張秀玲，汲 潤，李鳳鳳，李 晨，張文濤

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

藍(lán)靛果（），又名藍(lán)靛果忍冬、羊奶子，為忍冬科忍冬屬植物，其果實(shí)呈橢圓形，果肉細(xì)膩且果汁含量豐富。主要產(chǎn)區(qū)為我國的東北和華北地區(qū)，尤其是大興安嶺、小興安嶺地區(qū)。已有研究表明，藍(lán)靛果營養(yǎng)豐富，含有大量活性成分，尤其是花青素的含量遠(yuǎn)高于其他漿果，具較好的抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗炎活性等，對(duì)人體健康十分有益。

藍(lán)靛果存在采摘期短、不易貯藏的缺點(diǎn)，且果實(shí)中的不良風(fēng)味（酸味和苦味）限制了藍(lán)靛果鮮果的消費(fèi)，考慮到風(fēng)味的改善和生物活性、香氣的保存，果酒發(fā)酵可能是提高藍(lán)靛果資源利用價(jià)值的有效方式之一。目前對(duì)藍(lán)靛果酒的研究主要集中在加工工藝及抗氧化活性物質(zhì)分析等方面，包洪濤等對(duì)藍(lán)靛果酒加工過程中降酸、澄清等工藝流程進(jìn)行了研究，楊旭等研究了去渣發(fā)酵、帶渣發(fā)酵對(duì)于藍(lán)靛果酒香氣成分的變化，梁敏等對(duì)不同工藝條件下藍(lán)靛果酒發(fā)酵過程中花色苷的變化進(jìn)行了研究，而對(duì)藍(lán)靛果酒釀制過程中果酒品質(zhì)變化的綜合性分析較少。

已知關(guān)于藍(lán)靛果酒活性成分及香氣成分的研究主要集中在漿果品種、酵母菌株、發(fā)酵溫度和初始糖度等方面，卻鮮有關(guān)于發(fā)酵工藝對(duì)藍(lán)靛果酒活性成分、抗氧化能力及香氣輪廓變化的綜合研究，目前研究最多的釀酒工藝包括傳統(tǒng)的鮮汁發(fā)酵（利用果汁）、熟汁發(fā)酵（發(fā)酵前必須熱處理）和去渣發(fā)酵（發(fā)酵前去除果汁中的果皮和種子），不同發(fā)酵工藝的應(yīng)用導(dǎo)致最終果酒品質(zhì)的差異。因此，本研究選擇鮮汁發(fā)酵、熟汁發(fā)酵和去渣發(fā)酵3 種不同的發(fā)酵工藝，對(duì)不同工藝發(fā)酵藍(lán)靛果酒中乙醇體積分?jǐn)?shù)、活性成分、體外抗氧化能力和香氣成分進(jìn)行比較分析，以期能更好地了解不同發(fā)酵工藝對(duì)藍(lán)靛果酒整體質(zhì)量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)靛果（中科藍(lán)1號(hào)）于2021年成熟季節(jié)采自中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，速凍處理（－13～－15 ℃）后運(yùn)回東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工實(shí)驗(yàn)室冷藏。

果酒專用酵母RW 安琪酵母股份有限公司；果膠酶 滄州夏盛酶有限公司；福林-酚顯色劑、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny l-2-picrylhydrazyl，DPPH）、水溶性VE（Trolox）、焦性沒食子酸 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波清洗儀 深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；722紫外分光光度計(jì) 上海達(dá)平有限公司；PHS-3C-3E精密pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；RE-52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；WJS15E26榨汁機(jī)（原汁機(jī)） 廣東美的精品電器制造有限公司；6890-5973N氣相色譜-質(zhì)譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)靛果酒發(fā)酵工藝鮮汁發(fā)酵工藝路線：

1.3.2 操作要點(diǎn)

1）解凍：將藍(lán)靛果凍果置于室溫下解凍2 h；2）打漿破壁：將藍(lán)靛果放入榨汁機(jī)中破壁打碎，并充分?jǐn)嚢瑁?）酶解：在果漿中添加0.3%果膠酶（3 000 U/g），充分?jǐn)嚢韬?0 ℃條件下水浴90 min；4）煮制：將打漿破壁后的果漿加熱至沸騰，并在沸騰狀態(tài)下保持5～8 min；5）殺菌：向果漿中添加0.07 g/L KSO殺菌處理；6）調(diào)糖、調(diào)酸：加蔗糖至20 °Brix左右，加入NaHCO調(diào)酸至pH 3.6左右，轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐中；7）酵母活化：將安琪果酒專用酵母RW與5%糖水按質(zhì)量比為1∶10均勻混合，40 ℃條件下水浴40 min，10 ℃以下備用；8）主發(fā)酵：將果漿轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐中，28 ℃發(fā)酵10 d。發(fā)酵期間，需每日均勻攪拌一次，待含糖量降至1%以下，白利度不再減少時(shí)即為主發(fā)酵終點(diǎn)；9）補(bǔ)SO：過濾得到的原酒需補(bǔ)加SO，SO添加量為30 mg/L；10）后發(fā)酵：發(fā)酵罐密封處理進(jìn)行無氧發(fā)酵，20 ℃條件下后發(fā)酵20 d；11）澄清：添加3%羧甲基纖維素，并靜置72 h；12）殺菌：將發(fā)酵酒轉(zhuǎn)移至密閉容器中，緩慢加熱至67 ℃，加熱時(shí)間為15 min。

