馬桂花，段曉明,2，徐文華，周淵濤，馬海霞，馬偉麗，祁鶴興*

(1. 青海大學農牧學院，青海 西寧 810016； 2. 青海正德農牧開發(fā)有限公司，青海 西寧 810016；3. 中國科學院西北高原生物研究所，青海 西寧 810016)

黃芪為豆科黃芪屬植物蒙古黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge. var.mongholicus(Bge.)Hsiao)或膜莢黃芪(A.membranceus(Fisch.)Bge)的干燥根[1-2]，具有提高免疫力、保護肝臟、滋養(yǎng)補益、利尿消腫、抗糖尿病等多種藥用價值，是中醫(yī)藥學公認的道地大宗藥材和保健品原料[3-4]。野生黃芪產于我國東北、華北和西北等地。人工栽培黃芪主產于內蒙古、山西、甘肅、四川、陜西、黑龍江、寧夏等地[5]。近年來隨著市場需求量的持續(xù)增加，黃芪種植面積不斷擴大，根腐病作為一種毀滅性土傳病害，在黃芪種植中發(fā)生逐年加重，嚴重影響其產量和品質[6]。

黃芪根腐病發(fā)生時主根最先受害，然后向側根蔓延。植株長勢弱小，葉色枯黃，嚴重時脫落；地下部分根表面出現病斑且表皮粗糙，維管束變褐，根系后期發(fā)黑潰爛，植株易被拔起[7]。已有研究表明，黃芪根腐病致病菌主要是鐮刀菌屬Fusarium真菌，該屬真菌寄生或腐生生活，分布廣泛，可侵染多種植物，引起根腐、莖基腐等多種病害[8]。引起黃芪根腐病的鐮刀菌主要有腐皮鐮刀菌(F.solani)[9]，尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)[10]，銳頂鐮刀菌(F.acuminatum)[11]，芬芳鐮刀菌(F.redolens)[12]，串珠鐮刀菌(F.moniliforme)[13]和木賊鐮刀菌(F.equisetim)[14]等。

國內外對黃芪根腐病的防治主要采用化學防治，其中高效低毒殺菌劑是化學防治的首選藥劑，如多菌靈、苯醚甲環(huán)唑和甲基硫菌靈等[15-17]。生物防治方面，在我國已登記的生物農藥中尚沒有針對黃芪根腐病的生防藥劑。在已報道的拮抗菌生物防治黃芪根腐病的研究中，主要處于對土壤微生物[18]和植物內生生防菌株[19]的室內篩選和盆栽試驗階段，效果較好的微生物包括枯草芽孢桿菌和哈茨木霉等，缺乏大規(guī)模田間應用的微生物藥劑產品。

2021年，青海省中藏藥種植面積為22.25萬hm2，是西部地區(qū)重要的中藥材種植區(qū)。蒙古黃芪是青海省中藥材發(fā)展的特色產業(yè)之一，民和縣、樂都縣、互助縣和湟中縣等地都有大量的蒙古黃芪種植，但是目前尚未見對青海省蒙古黃芪根腐病的研究報道。根腐病的發(fā)生不僅影響黃芪品質，還嚴重影響產量和經濟。因此，對黃芪根腐病病原菌進行鑒定及篩選防治藥劑對于后續(xù)開展大田防治是重要的前期工作之一。

青海省民和縣位于青海省東部，其東部和南部與甘肅省毗連，氣候條件適合黃芪生長。但是根腐病的發(fā)生影響當地黃芪的品質和產量。本研究從青海省海東市民和縣馬營鎮(zhèn)灑達莊村采集蒙古黃芪根腐病病樣進行病原菌的分離、鑒定和室內藥劑防治效果測定，在明確病原菌種類的前提下，篩選出能有效抑制病原菌生長的高效低毒殺菌劑，旨在為后續(xù)開展大田防治提供理論依據和基礎。

