田文慧,孫麗平,張 翠,胡淑敏,莊永亮,,尹 花,
(1.啤酒生物發(fā)酵工程國家重點實驗室,山東 青島 266021;2.昆明理工大學食品科學與工程學院,云南 昆明 650500)
二肽基肽酶-IV(dipeptidyl peptidase-IV,DPP-IV)是一種細胞表面的絲氨酸蛋白酶,其主要作用是優(yōu)先將氨基末端第2個氨基酸為丙氨酸(Ala)或脯氨酸(Pro)的寡肽的氨基末端前2 個氨基酸殘基剪切去除。DPP-IV可分解腸道細胞分泌的胰高血糖素樣肽-1(glucagonlike peptide-1,GLP-1),而GLP-1可以通過刺激胰島素、抑制升糖素以及讓胰島素細胞重生等方式降低血糖。因此,DPP-IV抑制劑可以使DPP-IV失活,從而提高GLP-1,預防糖尿病的發(fā)生。研究表明,生物活性肽具有生理活性好、功能廣泛、安全性高等特點,目前,尋找DPP-IV抑制活性肽逐漸成為熱點研究。
常規(guī)的生物活性肽篩選方法主要是通過超濾、陰陽離子層析、凝膠柱層析及高效液相色譜等分離手段,結(jié)合體內(nèi)外活性評價進行肽段的確定。隨著科學技術(shù)的發(fā)展,結(jié)合計算機輔助設(shè)計,通過在線數(shù)據(jù)及虛擬篩選手段研究肽的活性,可以減少工作強度、降低人工成本和縮短研發(fā)周期,同時提高活性肽的鑒定成功率。Zhao Wenzhu等通過虛擬篩選,在線預測了多肽的潛在活性、溶解性、吸收、代謝、毒性等,從雞蛋蛋白中鑒定出3 條新的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶和DPP-IV抑制肽ADF、MIR和FGR。
目前,生物活性肽的來源比較廣泛,有乳制品、谷類、蛋、魚、肉、藻類等。在釀造酒中,活性肽的研究主要集中在紅酒、黃酒和白酒,對啤酒中肽的研究較少。啤酒是經(jīng)典的發(fā)酵食品,釀酒原料中的蛋白質(zhì)可被降解為肽并轉(zhuǎn)移至啤酒終產(chǎn)品中。同時,發(fā)酵過程中微生物的胞外分泌、發(fā)酵結(jié)束后微生物細胞的自溶等也可能向啤酒終產(chǎn)品中引入肽類。白啤是經(jīng)典啤酒的一種,白啤酒中的“白”指的是酒體未經(jīng)過濾、不澄清、呈白色。因大麥芽和小麥芽比例、釀造工藝和酵母菌株不同,白啤酒具有獨特的風格,營養(yǎng)豐富,口感愉悅,因此,本實驗以白啤為研究對象,采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜及軟件鑒定其肽段,對潛在生物活性肽進行篩選,并對其進行吸收、代謝、毒性及分子對接進行預測,定向解析出具有潛在DPP-IV抑制活性的肽段。以期為啤酒產(chǎn)業(yè)的綜合性發(fā)展提供理論支持和數(shù)據(jù)參考。
青島白啤,產(chǎn)品批號0532342949,500 mL,乙醇體積分數(shù)4.1%,以下簡稱白??;合成的肽段(純度98%)由南京杰肽生物科技有限公司提供;DPP-IV活性檢測試劑盒 美國開曼(密歇根州安娜堡)化學公司;乙酸乙酯(分析純) 天津市風船化學試劑科技有限公司;乙腈、甲酸(均為質(zhì)譜級) 德國Merck公司。
超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀美國Thermo Fisher Scientific公司。
1.3.1 樣品前處理
白啤樣品過濾除氣,量取300 mL,在50 ℃條件下濃縮至50 mL,濃縮液用乙酸乙酯等體積萃取3 次,將萃取后的水樣用于肽段分析。
1.3.2 肽段分析條件
色譜條件:色譜柱:Infinitylab Poroshell 120 EC-C(2.1 mm×100 mm,1.9 μm),柱溫30 ℃;流動相:A為乙腈(0.1 %甲酸),B為超純水(0.1 %甲酸);進樣量2 μL;流速0.2 mL/min;梯度洗脫:0~1 min,5% A、95% B;1~2.5 min,5%~10% A、95%~90% B;2.5~12.5 min,10%~25% A、90%~75% B;12.5~20 min,25%~52.5% A、75%~47.5% B;20~22 mi n,52.5%~95% A、47.5%~5% B;22~24 min,95%~5% A、5%~95% B;24~30 min,5% A、95% B。
質(zhì)譜條件:采用電噴霧正離子源,噴霧電壓3.2 kV,數(shù)據(jù)采集范圍/200~2 000,質(zhì)譜數(shù)據(jù)掃描模式為Full MS-dd MS,一級和二級質(zhì)譜的分辨率分別為35 000和17 500。