1.3.3 理化指標(biāo)及活性成分測(cè)定

取樣：藍(lán)靛果鮮果記為第0天，各藍(lán)靛果醪記為第1天；藍(lán)靛果酒發(fā)酵周期為31 d，主發(fā)酵期間各成分變化差異較大，后發(fā)酵期間各成分變化差異較小，因此后發(fā)酵取樣時(shí)間適當(dāng)延長，設(shè)定檢測(cè)時(shí)間分別為第1、3、5、7、9、11、13、15、19、23、27、31天。

乙醇體積分?jǐn)?shù)測(cè)定參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；采用pH值示差法測(cè)定藍(lán)靛果酒中花青素含量；采用福林-酚法測(cè)定藍(lán)靛果酒中總酚含量，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程=13.75＋0.045，=0.999 0，為沒食子酸質(zhì)量濃度（mg/L），為760 nm波長處吸光度；采用硝酸鋁法測(cè)定藍(lán)靛果酒中黃酮含量，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程=0.023 6＋0.005，=0.999 6，為蘆丁質(zhì)量濃度（mg/L），為510 nm波長處吸光度。

1.3.4 體外抗氧化活性測(cè)定

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參照Rawat等方法并略以修改。稱取0.168 4 g DPPH并溶于無水乙醇中，配制0.1 mmol/L的DPPH溶液。取1 mL果酒稀釋液（量取1 mL酒液加入100 mL容量瓶中，加水定容，下同）加入試管中，再加入1 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液，振蕩搖勻并避光放置30 min。取待測(cè)樣于517 nm波長處測(cè)定吸光度，以Trolox建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為=0.707 2＋0.008 1，=0.997 7。將吸光度帶入回歸方程得到DPPH自由基清除能力，結(jié)果以Trolox當(dāng)量表示，單位為mmol/L。

1.3.4.2 羥自由基清除能力測(cè)定

參照朱璐等方法并略以修改。取1 mL果酒稀釋液加入試管中，依次向試管中加入1 mL 10.0 mmol/L FeSO、1 mL 10.0 mmol/L水楊酸乙醇溶液以及1 mL 8.8 mmol/L過氧化氫溶液，振蕩搖勻，在37 ℃水浴中反應(yīng)30 min。待冷卻后在510 nm波長處測(cè)定吸光度。以Trolox建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為=0.000 2＋1.085 2，=0.994 6，將吸光度帶入回歸方程得到羥自由基清除能力，結(jié)果以Trolox當(dāng)量表示，單位為mmol/L。

1.3.4.3 超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定

參照李斌等方法并略以修改。取1 mL果酒稀釋液加入試管中，依次加入4.5 mL Tris-HCl緩沖液和4 mL鄰苯三酚溶液。常溫下反應(yīng)5 min后，加入1 mL 12 mol/L HCl溶液結(jié)束反應(yīng)，并在320 nm波長處測(cè)定吸光度。以Trolox建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為=0.000 47＋3.151 4，=0.991 2。將吸光度帶入回歸方程得到超氧陰離子自由基清除能力，結(jié)果以Trolox當(dāng)量表示，單位為mmol/L。

1.3.5 香氣成分分析

1.3.5.1 樣品處理

移取100 mL果酒于250 mL配有聚四氟乙烯膠墊的帶蓋樣品瓶中，加入2 g氯化鈉，在60 ℃平衡15 min，將固相微萃手柄針頭插入密封樣品瓶中，推出萃取纖維頭頂空萃取40 min，推回萃取頭，拔出針頭后迅速插入氣相色譜進(jìn)樣口中，250 ℃解吸3 min。在取樣前，應(yīng)將萃取頭置于氣相色譜進(jìn)樣口中250 ℃活化5 min。

1.3.5.2 氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定條件

氣相色譜條件：色譜柱：Agilent DB-5色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；載氣：高純氦氣，流速：1.0 mL/min。程序升溫：初始溫度為100 ℃，保持5 min，以5 ℃/min速率升至250 ℃，保持5 min。總測(cè)定時(shí)間：40 min。