1 材料與方法

1.1 材料來源

2020年6月從青海省海東市民和縣馬營鎮(zhèn)灑達莊村(102°83′00.00″ E，36°31′93.00″ N,海拔2 391 m)采集具有根腐病癥狀的蒙古黃芪3份，及時帶回實驗室分離病原菌。

1.2 培養(yǎng)基配制

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)配制參照祁鶴興等[20]的方法。2%水瓊脂培養(yǎng)基(2%WA)：瓊脂 20 g加入蒸餾水并定容至1 L，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

1.3 供試殺菌劑

50%多菌靈可濕性粉劑(WP)，購自四川潤爾科技有限公司。特點：廣譜內吸性殺菌劑，具有保護和治療作用。作用方式：干擾病原菌有絲分裂中紡錘體的形成，影響細胞分裂。

25%溴菌腈可濕性粉劑(WP)，購自江蘇托球農化股份有限公司。特點：廣譜、高效；具有保護、內吸治療和鏟除功能。作用方式：能夠迅速被菌體細胞吸收，并在菌體細胞內傳導，抑制病原菌氨基酸代謝酯酶系統(tǒng)，破壞病原菌蛋白質生物合成，從而達到抑菌、殺菌作用。

70%甲基硫菌靈可濕性粉劑(WP)，購自濟南泰禾化工有限公司。特點：廣譜內吸性殺菌劑，具有內吸、預防和治療作用。作用方式：干擾病原菌菌絲的形成，影響病菌細胞的分裂，使孢子萌發(fā)長出的芽管畸形，從而殺死病菌。

50%咯菌腈可濕性粉劑(WP)，購自先正達作物保護有限公司。特點：非內吸性的廣譜殺菌劑。作用方式：抑制葡萄糖磷?；嘘P酶的轉移，并抑制真菌菌絲體的生長，最終導致病菌死亡。

30%噁霉靈水劑(AS)，購自江西禾益化工股份有限公司。特點：廣譜內吸性殺菌劑，具有治療、內吸和傳導作用。作用方式：與土壤中的鐵、鋁等無機金屬鹽離子結合，有效抑制孢子的萌發(fā)和病原真菌菌絲體的正常生長或直接殺滅病菌。

50%苯醚甲環(huán)唑懸浮劑(SC)，購自江蘇云帆化工有限公司。特點：廣譜內吸性殺菌劑，具預防、保護和內吸活性。作用方式：甾醇脫甲基化抑制劑，抑制細胞壁甾醇的生物合成，阻止真菌生長。

25%硅唑·咪鮮胺水乳劑(EW)，購自上海滬聯生物藥業(yè)股份有限公司。特點：氟硅唑屬廣譜內吸性殺菌劑，具有內吸活性，保護和治療作用。作用方式：咪鮮胺具有保護和鏟除作用，破壞和阻止病菌的細胞膜重要組成成分麥角甾醇的生物合成，導致細胞膜不能形成，使病菌死亡。

45%石硫合劑可濕性粉劑(WP)，購自河北雙吉化工有限公司。特點：高效廣譜、持久、保護性殺菌劑。作用方式：其中的多硫化鈣在空氣中經氧、水和二氧化碳的影響發(fā)生化學變化，形成硫黃微粒而起殺菌作用。

8種殺菌劑均為低毒殺菌劑，作用特點、作用機制和毒性參照孫家隆和齊軍山等研究結果[21]。

1.4 病原菌的分離、純化與保存

病原菌的分離純化參照魏琳等[22]的方法。分離到的單孢菌株采用濾紙片保存法[23]，置于—20℃冰箱長期保存。

1.5 病原菌的分類鑒定

1.5.1菌株形態(tài)學鑒定 將分離得到的單孢代表菌株接種于PDA平板上，置于25℃培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)7 d，挑取分生孢子制成臨時玻片，在光學顯微鏡(40倍物鏡)下觀察分生孢子形態(tài)。菌株在PDA平板上生長7 d后，用直徑0.5 cm的打孔器取菌餅放置在PDA平板中。每株菌株3個重復，并且每皿培養(yǎng)基的厚度保持一致。放置于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后，觀察菌落形態(tài)，并計算平均生長速率。