肽段的分子質(zhì)量及氨基酸序列利用和Peaks 7.5軟件進行解析,篩選出置信度(average local confidence,ALC)大于85%的肽段。
1.3.3 白啤活性肽的初選
1.3.3.1 生物活性預測
使用Peptide Ranker程序(http://bioware.ucd.ie/-compass/biowareweb/Serverpages/Peptide-ranker.php)對已鑒定肽段進行生物活性可能性分析,選擇生物活性評分≥0.5的肽段作為潛在的生物活性肽。應用BIOPEP程序(http://www.uwm.edu.pl/Biochemia/biopep/start_biopep.php)中的“profiles of potential biological activity”功能進行數(shù)據(jù)庫搜索,定義活性肽的潛在生物活性及可能存在的活性位點氨基酸序列。
1.3.3.2 活性肽的性質(zhì)分析
通過PepSMI(https://www.novoprolabs.com/tools/convert-peptide-to-smiles-string)將肽段氨基酸序列轉(zhuǎn)化為簡化分子線性輸入規(guī)范(simplified molecular input line entry system,SMILES)格式,使用admetSAR(http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar1/predict/)預測肽段的吸收、代謝和毒性等性質(zhì)。本研究主要評價指標為血腦屏障透過(blood-brain barrier penetration,BBB)、人體腸道吸收(human intestinal absorption,HIA)、細胞色素(cytochrome P450,CYP450)綜合抑制率和急性口服毒性。
1.3.4 分子對接
1.3.4.1 肽段結(jié)構(gòu)準備
選取Peptide Ranker評價≥0.5且性質(zhì)分析良好的肽段進行分子對接。利用SYBYL-X 2.1.1軟件中Build Protein功能構(gòu)建肽段的結(jié)構(gòu),并對其進行優(yōu)化,設(shè)置參數(shù)Max Iterations 5 000和Gradient 0.005,確保肽結(jié)構(gòu)的能量最小化。
1.3.4.2 DPP-IV結(jié)構(gòu)準備
DPP-IV(PDB ID:5J3J)的晶體結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中下載(http://www.rcsb.org/pdb)。利用SYBYL-X 2.1.1軟件中Surflex-Dock對DPP-IV進行結(jié)構(gòu)處理,把原受-配復合物晶體結(jié)構(gòu)中的配體分子從受體的口袋中分離,除去水分子和其他小分子,加氫、加電荷。根據(jù)已有文獻報道,選擇DPP-IV活性位點的6 個氨基酸殘基Arg125、Glu205、Arg358、Tyr547、Ser630、Tyr662生成口袋。
1.3.4.3 分子對接方法及評價
應用SYBYL中的Surflex-dock模塊對肽段與DPP-IV進行柔性對接。根據(jù)分子對接的步驟設(shè)定相關(guān)參數(shù),采用了一致性打分函數(shù)Concensus Score(C-Score)評價對接結(jié)果一致性,C-Score>4.0表示對接成立;以總得分Total-Score(T-Score)、氫鍵個數(shù)和氫鍵距離為評判標準,T-Score越高,氫鍵個數(shù)越多,鍵長越短表明結(jié)合能力越強?;谠u判標準篩選出最佳結(jié)合構(gòu)象,對獲得的最佳結(jié)合構(gòu)象進行進一步探討,分析和預測肽段與DPP-IV的相互作用情況。
1.3.5 體外DPP-IV抑制活性驗證
采用試劑盒(熒光法)對DPP-IV抑制率進行測定。樣品孔依次加入10 μL DPP-IV、10 μL樣品溶液、30 μL緩沖液,對照孔加入10 μL DPP-IV、40 μL緩沖液,空白孔加入50 μL緩沖液,最后加入50 μL底物啟動反應。37 ℃檢測熒光值(激發(fā)波長360 nm,發(fā)射波長465 nm),記錄30 min內(nèi)的結(jié)果,按下式計算DPP-IV抑制率:
式中:為對照孔熒光值減去空白孔熒光值的熒光曲線斜率;為樣品孔熒光值減去空白孔熒光值的熒光曲線斜率;為稀釋倍數(shù)。