質(zhì)譜條件：電子電離源，電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；掃描模式為Scan模式，質(zhì)量掃描范圍50～500 u。

采用NIST02質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索定性分析，單個(gè)化合物的相對(duì)含量采用峰面積歸一化法計(jì)算的百分比表示。

1.3.5.3 關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)評(píng)價(jià)

參照嚴(yán)超等的方法，對(duì)樣品中關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)采用相對(duì)氣味活度值（relative odor acivity value，ROAV）法進(jìn)行分析。首先采用OAV法確定出樣品中貢獻(xiàn)率最大的揮發(fā)性成分，如式（1）所示：

式中：為揮發(fā)性物質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/L）；為該揮發(fā)性物質(zhì)的感覺閾值/（mg/L）。

根據(jù)式（1）所求結(jié)果，規(guī)定對(duì)樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)率最大的揮發(fā)性物質(zhì)其ROAV為100，其他物質(zhì)ROAV則根據(jù)式（2）進(jìn)行計(jì)算：

式中：C與T分別表示不同揮發(fā)性成分質(zhì)量濃度/（mg/L）與感覺閾值/（mg/L）；與分別表示貢獻(xiàn)率的最大揮發(fā)性成分質(zhì)量濃度/（mg/L）與感覺閾值/（mg/L）。

當(dāng)ROAV≥1時(shí)，說明該物質(zhì)可對(duì)總體風(fēng)味有直接影響，為關(guān)鍵化合物；當(dāng)0.1≤ROAV＜1時(shí)，說明該物質(zhì)可對(duì)總體風(fēng)味有修飾作用，為修飾化合物；當(dāng)ROAV＜0.1時(shí)，說明該物質(zhì)對(duì)總體風(fēng)味無顯著影響，為潛在化合物。

1.3.6 感官評(píng)定

參照GB/T 15038—2006，在標(biāo)準(zhǔn)品嘗室進(jìn)行品嘗，選擇10 名經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)并有經(jīng)驗(yàn)的感官評(píng)價(jià)人員對(duì)3 種不同工藝發(fā)酵的藍(lán)靛果酒分別從色澤、澄清度、香氣、滋味和典型性5 個(gè)方面進(jìn)行感官評(píng)價(jià)（表1），分?jǐn)?shù)從高到底表示感覺強(qiáng)烈程度逐漸降低，從優(yōu)質(zhì)藍(lán)靛果酒應(yīng)具備的特點(diǎn)到品質(zhì)較差，結(jié)果經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行分析。

表1 感官評(píng)分細(xì)則Table 1 Criteria for sensory evaluation of L.edulis wine

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)靛果酒發(fā)酵過程中乙醇體積分?jǐn)?shù)動(dòng)態(tài)變化

由圖1可知，藍(lán)靛果酒發(fā)酵期間，3 種藍(lán)靛果酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)均呈現(xiàn)先上升后趨于平穩(wěn)趨勢(shì)。發(fā)酵前期乙醇體積分?jǐn)?shù)持續(xù)升高的原因主要是果漿中存在大量的糖分，釀酒酵母代謝活動(dòng)旺盛，糖類物質(zhì)被迅速分解為乙醇和二氧化碳，隨著酵母菌呼吸作用持續(xù)，酵母可利用的糖分迅速減少后，酵母活性降低，乙醇體積分?jǐn)?shù)趨于平穩(wěn)。發(fā)酵結(jié)束后熟汁發(fā)酵酒中乙醇體積分?jǐn)?shù)最高，為（12.29±0.08）%，分別比鮮汁和去渣發(fā)酵酒乙醇體積分?jǐn)?shù)高出0.5%和2.27%，分析為經(jīng)熱處理的熟汁發(fā)酵酒中糖分更容易得到釋放，因此糖發(fā)酵得更徹底，乙醇體積分?jǐn)?shù)更高。

圖1 藍(lán)靛果酒釀造期間乙醇體積分?jǐn)?shù)動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of ethanol content during the brewing ofL.edulis wine

2.2 藍(lán)靛果酒發(fā)酵過程中活性成分動(dòng)態(tài)變化

2.2.1 藍(lán)靛果酒發(fā)酵過程中花青素含量動(dòng)態(tài)變化

由圖2可知，藍(lán)靛果酒發(fā)酵期間，3 種不同工藝發(fā)酵酒中花青素呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。在發(fā)酵第1天，3 種不同工藝發(fā)酵酒中花青素含量均達(dá)到峰值，熟汁發(fā)酵酒中花青素質(zhì)量濃度為（2.92±0.17）g/L，顯著高于鮮汁發(fā)酵與去渣發(fā)酵藍(lán)靛果酒中花青素含量（＜0.05）。在發(fā)酵3～13 d，3 種發(fā)酵酒中花青素含量均呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)。這是由于在乙醇發(fā)酵期間，-葡萄糖苷酶會(huì)水解花青素，使花青素含量逐漸降低。王行等在藍(lán)莓酒發(fā)酵的研究中發(fā)現(xiàn)，花青素含量在發(fā)酵期第1天到達(dá)峰值并隨后逐漸降低，與本研究的結(jié)果相似。