1.5.2菌株基因組DNA的提取 采用CATB法提取基因組DNA[22,24]，最后用25 μL TE/RNase溶解沉淀，—20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3菌株序列分析 rDNA-ITS擴增引物為ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[25]；TEF-1α基因擴增引物：EF-1(5′- ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3′)和EF-2(5′-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3′)[26-27]；RPB2基因擴增引物：RPB2-5F(5′-GAYGAYMGWGATCAYTTYGG-3′)和RPB2-7CR(5′-CCCATRGCTTGYTTRCCCAT-3′)[28-29]。反應體系(25 μL)：2×PCR Mix(北京天根生物科技)12.5 μL；上下游引物各(25 pmol·L-1)1.0 μL，；模板DNA(30 μg·L-1)1.0 μL；雙蒸水補足至25 μL。PCR反應程序為:變性95℃，5 min;然后30個循環(huán)的變性95℃，1 min;退火55℃，1 min;延伸72℃，2 min;最后延伸72℃，10 min。用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產物，PCR擴增產物純化后由北京擎科新業(yè)生物技術公司進行雙向測序。使用軟件MAFFT對正反向序列進行拼接，拼接序列在MEGA V. 6.0.6 軟件進行校正。使用PAUP* v. 4.0 alpha軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用啟發(fā)式算法(heuristic searches)進行運算。以交鏈格孢Alternariaalternata作為外群，運算重復 1 000 次。參照菌株序列下載自NCBI數據庫。

1.6 病原菌回接試驗

病原菌回接試驗步驟參照魏琳等[22]和任小霞等[30]的方法，并有所改進。將菌株接種至PDA培養(yǎng)基平板，25℃培養(yǎng) 7 d，用 0.025% Tween 20溶液洗下分生孢子并制備濃度為1×105個·mL-1的孢子懸浮液。在9 cm無菌培養(yǎng)皿中放置無菌濾紙，并加適量無菌水保持濕潤，將健康蒙古黃芪根部截成小段放置于培養(yǎng)皿中，孢子懸浮液點接于根部表面，每點接種10 μL，以接種無菌水為對照。置于25℃ 培養(yǎng)箱黑暗保濕培養(yǎng)24 h，后進行12 h光照12 h黑暗培養(yǎng)。接種7 d后觀察根部發(fā)病情況。

1.7 殺菌劑的抑菌作用測定

采用菌絲生長抑制法[31]。用分析天平準確稱量殺菌劑，分別放入5 mL EP管中，加入一定體積的二甲基亞砜(DMSO)，振蕩至藥劑充分溶解，配制成105mg·L-1的有效成分母液，4℃黑暗保存?zhèn)溆?。之后用DMSO稀釋，制成系列濃度梯度藥液，加入PDA培養(yǎng)基中，充分搖勻，制成含藥平板(9 cm)，以加入等量DMSO的PDA培養(yǎng)基為對照。25%溴菌腈、50%多菌靈、50%咯菌腈和45%石硫合劑設置6個濃度梯度，分別為：0.4，0.9，1.6，3.2，6.4和12.8 mg·L-1。30%噁霉靈設置6個濃度梯度，分別為：0.5，1，2，4，8和16 mg·L-1。70%甲基硫菌靈設置7個濃度梯度，分別為：0.3，0.9，1.2，2.4，4.8，9.6和19.2 mg·L-1。50%苯醚甲環(huán)唑和25%硅唑·咪鮮胺設置7個濃度梯度，分別為：0.4，0.9，1.6，3.2，6.4，12.8和25.6 mg·L-1。

