張 鶴，敖平星，趙 雁

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南 昆明650201)

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)是植物體內(nèi)所有四吡咯化合物(如血紅素、葉綠素、維生素B12和卟啉等)生物合成的關(guān)鍵前體，與植物的生命活動密切相關(guān)[1-2]。研究表明ALA是一種新型植物生長調(diào)節(jié)劑，能調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育[3]，提高葉綠素含量[4]，顯著促進光合速率[5-6]。如外源ALA處理可以上調(diào)馬鈴薯(Solanumtuberosum)葉片PSⅡ反應(yīng)中心核心蛋白D1和D2編碼基因表達，提高光系統(tǒng)Ⅱ(Photosystem Ⅱ，PSⅡ)反應(yīng)中心活性，促進光合運轉(zhuǎn)速率[7]；Wang等[8]對小麥(Triticumaestivum)的研究也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)論。此外，噴施ALA還可以調(diào)節(jié)逆境脅迫下植物體內(nèi)的抗氧化酶活性，清除過剩的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，降低相對電導(dǎo)率(Relative conductivity，EL)和丙二醛(Malonydialdehyde，MDA)含量，保護細胞膜穩(wěn)定性，從而提高植物抗逆性[9]。ALA對人類和牲畜沒有毒害作用，可生物降解、對環(huán)境友好[10]，因此在植物抗逆性研究中具有巨大的潛力。目前，利用外源ALA提高植物抗逆性的研究主要集中在無花果(Ficuscarica)[11]、黃瓜(Cucumissativus)[12]、西瓜(Vitisvinifera)[13]等園藝作物上，而對其影響豆科牧草抗逆性的研究鮮有報道。

近幾年全球氣候驟變，高溫氣候環(huán)境越來越嚴重。根據(jù)IPCC第六次報告公布的數(shù)據(jù)，預(yù)計到2100年氣溫將上升1.5～5.8℃[14]。高溫引起植物形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理、生化和分子水平的一系列變化，最終影響植物的生長發(fā)育，導(dǎo)致經(jīng)濟產(chǎn)量和品質(zhì)嚴重下降[15-16]。在高溫脅迫下，氧化應(yīng)激通常產(chǎn)生大量的ROS，過剩的ROS可以通過葉綠體、線粒體和過氧化物酶體的氧化對植物細胞造成不可逆的損傷[17]。開發(fā)抗高溫脅迫的品種或噴施植物生長調(diào)節(jié)劑提高植物耐熱性是研究熱點[18-19]。紫花苜蓿(MedicagosativaL.)和南苜蓿(MedicagohispidaL.)均為苜蓿屬優(yōu)質(zhì)牧草，但高溫脅迫是限制其在亞熱帶地區(qū)大面積推廣應(yīng)用的主要因素之一。鑒于此，本研究以苜蓿屬3個品種為材料，探究外源ALA延緩高溫脅迫下苜蓿植物葉片衰老的生理機制，為ALA在苜蓿植物上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種為紫花苜蓿(M.sativa)WL525HQ購于北京正道生態(tài)科技有限公司，德欽苜蓿(M.sativa‘Deqin’)由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)畢玉芬教授贈送，楚雄南苜蓿(M.hispida‘Chuxiong’)由云南省草地動物研究所贈送，3個品種的種子均為當年生種子，均存于4℃避光條件下，種子發(fā)芽率分別為92%，68%，76%。

1.2 試驗處理

將顆粒飽滿的苜蓿種子置于濕潤的紗布中，25℃催芽，然后移栽至小花盆中，栽培基質(zhì)為滅菌泥炭土，每盆栽植4株(7 cm×7 cm)。每隔2 d澆1次Hoagland營養(yǎng)液，并將小花盆放置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為24℃/18℃(晝/夜)，白天12 h，夜晚12 h，相對濕度在65%，光照強度為400 μmol·m-2·s-1。待長至35 d苗齡時，選取長勢一致的苜蓿植株放入人工智能氣候箱中模擬高溫環(huán)境脅迫。在進行高溫脅迫前先對苜蓿植株進行ALA預(yù)處理，即在常溫下(24℃/18℃晝/夜12 h/12 h)對植株葉面噴施不同濃度的ALA水溶液(0，5，10，15，20，25 mg·L-1ALA)，以葉片正面和背面濕潤滴水為標準，連續(xù)噴施4 d，再進行高溫脅迫(42℃/38℃，晝/夜，12 h/12 h) 3 d。試驗共設(shè)置7個處理：①常溫培養(yǎng)+蒸餾水(CK)；②高溫脅迫+蒸餾水(Heat)；③高溫脅迫+5 mg·L-1ALA (HA1)；④高溫脅迫+10 mg·L-1ALA (HA2)；⑤高溫脅迫+15 mg·L-1ALA (HA3)；⑥高溫脅迫+20 mg·L-1ALA (HA4)；⑦高溫脅迫+25 mg·L-1ALA (HA5)。每個處理重復(fù)3次，高溫脅迫3 d后采集苜蓿植株頂芽下第一片真葉，-80℃保存，用于各生理指標的檢測。