圖2 藍(lán)靛果酒釀造期間花青素含量動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of anthocyanin content in L.edulis wine during brewing

在發(fā)酵13 d后，3 種不同工藝發(fā)酵酒中花青素含量趨于穩(wěn)定。發(fā)酵結(jié)束后，鮮汁發(fā)酵與熟汁發(fā)酵酒中花青素質(zhì)量濃度為（823.75±8.89）mg/L與（830.17±8.65）mg/L，均顯著高于去渣發(fā)酵酒（417.77±11.01）mg/L（＜0.05），這表明在藍(lán)靛果酒釀制過程中，熟汁和鮮汁發(fā)酵能更好地保留花青素，分析原因?yàn)椋涸趥鹘y(tǒng)發(fā)酵過程中40%的花青素從果皮、果渣中轉(zhuǎn)移到果酒中，但細(xì)胞壁以及細(xì)胞壁膜的滲透性不足影響了花青素等活性物質(zhì)的提取，而經(jīng)熱處理的熟汁發(fā)酵酒中細(xì)胞的結(jié)構(gòu)發(fā)生了破壞，果渣中水溶性花青素和單寧以非選擇性的方式進(jìn)行釋放。因此，缺少果渣浸漬作用的去渣發(fā)酵酒中花青素含量較低，而經(jīng)熱處理的藍(lán)靛果酒花青素得到更好的釋放，這對(duì)充分汲取藍(lán)靛果活性物質(zhì)具有重要意義，也間接表明了藍(lán)靛果果渣中蘊(yùn)含了巨大的功能價(jià)值。

2.2.2 藍(lán)靛果酒發(fā)酵過程中總酚含量動(dòng)態(tài)變化

由圖3可知，在發(fā)酵過程中，3 種工藝發(fā)酵酒中總酚含量均呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，出現(xiàn)這種情況的原因可能是在發(fā)酵過程中，由于酵母在代謝活動(dòng)中產(chǎn)生了大量的次級(jí)代謝產(chǎn)物，酚類化合物與多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)結(jié)合或吸附，使果酒中總酚含量迅速下降。發(fā)酵結(jié)束后，熟汁發(fā)酵酒中總酚含量最高，質(zhì)量濃度為（2.41±0.03）g/L，略高于鮮汁與去渣發(fā)酵酒，這表明熟汁發(fā)酵有利于果酒中多酚含量的增加。

圖3 藍(lán)靛果酒釀造期間總酚含量動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of polyphenols content in L.edulis wine during brewing

研究發(fā)現(xiàn)，在100 ℃加熱30 min后，花青素?fù)p失率約為30%，因此經(jīng)短暫熱處理（100 ℃、5～8 min）的熟汁發(fā)酵酒，酚類等活性物質(zhì)有一定損失，但損失較小，而熱處理后果酒中果皮、果渣中酚類物質(zhì)得到更好的釋放，同時(shí)酒中各種氧化酶的在較高溫度下受到破壞，活性大大降低，如多酚氧化酶等，使果酒中多酚等活性物質(zhì)在發(fā)酵期間損失減少，有利于果酒中活性物質(zhì)的保留。

2.2.3 藍(lán)靛果酒發(fā)酵過程中黃酮含量動(dòng)態(tài)變化

由圖4可知，在藍(lán)靛果酒發(fā)酵期間，黃酮含量呈先緩慢上升后緩慢下降的總體趨勢(shì)。在發(fā)酵0～1 d，藍(lán)靛果經(jīng)破壁處理后黃酮含量損失較大。發(fā)酵1～7 d，在浸漬的作用下，鮮汁發(fā)酵與熟汁發(fā)酵酒中黃酮質(zhì)量濃度逐漸上升，分別從（482.50±39.50）、（538.00±14.50）mg/L升至（555.00±14.40）、（572.00±6.95）mg/L，去渣發(fā)酵酒中黃酮含量上升程度較緩。在發(fā)酵7～31 d，3 種工藝發(fā)酵酒中黃酮含量均緩慢下降并趨于穩(wěn)定，最終鮮汁發(fā)酵酒中黃酮質(zhì)量濃度最高，為（470.50±6.15）mg/L，但3 種工藝發(fā)酵酒中黃酮含量并無顯著差異，可見不同發(fā)酵工藝對(duì)于藍(lán)靛果酒中黃酮含量影響較小。與藍(lán)靛果漿相比，鮮汁發(fā)酵、熟汁發(fā)酵和去渣發(fā)酵酒中總酚保存率分別為90.31%、89.15%和88.58%，饒炎炎等研究發(fā)現(xiàn)在藍(lán)莓酒發(fā)酵過程中黃酮類化合物保存率為95%，在果酒釀制期間損失較少，與本研究結(jié)果相似。