用滅菌的打孔器在菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅，接種到含藥平板中央，每處理3次重復，25℃黑暗培養(yǎng)7 d后，用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。

使用SPSS 17.0數據處理軟件，求出斜率±標準誤差、EC50(引起50%個體有效的藥物濃度)、95%置信限、χ2(卡方值)和P值(顯著性水平)。

2 結果與分析

2.1 蒙古黃芪根腐病田間癥狀及其病原菌柯赫氏法則驗證

在青海民和地區(qū)，蒙古黃芪發(fā)生根腐病后，地上部分褪綠(圖1a)、后期變黃枯萎(圖1b)，莖基和主根變?yōu)榧t褐色干腐狀，上有縱裂或紅色條紋，側根已腐爛或很少(圖1c)，濕度大時根部長出白色或者粉色霉層(圖1d)。從采集的蒙古黃芪根腐病根部共分離得到9株菌株，分離菌株經柯赫氏法則驗證，對蒙古黃芪根均有致病性，接種5 d后接種部位開始形成腐爛病斑，后續(xù)出現不同程度的凹陷，并能觀察到氣生菌絲(圖2)。從發(fā)病病斑再次分離得到病原菌，菌株形態(tài)與田間菌株一致(圖3a和圖3b)。

圖1 田間蒙古黃芪根腐病癥狀Fig.1 Symptoms of root rot of A. membranaceus var. mongholicus in field注：a為地上部分早期癥狀；b為地上部分后期癥狀；c為主根癥狀；d為根部霉層Note:a for early symptom of aboveground part;b for late symptom of aboveground part;c for symptom of main root;d for white mold on root

圖2 蒙古黃芪根腐病病原菌接種黃芪根部Fig.2 Inoculation figure of pathogens from root rot of Astragalus membranaceus var．mongholicus注：左邊為無菌水對照，其余圖例為黃芪根腐病菌菌株名稱Note:On the left is the sterile water control,and the other legends represent the name of the root rot pathogens of Astragalus membranaceus var．mongholicus

2.2 黃芪根腐病病原菌形態(tài)學和分子生物學鑒定

對病原菌菌落形態(tài)、氣生菌絲、分生孢子和產孢細胞形態(tài)進行觀察(圖3)，發(fā)現9株病原菌可分為4種。菌株HQ-2-2,HQ-2-2-1和HQ-7形態(tài)特征一致，菌絲平均生長速率為0.84 cm·d-1，氣生菌絲稀疏，初期呈白色，生長后期有的菌絲呈棕藍色，基質為玫瑰色；小型分生孢子無色，無隔膜，大小約(8.03～14.28) μm×(2.34～4.68) μm，大型分生孢子無色，鐮刀狀，2～5個隔膜，大小約(22.98～48.55) μm×(3.61～5.68) μm；產孢細胞單瓶梗，產孢梗長，分生孢子聚生于頂端。

圖3 蒙古黃芪根腐病病原菌代表菌株菌落、分生孢子和產孢細胞形態(tài)Fig.3 Morphology of colony,conidium and conidiogenous cell of represent root rot pathogens of Astragalus membranaceus var．mongholicus注：a為田間分離菌株；b為室內接種發(fā)病根部分離菌株；c和d為田間分離菌株分生孢子和分生孢子梗Note:a were wild isolates;b were isolates from infected root inoculated indoor;c and d were conidia and conidiophore of wild isolates

菌株HQ-8和HQ-8-1形態(tài)特征一致，生長緩慢，平均生長速率為0.51 cm·d-1，氣生菌絲稀疏，初期白色，生長后期呈現藍色，且生長時間越長顏色越深；大型分生孢子豐富，無色，1～5個隔膜，大小約為(21.22～51.05) μm×(2.23～5.14) μm，分生孢子梗輪枝狀分枝，產孢細胞單瓶梗；小型分生孢子缺乏。