啤酒在釀造發(fā)酵過程中產(chǎn)生了多種化學變化,肽段形成比較復雜,基于蛋白質(zhì)庫的搜索方法可能會忽略一些新肽鏈的形成,因此,采用Peaks軟件中從頭測序方法,直接利用質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行肽鏈的鑒定,結(jié)果如表1所示。白啤中共篩選出68 條ALC≥85%的肽段。肽段的長度為4~14 個氨基酸,分子質(zhì)量在400~1 700 Da之間,符合生物活性肽的結(jié)構(gòu)特點。先前研究認為,啤酒中的肽類物質(zhì)主要來源于谷蛋白,谷蛋白是一類儲存蛋白質(zhì),含有大量的谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)和Pro。在白啤鑒定出的肽段中,有25 條含有Gln、27 條含有Glu、22 條含有Pro。此外,白啤中一些肽段具有連續(xù)的Gln、Glu或Pro序列,如LAVMQQQQQQ、LPQQQAQFK、PPVPHDTD、EELR、TLLSNEEK等。這些肽鏈的結(jié)構(gòu)特點符合來源于谷蛋白的特征。另外,利用BIOPEP分析鑒定出的肽段,68 條肽段均未有相應報道。
表1 白啤中鑒定的肽段及其生物活性預測評分Table 1 Peptide Ranker scores of major peptides identifeid in white beer
續(xù)表1
2.2.1 Peptide Ranker篩選
Peptide Ranker是通過內(nèi)置到1神經(jīng)網(wǎng)絡對肽段進行評分,該算法基于不同生物活性肽功能類別共有的一般特征預測肽段的生物活性,能夠?qū)π滦蜕锘钚噪倪M行有效篩選。本研究設(shè)置活性評價閾值為0.5,篩選得到4 條肽段(表2),分別是SSLW、VPFPHTP、PMAPLPRGSP、LLLP。運用BIOPEP中“profiles of potential biological activity”功能預測4 條肽段的潛在生物活性及活性位點氨基酸序列,結(jié)果見表2。通過BIOPEP的生物活性預測可以看出,篩選的4 條肽段存在潛在的DPP-IV抑制活性。
表2 肽段DPP-IV抑制活性預測及活性位點氨基酸序列分析Table 2 Amino acid sequence analysis of active sites in DPP-IV inhibitory peptides
2.2.2 氨基酸活性位點篩選
DPP-IV是一種多功能的蛋白水解酶,首先選擇結(jié)構(gòu)上在N端2位具有Pro或Ala殘基的底物,從此類肽段的N末端切割二肽(Xaa-Pro-或Xaa-Ala-),將其轉(zhuǎn)化為無活性甚至拮抗的形式。因此,報道的DPP-IV抑制肽大多數(shù)結(jié)構(gòu)中具有Pro和Ala,尤其是N端的第2個氨基酸為Pro或Ala,這類結(jié)構(gòu)的多肽具有較強的DPP-IV抑制活性。根據(jù)文獻對于已有DPP-IV抑制肽結(jié)構(gòu)特征的報道,Peptide Ranker評分較低的肽段中仍有一些符合DPP-IV抑制肽結(jié)構(gòu)規(guī)律的肽段。因此,本研究根據(jù)氨基酸活性位點對白啤鑒定出的多肽進行篩選,DPP-IV抑制可能性較高的肽段有13 條,如表3所示。
表3 白啤DPP-IV抑制可能性較高肽段Table 3 Possible DPP-IV inhibitory peptides in white beer
采用admetSAR數(shù)據(jù)庫對篩選肽段的吸收、代謝、毒性進行預測,如表4所示。血腦屏障是指腦毛細血管壁與神經(jīng)膠質(zhì)細胞組成的血漿與腦細胞之間的屏障和脈絡叢組成的血漿和腦脊液之間的屏障,與體內(nèi)其他膜屏障相比,血腦屏障通過形成通透屏障而嚴格地限制化合物的滲透,許多化合物和靶向藥物由于無法在腦組織中達到足夠的濃度而不能產(chǎn)生期望的治療作用。預測結(jié)果顯示,白啤篩選出的肽段中13 條能通過血腦屏障??诜》肿踊钚噪闹饕ㄟ^胃腸吸收,活性肽的HIA性質(zhì)有助于預測其通過小腸的吸收概率,文獻表明人體小腸吸收率小于等于30%時,HIA數(shù)值為負值,反之為正值。結(jié)果表明,篩選的17 條肽段中有6 條在人體小腸可被吸收。代謝預測指標選擇CYP450綜合抑制率,CYP450是一個能夠催化氧化底物中反應惰性化學鍵的單加氧酶家族,主要存在于肝臟微粒體中,同時也少量分布于小腸、肺、腎、腦中,其主要生物學功能是參與內(nèi)源物質(zhì)的生物合成和代謝及外源物質(zhì)的生物氧化和降解,是代謝過程中的關(guān)鍵酶。預測結(jié)果顯示,17 條肽段的CYP450綜合抑制率均為負數(shù),表明肽段能提高CYP450酶系的活性,加快肽段在體內(nèi)的代謝速度。毒性預測指標選擇急性口服毒性,結(jié)果表明,17 條肽段的急性口服毒性均為三級毒性(LD為500~5 000 mg/kg),毒性較低。因此,綜合肽段的性質(zhì)分析,篩選出SSLW、VPFPHTP、LAKLQR、HAQQQVPVEVMR、FPQQRAELA、PPVPHDTD 6 條肽段進行下一步分析。