圖4 藍(lán)靛果酒釀造期間黃酮含量動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of flavonoids content in L.edulis wine during brewing

2.3 藍(lán)靛果酒發(fā)酵過程中體外抗氧化能力動(dòng)態(tài)變化

由圖5A可知，3 種工藝發(fā)酵酒的DPPH自由基清除能力基本呈逐漸下降并趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，這是因?yàn)殡S發(fā)酵時(shí)間的延長，酒中抗氧化物質(zhì)不斷被分解，尤其是0～7 d減少較快，此后相對(duì)趨于平穩(wěn)，與總酚含量變化趨勢(shì)總體保持一致。在發(fā)酵期結(jié)束后，熟汁發(fā)酵酒表現(xiàn)出最強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，為（14.25±0.14）mmol/L，其次為鮮汁發(fā)酵酒（12.43±0.28）mmol/L、去渣發(fā)酵酒（11.37±0.14）mmol/L，這與熟汁發(fā)酵酒中含有相對(duì)較高含量的總酚有一定相關(guān)性。同時(shí)，研究表明花青素的一些熱降解產(chǎn)物也具有抗氧化能力，其活性可與商業(yè)抗氧化抗氧化劑如二丁基羥基甲苯相媲美，有助于熟汁發(fā)酵酒抗氧化能力的提高。

圖5 藍(lán)靛果酒釀造期間體外抗氧化能力動(dòng)態(tài)變化Fig.5 Dynamic changes of antioxidant capacity in vitro in L.edulis wine during brewing

由圖5B可知，在發(fā)酵過程中3 種工藝發(fā)酵酒的超氧陰離子自由基清除能力均顯著下降（＜0.05）并逐漸趨于穩(wěn)定，分析原因可能是由于單體酚和酚酸等物質(zhì)在發(fā)酵階段參與了果酒中尚未結(jié)束的發(fā)酵過程，總酚、花青素等活性成分不斷被分解，使果酒清除超氧陰離子自由基的能力下降。發(fā)酵期結(jié)束后，熟汁發(fā)酵酒呈現(xiàn)出最強(qiáng)的超氧陰離子自由基清除能力，為（8.93±1.37）mmol/L，是鮮汁發(fā)酵和去渣發(fā)酵酒的1.39 倍和1.36 倍，這是因?yàn)榻?jīng)熱處理的熟汁發(fā)酵酒中果渣、果皮中花青素、多酚等活性物質(zhì)得到更快的釋放，使熟汁發(fā)酵酒中活性物質(zhì)含量高于鮮汁和去渣發(fā)酵酒，藍(lán)靛果酒的抗氧化能力更強(qiáng)。

由圖5C可知，在發(fā)酵0～5 d，鮮汁與熟汁發(fā)酵酒的羥自由基清除能力均顯著升高（＜0.05），在發(fā)酵第5天，鮮汁發(fā)酵酒的羥自由基清除能力達(dá)到峰值，為（135.77±5.58）mmol/L，原因是浸漬作用下，果皮、果肉中活性成分進(jìn)入酒液，酒液對(duì)羥自由基清除能力升高，去渣發(fā)酵酒已將果皮、果渣進(jìn)行過濾，因此其自由基清除能力呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)。在發(fā)酵5～31 d，隨著3 種工藝發(fā)酵酒中活性物質(zhì)含量基本趨于穩(wěn)定，果酒中羥自由基清除能力緩慢下降并趨于穩(wěn)定。

在發(fā)酵期結(jié)束后，鮮汁發(fā)酵酒清除羥自由基的能力最強(qiáng)，為（40.43±3.33）mmol/L，是熟汁和去渣發(fā)酵酒的1.82 倍和1.50 倍，表明鮮汁發(fā)酵有助于果酒羥自由基清除能力的增強(qiáng)，且整個(gè)發(fā)酵過程中，3 種藍(lán)靛果酒的羥自由基清除能力變化與黃酮含量變化趨勢(shì)基本相似，說明二者具有一定的濃度-效應(yīng)計(jì)量關(guān)系，黃酮含量的增加有助于提高羥自由基的清除能力，這與吳樹坤等在山葡萄酒中研究結(jié)果相似。