1.3 生理指標的測定

葉綠素含量采用酒精浸提法測定[20]；MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定[21]；相對電導(dǎo)率的測定方法參照葉尚紅等[22]的方法并稍作改動；SOD、POD和CAT活性參考李合生[21]的方法并加以改良。

1.4 隸屬函數(shù)值及隸屬度[23]

隸屬函數(shù)值計算公式：

X(u)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

X(u)=1-[(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)]

(2)

式中：X為各苜蓿屬植物中某一指標的測定值，Xmin為該指標測定值的最小值，Xmax為該指標測定值的最大值；當測定指標與植物耐熱性呈正相關(guān)時采用公式(1)，當測定指標與植物耐熱性呈負相關(guān)時采用公式(2)。

隸屬度=∑(X(u1)+X(u2)+…+X(un)/n

式中：n為指標數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計分析

用Excel計算和整理數(shù)據(jù)；用SPSS 21.0對不同處理的各指標進行方差分析(P<0.05)，用LSD和Dunnett T3對各參數(shù)平均數(shù)進行顯著性檢驗和多重比較，同時，以處理和品種作為固定因子，對各指標進行雙因素方差分析；用Origin 2019做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ALA對高溫脅迫下苜蓿屬植物葉片相對電導(dǎo)率和MDA含量的影響

外源ALA濃度梯度對高溫脅迫下3個苜蓿品種葉片的影響表現(xiàn)出濃度效應(yīng)(圖1)。與CK相比，Heat處理使各品種中葉片發(fā)生了枯萎失綠現(xiàn)象，而經(jīng)不同濃度ALA預(yù)處理后再進行高溫脅迫，各品種中葉片枯萎失綠程度降低。這種形態(tài)上的變化趨勢在生理指標EL和MDA含量中也得到驗證。由圖2可知，Heat處理使各品種中葉的EL和MDA含量顯著升高(P<0.05)。與CK相比Heat處理下各品種苜蓿葉中EL分別升高了205.844%，206.589%和226.741% (圖2A)，MDA含量分別升高了112.649%，110.140%和124.664% (圖2B)。高溫脅迫下噴施不同濃度ALA預(yù)處理后，各品種中葉的EL和MDA含量與Heat處理相比均顯著降低(P<0.05)，其中在HA4處理下各品種中葉的EL和MDA含量最低，與CK差異不顯著，且各品種中葉的EL和MDA在HA2、HA3和H5處理間兩兩差異不顯著。

圖1 不同處理下的苜蓿植株葉片形態(tài)Fig.1 The morphology of alfalfa plants leaves under different treatments注：A,楚雄南苜蓿(M. hispida ‘Chuxiong’)，B,紫花苜蓿WL525HQ(M. sativa ‘WL525HQ’)，C,德欽紫花苜蓿(M. sativa ‘Deqin’)Note:A,M. hispida ‘Chuxiong’,B, M. sativa ‘WL525HQ’,C,M. sativa ‘Deqin’

圖2 ALA對高溫脅迫下苜蓿葉片相對電導(dǎo)率和MDA含量的影響Fig.2 Effect of ALA on EL and MDA content of Medicago leaves under high temperature stress注：同品種不同處理下，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；M-525代表紫花苜蓿WL525HQ(M. sativa ‘WL525HQ’)，M-DQ代表德欽紫花苜蓿(M. sativa ‘Deqin’)，M-CX代表楚雄南苜蓿(M. hispida ‘Chuxiong’)。下同Note:Different lowercase letters indicate significant differences between different treatment of the same cultivar at the 0.05 level. M-525 for M. sativa ‘WL525HQ’,M-DQ for M. sativa ‘Deqin’,M-CX for M. hispida ‘Chuxiong’. The same as below