菌株HQ-3,HQ-5和HQ-9形態(tài)特征一致，菌絲平均生長速率為0.94 cm·d-1，氣生菌絲白色，羊絨狀，基質淡黃色；大型分生孢子無色，1～4個隔膜，大小約(23.01～37.93) μm×(3.93～4.60) μm，產孢細胞側生于梗上，單瓶梗；小型分生孢子不常見。

菌株HQ-5-1菌絲平均生長速率為0.71 cm·d-1，氣生菌絲生長茂盛，毛氈狀，玫紅色；大型分生孢子數量少，無色，1～4個隔膜，大多2個隔膜，大小約(28.77～40.21) μm×(3.09～5.73) μm，小型分生孢子極少見；產孢細胞單瓶梗，側生于梗上。

對病原菌進行分子生物學鑒定，將所測得代表菌株的rDNA-ITS序列、TEF-1α基因序列和RPB2基因序列在GenBank中與已知的序列進行BLASTs相似性比較分析，以已在NCBI公布序列的菌株作為參考菌株，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定菌株的分類地位。

基于菌株rDNA-ITS序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，HQ-2，HQ-2-2-1和HQ-7與腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)在同一發(fā)育分支上，親緣關系最近；菌株HQ-3，HQ-5和HQ-9與木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)在同一發(fā)育分支上，親緣關系最近；菌株HQ-5-1與銳頂鐮刀菌(Fusariumacuminatum)聚為1個分支，親緣關系最近；菌株HQ-8和HQ-8-1與逗號鐮刀菌(Fusariumvirguliforme)聚為1個分支，親緣關系最近?；赥EF-1α基因序列和RPB2基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5和圖6)中菌株分類地位與基于rDNA-ITS序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹一致。

圖4 蒙古黃芪根腐病病原菌基于rDNA-ITS序列序列聯合構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The maximum parsimony tree of root rot pathogens of Astragalus membranaceus var．mongholicus inferred from combined sequences of rDNA-ITS

圖5 蒙古黃芪根腐病病原菌基于TEF-1α基因序列聯合構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 The maximum parsimony tree of root rot pathogens of Astragalus membranaceus var．mongholicus inferred from combined sequences of TEF-1α gene

因此，結合形態(tài)學特征，菌株HQ-2-2，HQ-2-2-1和HQ-7為腐皮鐮刀菌；菌株HQ-8和HQ-8-1為逗號鐮刀菌；菌株HQ-3，HQ-5和HQ-9為木賊鐮刀菌；菌株HQ-5-1為銳頂鐮刀菌。

2.3 病原菌對殺菌劑的敏感性

通過測定8種殺菌劑對腐皮鐮刀菌HQ-2-2、逗號鐮刀菌HQ-8、木賊鐮刀菌HQ-3和銳頂鐮刀菌HQ-5-1菌絲生長的抑制作用，發(fā)現硅唑·咪鮮胺對4種鐮刀菌的抑制作用最強，EC50分別為0.195,0.281,0.588和0.266 mg·L-1。多菌靈對腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌和銳頂鐮刀菌的抑制作用較強，EC50分別為0.340，0.113和0.869 mg·L-1，但是對逗號鐮刀菌的抑制作用較差，EC50為1.183 mg·L-1?？┚鎸Χ禾栫牭毒?、木賊鐮刀菌和銳頂鐮刀菌的抑制作用較強，EC50分別為0.153，0.269和0.390 mg·L-1，但是對腐皮鐮刀菌的抑制作用較差，EC50為1.925 mg·L-1。銳頂鐮刀菌對苯醚甲環(huán)唑較為敏感，EC50為0.306 mg·L-1，其他3種鐮刀菌對苯醚甲環(huán)唑敏感性較差，EC50在1.529～2.354 mg·L-1之間。4種鐮刀菌對甲基硫菌靈和噁霉靈的敏感性較差，EC50在1.018～2.746 mg·L-1之間；溴菌腈和石硫合劑對4種鐮刀菌的抑制作用最差，EC50在2.196～4.360 mg·L-1之間(表1)。