2.4 藍(lán)靛果酒發(fā)酵過程中香氣成分動(dòng)態(tài)變化

香氣成分是影響藍(lán)靛果酒質(zhì)量和感官特性的關(guān)鍵因素，對(duì)消費(fèi)者的可接受性起重要作用。由圖6、表2可知，3 種工藝發(fā)酵酒中共檢測(cè)出47 種香氣成分，鮮汁發(fā)酵酒、熟汁發(fā)酵酒及去渣發(fā)酵酒各檢測(cè)出21、27、31 種香氣成分，占各自揮發(fā)性物質(zhì)總峰面積的71.57%、89.71%、84.05%。

圖6 不同工藝發(fā)酵酒氣相色譜-質(zhì)譜總離子圖Fig.6 GC-MS total ion current chromatograms of L.edulis wines produced with different processes

表2 不同工藝發(fā)酵酒中各種香氣成分的含量和風(fēng)味特征描述Table 2 Contents of various aroma substances and description offlavor characteristics in L.edulis wines produced with different processes

續(xù)表2

由圖7可知，藍(lán)靛果酒的香氣成分可分為萜烯類、酯類、酸類、醛酮類、醇類5 個(gè)類別。大多數(shù)醇、酯和酸是發(fā)酵衍生的，而萜烯、酚、醛和酮是變體。鮮汁發(fā)酵酒檢測(cè)出16 種酯類、1 種酸類和4 種醇類，相對(duì)含量分別為60.23%、1.40%和9.94%；熟汁發(fā)酵酒檢測(cè)出18 種酯類、4 種酸類、2 種醛酮類和3 種醇類，相對(duì)含量分別為85.31%、1.35%、0.36%和2.69%；去渣發(fā)酵酒檢測(cè)出5 種萜烯類、18 種酯類、3 種酸類、3 種醛酮類、2 種醇類，相對(duì)含量分別為11.50%、61.96%、4.03%、2.79%和3.77%。熟汁發(fā)酵酒中，可能是因?yàn)闊崽幚砑铀倭缩セ磻?yīng)的進(jìn)行。

圖7 不同工藝發(fā)酵酒中各類揮發(fā)性物質(zhì)的比例Fig.7 Proportion of various classes of volatile substances in L.edulis wines produced with different processes

2.4.1 3 種工藝發(fā)酵酒香氣成分比較

2.4.1.1 醇類成分

醇類物質(zhì)是酵母通過糖的分解代謝或脫羧反應(yīng)和氨基酸的脫氨基作用形成的代謝產(chǎn)物。適宜濃度的醇類物質(zhì)可以襯托酯香，促進(jìn)協(xié)調(diào)性，是果酒中重要的香氣物質(zhì)。在3 種工藝發(fā)酵酒中共檢測(cè)出5 種醇類物質(zhì)，鮮汁發(fā)酵酒、熟汁發(fā)酵酒、去渣發(fā)酵酒分別檢測(cè)出4、3 種和2 種。由圖7可知，醇類物質(zhì)在3 種工藝發(fā)酵酒中含量差異明顯，鮮汁發(fā)酵酒醇類物質(zhì)相對(duì)含量最高，為9.94%，有利于醇類物質(zhì)的保留，這是由于果渣中底物種類的多樣性，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了更多的醇類物質(zhì)；而熱處理加速了酯化反應(yīng)以及缺少果渣使熟汁與去渣發(fā)酵酒醇類物質(zhì)相對(duì)含量較低，僅有2.69%與3.77%。鮮汁發(fā)酵酒中醇類物質(zhì)主要為苯乙醇和1-戊醇，相對(duì)含量為7.35%、2.39%，為鮮汁發(fā)酵酒增添了玫瑰香氣與溫和的特殊香氣；其次，鮮汁發(fā)酵酒中存在的香茅醇含量較低，但由于具有其低閾值的特點(diǎn)，極少量便可產(chǎn)生明顯的玫瑰香氣。熟汁發(fā)酵與去渣發(fā)酵酒中醇類物質(zhì)主要為苯乙醇，相對(duì)含量分別為2.00%與2.74%，是兩種工藝發(fā)酵酒的關(guān)鍵化合物，為酒液提供淡雅細(xì)膩的玫瑰香氣。

2.4.1.2 酯類成分

大多數(shù)發(fā)酵衍生的化合物是酯和醇類物質(zhì)，由圖7可知，酯類物質(zhì)在3 種工藝發(fā)酵酒的揮發(fā)性物質(zhì)中占比最高，是構(gòu)成藍(lán)靛果酒特殊香氣的最重要成分，對(duì)藍(lán)靛果酒的香氣特征具有重要影響。鮮汁發(fā)酵的藍(lán)靛果酒共檢出16 種酯類香氣成分，相對(duì)總含量為60.23%，棕櫚酸乙酯和油酸乙酯含量較高，分別為17.79%與10.49%，此外還檢測(cè)出0.21%的乙酸乙酯（水果香氣），在其他兩種工藝發(fā)酵酒中并未檢出，是鮮汁發(fā)酵藍(lán)靛果酒獨(dú)有的香氣成分。