2.2 ALA對高溫脅迫下苜蓿屬植物葉片抗氧化酶活性的影響

由圖3可知，Heat處理使各品種中葉的CAT、SOD和POD活性顯著降低(P<0.05)。與CK相比Heat處理下各品種苜蓿葉中CAT活性分別下降了46.510%，45.292%和51.065%(圖3A)；SOD活性分別下降了53.176%，52.416%和56.150% (圖3B)；POD活性分別下降了28.325%，28.235%和35.448%(圖3C)。高溫脅迫下噴施不同濃度ALA預(yù)處理后，各品種中葉的CAT,SOD和POD活性與Heat處理相比均有上升，且這3個酶活性隨著ALA濃度的增加總體上呈現(xiàn)先升后降的趨勢；其中在HA4處理下各品種中葉的CAT、SOD和POD活性達到峰值，與Heat差異顯著(P<0.05)，與CK差異不顯著；且各品種中葉的3個酶活性在其余ALA處理間兩兩差異不顯著，與Heat也無顯著差異。

圖3 ALA對高溫脅迫下苜蓿葉片CAT、SOD和POD活性的影響Fig.3 Effect of ALA on CAT，SOD and POD activity of Medicago leaves under high temperature stress

2.3 ALA對高溫脅迫下苜蓿屬植物葉片葉綠素含量的影響

由圖4可知，Heat處理使各品種中葉綠素a、b和總?cè)~綠素含量均顯著降低(P<0.05)。與CK相比Heat處理下3個品種苜蓿葉綠素a分別下降了36.214%，29.890%和48.875% (圖4A)；葉綠素b分別下降了47.387%，30.611%和52.147% (圖4B)；總?cè)~綠素含量分別下降了39.775%，30.137%，49.903% (圖4C)。高溫脅迫下噴施不同濃度ALA預(yù)處理后，各品種中葉綠素a,b和總?cè)~綠素含量與Heat處理相比均有上升，且這3個指標隨著ALA濃度的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢。在HA4處理下各品種中葉綠素a,b和總?cè)~綠素含量最大且顯著高于Heat處理(P<0.05)，但與其余4組ALA處理和CK相比差異不顯著。

圖4 ALA對高溫脅迫下苜蓿葉片葉綠素含量的影響Fig.4 Effect of ALA on chlorophyll content of Medicago leaves under high temperature stress

2.4 影響苜蓿屬植物各測定指標的因素效應(yīng)分析

利用SPSS 21.0軟件中一般線性模型對品種和處理進行雙因素方差分析可知(表1)，處理對各測定指標有顯著影響(P<0.05)；品種除了對CAT和POD活性無顯著影響外，對其余指標均有顯著影響(P<0.05)；處理和品種的交互作用對所有指標均無顯著影響。由于Partial Eta Squared(η2)值的大小表示著主效應(yīng)的大小[24]，故在上述的顯著效應(yīng)中，其對各測定指標作用的大小次序為：處理>品種。因此在本試驗分析中主要考慮不同處理對苜蓿植株各測定指標的影響，雖然品種間也存在顯著差異，但這種差異可能是由品種自身特異性所決定的，所以未考慮品種間的差異。

表1 品種和處理對各測定指標的雙因素方差分析Table 1 Two way ANOVA of variety and treatment on each measured index

2.5 ALA緩解苜蓿屬植物高溫脅迫適宜濃度的篩選

隸屬函數(shù)分析提供了一種在多指標測定基礎(chǔ)上，對植物特性進行綜合評價的方法，這種分析方法可以消除單一指標評價的片面性[25]。為了能夠清晰的反映不同濃度ALA預(yù)處理對苜蓿植物耐熱性的影響，采用隸屬函數(shù)分析將3個苜蓿品種中與耐熱性相關(guān)的8個指標進行綜合評價。由表2可知，在HA4處理下，這8個指標的隸屬函數(shù)值大多都很高，隸屬度為0.969，排名第1，優(yōu)于CK，說明20 mg·L-1ALA預(yù)處理對這3個苜蓿品種高溫脅迫的緩解作用最好，耐熱性也最強。在高溫脅迫下(Heat)，各指標的隸屬函數(shù)值和隸屬度最小均為0.000，處于本次耐熱性排序的末端，說明在高溫脅迫下未經(jīng)ALA預(yù)處理的各苜蓿品種受到的熱損害最嚴重，耐熱性最差。

表2 ALA對高溫脅迫下苜蓿葉片各測定指標的隸屬函數(shù)分析Table 2 Membership function analysis of ALA on various measured indexes of Medicago leaves under high temperature stress

