星和莫西沙星的加入會使檢測信號有一定程度的下降,這是因為這兩種抗生素與NOR同屬于喹諾酮類抗生素,具有類似結構.但是,其信號下降值小于NOR的下降值,這表明NOR抗體對NOR具有較好的特異性.

圖4 抗體的選擇性

2.3 NOR檢測標準曲線

經(jīng)預實驗獲得最優(yōu)的檢測條件為預反應1min、反應4min、抗體濃度在1～2μg/mL之間.在最優(yōu)反應條件下,將不同濃度的NOR標準品與1和2μg/mL的Cy5.5-NOR抗體預反應1min后通入光纖反應槽檢測熒光信號.由于樣品中的NOR與光纖探頭上的包被NOR存在對Cy5.5-NOR抗體結合位點的競爭關系,因此NOR濃度低時檢測信號高;反之,當NOR濃度低時,檢測到的熒光信號小.根據(jù)反應動力學分析,檢測信號隨NOR濃度的變化趨勢反映在坐標系中應呈倒S形曲線[23].將不同的抗體濃度下獲得的檢測信號做歸一化處理(ε/ε0,為梯度濃度的檢測信號值,0為空白樣品的檢測信號值),經(jīng)Logistic方程擬合獲得不同抗體濃度下的NOR標準曲線.

式中:為歸一化信號值0;為待測物的濃度;0為曲線的中點;為拐點的斜率;1為測量上限的信號值;2為測量下限的信號值.

如圖5所示,在抗體濃度為1μg/mL的NOR檢測標準曲線中,誤差小于8%,穩(wěn)定性較好.熒光信號標準化值與標準品濃度的對數(shù)曲線顯示出了良好的相關關系,曲線擬合度2值大于0.99.NOR的檢測限(LOD)為1.89μg/L,線性區(qū)間為4.50～7.78μg/L.在抗體濃度為2μg/mL的NOR檢測標準曲線中,誤差小于20%,穩(wěn)定性欠佳.曲線擬合度2值大于0.99.NOR檢測的檢測限(LOD)為2.00μg/L,線性區(qū)間為3.40～7.00μg/L.不同濃度抗體下的檢測線性范圍十分接近,因此,出于降低檢測成本的考慮,選擇1.0μg/mL的抗體會更合適.表1比較了目前常用方法的特點,從中可以看出,本方法無需預處理,同時在檢測時間、靈敏度、成本等方面也具有明顯優(yōu)勢.

圖5 0.5和1 μg/mL抗體的NOR標準曲線

表1 常見檢測方法對比

2.4 傳感器的可再生性

光纖探頭的可再生性是影響倏逝波生物傳感器檢測成本的一個重要因素.光纖探頭的可再生次數(shù)越多則檢測成本越低.如圖6可見,在通入pH=1.9的SDS溶液再生后,儀器的檢測信號回落到檢測基線水平,這證明光纖探頭上的NOR抗體能夠被完全洗脫,結合位點重新被釋放,其檢測性能未受到影響.如圖6所示,隨著光纖探頭使用次數(shù)的增加,檢測不含NOR樣本的信號值(僅通入Cy5.5-NOR抗體時儀器收集到的熒光信號)幾乎沒有變化.結果表明,光纖探頭上的NOR抗體結合位點在超過400次再生后仍然沒有被破壞,該光纖探頭至少能夠使用400次以上并且保持良好的檢測性能.同時,這也證明了本檢測方法具有突出的穩(wěn)定性和可重復性.

圖6 OVA-NOR修飾的光纖探頭檢測信號值隨使用次數(shù)的變化

2.5 實際水樣加標回收

為了驗證本研究建立的檢測方法在實際應用中的可行性,有必要對不同環(huán)境基質中的NOR進行加標回收實驗.選取了二沉池出水、景觀水、礦泉水、自來水等4種典型環(huán)境水樣,4種水樣均未進行預處理.對4種水樣分別進行了3個不同濃度的NOR的加標回收實驗,平行測定2次.

表2 不同環(huán)境基質中NOR的回收率

加標回收結果如表2.可以看出,不同環(huán)境基質下NOR的回收率變化不大,在92%至116%之間.同時,檢測結果的相對標準偏差在7%以下.結果證明本檢測方法具有良好的準確性,抗環(huán)境干擾能力較強,在成分復雜的環(huán)境基質中仍具有突出的檢測性能.

3 結論

3.1 建立了倏逝波光纖免疫傳感平臺上的NOR檢測方法,并優(yōu)化了檢測條件,結果表明在Cy5.5標記的NOR抗體濃度為1μg/mL、預反應時間為1min,光纖反應時間為240s時,NOR檢測的條件最優(yōu),該條件下能夠得到有效的信號值同時檢測效率高.

3.2 選擇性實驗結果顯示, Cy5.5-NOR抗體對硫酸卡那霉素、氨卡西林、氟蟲腈、黃曲霉毒素等物質的信號響應程度遠低于NOR,表明該傳感器具有良好的選擇性.光纖探頭重復使用400次仍保持90%以上的信號水平,傳感器穩(wěn)定性和可重復性良好.

3.3 通過對自來水、景觀水、二沉池出水等不同基質進行不同濃度加標回收實驗,證明該傳感器具有良好的精密度和準確性,受環(huán)境基質的影響較小,能夠用于環(huán)境中實際水樣NOR的快速檢測.

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Rapid detection of norfloxacin in water by evanescent wave fiber optic biosensor.

ZHUO Yu-xin, XU Wen-juan, CHENG Yuan, SONG Dan, HAN Xiang-zhi, LONG Feng*

(School of Environment and Natural Resources, Renmin University of China, Beijing 100872, China), 2022,42(5)：2283～2288

Norfloxacin (NOR), a widely used antibiotic, is becoming a major threat to ecological security. The existing detection methods have either high cost and pretreatment requirements or long detection time and poor sensitivity. Based on indirect competitive immunoassay principle, a new detection method of norfloxacin was developed using the evanescent wave fiber optic bio sensing platform. The rapid and sensitive detection of norfloxacin in water was achieved. The optimal detection conditions of norfloxacin were as follows: antibody concentration was 1μg/mL, pre-reaction time was 1min, and reaction time was 4min. Under the optimal conditions, the detection limit of norfloxacin was 1.89μg/L. The coating-antigen modified fiber optic probe showed good specificity for fluorescence-labeled anti-norfloxacin antibody and stability, and could be reused more than 400 times. The recovery results of the spiked water samples, such as tap water, landscape water, and effluent of secondary sedimentation tank, demonstrated that the proposed biosensor had good precision and accuracy, and was less affected by the environmental matrix. The presented biosensor can be used for the rapid detection of NOR in actual water samples.

norfloxacin；antibiotics；evanescent wave biosensor；immunoassay；environmental monitoring

X83

A

1000-6923(2022)05-2283-06

卓雨欣(1996-),女,福建寧德人,碩士研究生,主要研究方向為環(huán)境監(jiān)測與生物傳感器.發(fā)表論文2篇.

2021-09-22

國家自然科學基金資助項目(21675171)和北京市自然科學基金-海淀原始創(chuàng)新聯(lián)合基金資助項目(L182045)

* 責任作者, 教授, longf04@ruc.edu.cn