熟汁發(fā)酵酒共檢出18 種酯類香氣成分，相對(duì)含量為85.31%，棕櫚酸乙酯、月桂酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯等關(guān)鍵化合物的相對(duì)含量均高于鮮汁與去渣發(fā)酵酒；熟汁發(fā)酵酒中存在特有的己酸異戊酯和月桂酸異戊酯，賦予酒體濃郁的香蕉、菠蘿等水果香氣和油脂香氣，結(jié)合熟汁發(fā)酵酒中較低含量的醇類及酸類物質(zhì)可知，熟汁發(fā)酵可促進(jìn)酯化反應(yīng)的進(jìn)行，從而在一定程度上提高果酒中酯類物質(zhì)的種類及含量，賦予藍(lán)靛果酒更加濃郁的果香。

去渣發(fā)酵的藍(lán)靛果酒共檢測(cè)出18 種酯類香氣成分，相對(duì)含量為61.96%，癸酸乙酯相對(duì)含量達(dá)到18.00%，能提供椰子型香氣，其次還檢測(cè)到具有玫瑰和蜂蜜花香香氣的乙酸苯乙酯，是去渣發(fā)酵酒所特有的香氣成分。

2.4.1.3 醛酮類和萜烯類成分

由表2可知，萜烯類化合物未在鮮汁和熟汁發(fā)酵酒中檢測(cè)出；醛酮類化合物未在鮮汁發(fā)酵酒中檢測(cè)出。熟汁發(fā)酵酒中檢測(cè)出苯丙酮和反式-2-癸烯醛，相對(duì)含量分別為0.20%和0.16%，苯丙酮可提供強(qiáng)烈持久的特殊香氣。去渣發(fā)酵酒中檢出醛酮類化合物3 種、萜烯類化合物5 種，包括相對(duì)含量較高的-檸檬烯和-蒎烯等，對(duì)果酒整體香氣影響較大，賦予了去渣發(fā)酵酒特殊的檸檬和松香氣味。

2.4.2 不同發(fā)酵工藝藍(lán)靛果酒關(guān)鍵化合物的比較

由表3可知，不同發(fā)酵工藝對(duì)藍(lán)靛果酒的關(guān)鍵化合物有較大影響，主要體現(xiàn)在關(guān)鍵化合物（ROAV≥1）的差異，修飾化合物和潛在化合物的ROAV較小，但在評(píng)價(jià)不同藍(lán)靛果酒的香氣時(shí)可與其他物質(zhì)相互作用，獲得特殊的香氣。癸酸乙酯為藍(lán)靛果酒賦予獨(dú)特的水果香、花香，對(duì)藍(lán)靛果酒的主體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大，因此定義3 種工藝發(fā)酵酒的癸酸乙酯ROAV=100。鮮汁發(fā)酵酒中關(guān)鍵化合物共有11 種，分別為辛酸乙酯、癸酸乙酯、棕櫚酸乙酯、琥珀酸二乙酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯、1-戊醇、香茅醇及苯乙醇，賦予了鮮汁發(fā)酵酒更多玫瑰與水果香氣。熟汁發(fā)酵酒中關(guān)鍵化合物共有9 種，分別為癸酸乙酯、棕櫚酸乙酯、琥珀酸二乙酯、月桂酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、十一酸乙酯及苯乙醇，油酸乙酯具有較大的ROAV，為熟汁發(fā)酵酒賦予了更多的花果香氣。去渣發(fā)酵酒中關(guān)鍵化合物共有14 種，分別為辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、棕櫚酸乙酯、琥珀酸二乙酯、月桂酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯、苯乙醇、苯甲酸、-檸檬烯、右旋萜二烯及-蒎烯，萜烯類物質(zhì)含量豐富，如-檸檬烯具有橙子及檸檬樣香氣，-蒎烯具有特殊的松香氣味。

表3 不同工藝發(fā)酵酒中揮發(fā)性物質(zhì)的ROAVTable 3 ROAV of volatile substances in L.edulis wines produced with different processes