表1 8種殺菌劑對蒙古黃芪根腐病病原菌的抑菌活性測定Table 1 Determination of the inhibition effects of eight fungicides against root rot pathogens of Astragalus membranaceus var. mongholicus

續(xù)表1

3 討論

本研究經柯赫式法則驗證、形態(tài)學和系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現，引起青海民和地區(qū)蒙古黃芪根腐病的病原菌有腐皮鐮刀菌、逗號鐮刀菌、木賊鐮刀菌和銳頂鐮刀菌。鐮刀菌引起的根腐病屬于土傳病害，病原菌可能是通過帶菌種子和種苗等方式進行遠距離傳播而來[32]，也可能是土著病原菌。鐮刀菌屬真菌可引起三七、川穹、板藍根、白芷、白術、當歸、柴胡等多種中草藥的根腐病，從而造成嚴重的產量和經濟損失?；瘜W防治方面，多菌靈、福美雙和苯醚甲環(huán)唑等化學藥劑對多種藥用植物根腐病具有較好的防治效果[33]。

通過對8種高效低毒殺菌劑進行篩選研究發(fā)現硅唑·咪鮮胺對4種鐮刀菌的抑制作用最強，目前，尚未見使用硅唑·咪鮮胺防治黃芪根腐病的相關報道。范錢等[17]研究發(fā)現多菌靈對山西省渾源縣黃芪根腐病主要致病菌尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌具有較好的抑制效果。我們也發(fā)現多菌靈對腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌和銳頂鐮刀菌的抑制作用較強，而對逗號鐮刀菌的抑制作用較差。范錢等[17]同時報道苯醚甲環(huán)唑對尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌的EC50分別為0.107 6 mg·L-1和66.055 9 mg·L-1。我們發(fā)現苯醚甲環(huán)唑對銳頂鐮刀菌的抑制作用較好，EC50為0.306 mg·L-1，對其他3種鐮刀菌的抑制作用較差。朱蕾[15]報道甲基硫菌靈對蒙古黃芪根腐病病原菌尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌的抑制效果顯著，EC50分別為0.659 9和0.564 3 mg·mL-1。何晨等[16]研究發(fā)現甲基硫菌靈(502.5 g·hm-2)浸根處理黃芪一年齡種苗可以有效防治根腐病菌尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌。但是我們發(fā)現甲基硫菌靈對蒙古黃芪4種病原菌的抑制效果較差，EC50在1.529～2.354 mg·L-1之間。與文獻報道存在藥效差異可能與病原種類和菌株的個體差異有關。

本研究篩選得到的室內防治效果較好的藥劑硅唑·咪鮮胺、多菌靈、苯醚甲環(huán)唑等都屬于廣譜、高效、低毒殺菌劑，沒有致殘、致畸、致突變的作用。目前，青海省黃芪根腐病防治研究還處于起步階段，連作障礙是導致黃芪根腐病的主要原因之一，在沒有有效的大田防治藥劑之前應提倡間作。后續(xù)我們將開展化學防治大田試驗及生物防治菌株的篩選工作，為實現該病害的綜合防治奠定基礎。

4 結論

本研究從青海民和地區(qū)采集蒙古黃芪根腐病樣本3份，從中分離得到9株病原菌，經形態(tài)學和分子生物學鑒定發(fā)現蒙古黃芪根腐病是由4種鐮刀菌引起的。其中逗號鐮刀菌引起黃芪根腐病為國內首次報道。針對分離鑒定的蒙古黃茂根腐病病原菌，篩選到了適宜的高效低毒殺菌劑硅唑·咪鮮胺和多菌靈，為蒙古黃芪根腐病的化學防治提供了候選藥劑，也為藥劑的輪換使用提供了科學依據。