表4 白啤中肽段的性質(zhì)分析Table 4 Absorption,metabolism and toxicity characteristics of peptides from white beer
分子對接是研究分子間相互作用,并預測其結(jié)合模式和結(jié)合力的常用方法。為了進一步篩選具有較高抑制DPP-IV活性的肽段,采用分子對接軟件SYBYL-X 2.1.1進行對接模擬,評價篩選的6 條肽段與DPP-IV的結(jié)合能力(表5)。結(jié)果表明,篩選的6 條肽段中有4 條與DPPIV結(jié)合能力較好,肽段HAQQQVPVEVMR和PPVPHDTD的T-Score小于6,表明其與DPP-IV的結(jié)合能力較弱。其中VPFPHTP與LAKLQR的T-Score較高,因此,選擇該2 條肽段進行進一步分析。
表5 白啤中肽段的分子對接得分Table 5 Molecular docking scores of peptides from white beer
分子對接構(gòu)象分析是直觀確認肽段抑制酶活機理的主要方法之一。圖1~3分別為VPFPHTP、LAKLQR的二級質(zhì)譜圖以及其與DPP-IV對接的最佳構(gòu)象圖。圖2A和圖3A中紅色代表正電荷,紫色代表負電荷,肽段被活性口袋緊緊包裹在蛋白質(zhì)內(nèi)部,表明兩者結(jié)合穩(wěn)定。
圖1 篩選肽段的二級質(zhì)譜圖Fig.1 Secondary mass spectra of selected peptides
圖2 VPFPHTP與DPP-IV(PDB:5J3J)結(jié)合的最佳構(gòu)象Fig.2 Optimal conformation for the interaction of VPFPHTP with DPP-IV (PDBI:5J3J)
圖3 LAKLQR與DPP-IV(PDBI:5J3J)結(jié)合的最佳構(gòu)象Fig.3 Optimal conformation for the interaction of LAKLQR with DPP-IV (PDB:5J3J)
如表6所示,與DPP-IV的結(jié)合中,VPFPHTP可與Asn710、Tyr256、Asp663、Arg669、Tyr631、Gly632、Val546形成9 條氫鍵,存在12 種疏水作用;LAKLQR與Tyr631、Trp659、His740、Asn710、Asp709形成7 條氫鍵,存在13 種疏水作用。從氫鍵的數(shù)量和鍵長以及疏水作用的結(jié)果可以看出,兩條肽段與DPP-IV相互作用明顯,可有效抑制兩種酶的活性。
表6 活性肽與蛋白酶作用方式Table 6 Action modes of active peptides and protease
對篩選出的2 條肽段VPFPHTP和LAKLQR進行體外抑制DPP-IV活性評價。VPFPHTP和LAKLQR對DPP-IV有明顯抑制活性,其IC值分別為(63.68±3.03)μmol/L和(686.91±12.01)μmol/L,該結(jié)果證實本研究建立的篩選生物活性肽的方法較為可靠。肽段VPFPHTP的抑制能力較好,活性強于已報道的肽段IPIPATKT和TKLPVAF,稍弱于LPVPQ和ELHQEEPL。從篩選過程看,VPFPHTP來源于Peptide Ranker篩選,LAKLQR來源氨基酸活性位點篩選,因此在活性肽的初選過程中需要兩種方法的結(jié)合。不過,從分子對接中發(fā)現(xiàn),VPFPHTP的T-Score低于LAKLQR,因此,在分子對接的分析過程中還需要考慮更多影響因素,方法需進一步完善。
建立一種從白啤中快速篩選生物活性肽的方法。利用本方法自白啤中鑒定得到68 條肽段,使用Peptide Ranker程序篩選出4 條具有潛在生物活性的肽段,又通過文獻報道的氨基酸活性位點篩選出13 條肽段。通過肽段性質(zhì)和分子對接評價最終篩選出2 條具有潛在的高DPP-IV抑制作用的肽段,利用分子對接模型理論探析了2 條肽段對DPP-IV抑制作用機理,并對篩選的肽段進行體外活性驗證。本實驗研究了啤酒中存在的生物活性肽,并解析了其活性作用機理,為啤酒產(chǎn)品的營養(yǎng)成分研發(fā)以及精深加工提供了理論支持。