2.5 主成分分析（principal component analysis，PCA）

對(duì)3 種不同工藝發(fā)酵酒的香氣成分進(jìn)行PCA，以發(fā)酵酒種類為變量，得到PCA散點(diǎn)圖。以特征值大于1為依據(jù)，共提取了2 個(gè)PC，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到89.46%，表明這2 個(gè)變量包含了主體的變量信息。從圖8可以看出，熟汁發(fā)酵酒主要分布在PC2的負(fù)半軸，鮮汁發(fā)酵酒主要分布在PC1的正半軸，去渣發(fā)酵酒主要分布在PC2的正半軸，3 種不同工藝發(fā)酵酒在PCA圖中得到了較好的區(qū)分。PCA散點(diǎn)圖清晰地展示出發(fā)酵工藝不同時(shí)，藍(lán)靛果酒PC存在顯著差異。綜合表2和圖8進(jìn)行分析，3 種不同工藝發(fā)酵酒的香氣成分，從種類及相對(duì)含量上說彼此之間存在較大差異，而從單一的香氣成分來說可以分為2 個(gè)類型，每種類型間存在差異較大。因此，可以根據(jù)所需要的藍(lán)靛果酒產(chǎn)品特點(diǎn)選擇不同的加工工藝。

圖8 不同工藝發(fā)酵酒香氣的PCA散點(diǎn)圖Fig.8 PCA scatter plot of aroma components in L.edulis wines produced with different processes

2.6 感官評(píng)價(jià)結(jié)果

如表4所示，3 種藍(lán)靛果酒均符合優(yōu)質(zhì)果酒的要求，酒體澄清透明，具有純正的果香和酒香，酒體協(xié)調(diào)，具有藍(lán)靛果的典型性。就外觀而言，3 種果酒的色澤和澄清度無明顯差異，但熟汁發(fā)酵酒顏色較暗；香氣方面，熟汁發(fā)酵酒的香氣更為濃郁；與鮮汁和熟汁發(fā)酵酒相比，去渣發(fā)酵酒的滋味得分較低，典型性也不如熟汁發(fā)酵酒。綜合評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，鮮汁和熟汁發(fā)酵酒感官品質(zhì)均較好，但經(jīng)熱處理后的熟汁發(fā)酵酒中蛋白質(zhì)絮凝下沉，酒體更加澄清且更加豐富的酯類物質(zhì)使熟汁發(fā)酵酒的香氣濃郁度更高，品質(zhì)更佳。

表4 3 種藍(lán)靛果酒感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 4 Sensory evaluation results of L.edulis wines produced with different processes

3 結(jié)論

采用3 種不同工藝制作藍(lán)靛果酒，并在乙醇體積分?jǐn)?shù)、活性成分含量、體外抗氧化活性、香氣成分等方面進(jìn)行了比較分析。在3 種不同工藝發(fā)酵酒的發(fā)酵過程中，乙醇體積分?jǐn)?shù)均呈現(xiàn)先迅速上升后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，發(fā)酵結(jié)束后鮮汁、熟汁與去渣發(fā)酵酒乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為11.80%、12.29%與10.02%。鮮汁與熟汁發(fā)酵酒的花青素及總酚活性成分保存率明顯高于去渣發(fā)酵酒，3 種工藝發(fā)酵酒的黃酮保存率相似。

在發(fā)酵過程中，由于-葡萄糖苷酶的分解作用和酵母產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物的結(jié)合作用，酒液的DPPH自由基和超氧陰離子自由基清除能力隨著花青素、黃酮等活性物質(zhì)含量的減少而不斷下降。不同的是，鮮汁與熟汁發(fā)酵酒的羥自由基清除能力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，而去渣發(fā)酵酒則呈緩慢下降趨勢(shì)，與酒液中花青素含量變化趨勢(shì)較為相似，說明酒液中的羥自由基清除能力受花青素含量的影響較大。

發(fā)酵結(jié)束后鮮汁發(fā)酵酒對(duì)羥自由基清除能力最強(qiáng)，為（40.43±3.33）mmol/L，而熟汁發(fā)酵酒液的DPPH自由基和超氧陰離子自由基清除能力最強(qiáng)，分別為（14.25±0.14）mmol/L和（8.93±1.37）mmol/L。

通過對(duì)3 種工藝發(fā)酵酒的香氣成分分析和比較，熟汁發(fā)酵酒香氣成分主要為酯類（85.31%），酯類物質(zhì)多數(shù)呈現(xiàn)成熟果香使得熟汁發(fā)酵酒香氣更加濃郁，香氣類別雖較為單一，但典型風(fēng)格最突出，更容易區(qū)分；鮮汁發(fā)酵酒的主要成分為酯類（60.23%）和醇類（9.94%）；去渣發(fā)酵酒主要成分為酯類（61.96%）和萜烯類（11.50%），醇類及萜烯類物質(zhì)使得果酒香氣在感官上更為均衡，但整體香氣類別較為復(fù)雜并不突出。與鮮汁、去渣發(fā)酵相比，熟汁發(fā)酵工藝制作的藍(lán)靛果酒活性成分損失較小，體外抗氧化活性較強(qiáng)，含有較高的酯類化合物，且果酒香氣成分豐富，感官評(píng)價(jià)最佳，有利于藍(lán)靛果酒綜合品質(zhì)的提高。