3 討論

5-氨基乙酰丙酸(ALA)是一種天然氨基酸，具有生長發(fā)育調(diào)節(jié)功能[26]，可以提高植物的抗逆性，在農(nóng)林生產(chǎn)上具有廣闊用途。在園林植物上，用 50 mg·L-1ALA可以提高金森女貞(Ligustrumjaponicum‘Howardii’)葉片的耐熱性[27]；在園藝作物上，用25 mg·L-1ALA能促進低溫脅迫下番茄(Solanumlycopersicum)幼苗的生長，提高其抗冷性[28]；在大田作物上，用30 mg·L-1ALA可提高RWC和葉綠素含量，增強油菜(Brassicanapus)的抗旱性[29]。盡管不同植物間的反應(yīng)有所差異，但ALA能明顯提高植物的抗逆性。本研究對3個苜蓿品種的各耐熱性指標進行雙因素方差分析，結(jié)果表明，與品種因素相比，ALA處理對苜蓿植株耐熱性的影響作用占主導(dǎo)地位，其中以20 mg·L-1ALA能顯著提高苜蓿抵抗高溫的能力。

高溫脅迫下植物體內(nèi)會積聚大量的活性氧，從而加劇細胞膜脂的過氧化作用，并破壞細胞膜的穩(wěn)定性，使細胞液外滲，導(dǎo)致相對電導(dǎo)率升高[30-31]。而膜脂過氧化的最終產(chǎn)物之一是MDA[32]。所以常將MDA含量和相對電導(dǎo)率作為評判植物細胞膜受損程度的重要指標[33]。有研究表明，高溫下細胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性與相關(guān)相對電導(dǎo)率和MDA含量呈現(xiàn)負相關(guān)[34]。馮漢青等[35]研究表明，在高溫脅迫下外源ALA的施用可以顯著降低當歸幼苗(Angelicasinensis)中MDA含量，增強了幼苗對逆境的適應(yīng)能力。本研究結(jié)果表明，在高溫脅迫下3個品種中葉片的相對電導(dǎo)率和MDA含量顯著升高，葉片出現(xiàn)枯萎失綠現(xiàn)象，施用不同濃度的ALA預(yù)處理后可降低相對電導(dǎo)率和MDA含量，增強細胞膜的穩(wěn)定性。在高溫脅迫下，較高活性的抗氧化酶能夠有效除細胞內(nèi)過剩自由基和活性氧，保護細胞免受氧化傷害，維持植物正常生長[36-38]。與對照相比，在高溫脅迫下各苜蓿品種中葉片的中抗氧化酶(SOD，POD和CAT)活性均有顯著下降，施用外源ALA預(yù)處理后，3種抗氧化酶活性均升高，這與Katuwal等[39]的研究結(jié)果相似。在高溫脅迫下，ALA通過提升3個苜蓿品種中葉片的膜穩(wěn)定性和抗氧化能力來延緩葉片衰老，從而提高其耐熱性。

光合作用是植物體進行物質(zhì)轉(zhuǎn)換及能量代謝的主要途徑，而葉綠素又是植物進行光合作用的主要色素，其含量的高低很大程度上決定著植物光合能力的強弱[2]。在植物中，ALA是合成葉綠素分子中吡咯環(huán)的起始物質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)植物葉綠素的合成，促進葉綠素a氧化為葉綠素b[40]。Zhang等[41]研究表明，鹽脅迫下外源ALA處理能使決明(Cassiaobtusifolia)葉片保持較高的葉綠素含量和光合速率，葉自慧等[42]對菊花(Chrysanthemum×morifolium)的研究也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)論。本研究結(jié)果與之相似，在高溫脅迫下施用外源ALA預(yù)處后可以提高各品種中葉片的葉綠素a、b和葉綠素總量。

4 結(jié)論

高溫脅迫抑制了紫花苜蓿WL525HQ和德欽苜蓿以及楚雄南苜蓿葉片的生長，使葉片出現(xiàn)枯萎失綠的現(xiàn)象。經(jīng)ALA預(yù)處理后能有效緩解高溫脅迫對這3個苜蓿品種的熱損傷，使葉片中相對電導(dǎo)率和MDA含量顯著降低，保護膜穩(wěn)定性；提高抗氧化酶(CAT、SOD和POD)活性，延緩葉片衰老；增加葉綠素含量，促進光合作用，進而提高3個苜蓿品種的耐熱性。隸屬函數(shù)綜合評價認為當ALA濃度為20 mg·L-1時緩解高溫脅迫效果最好。