傅寶尚，侯紅漫，張公亮，畢景然

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034）

刺參（），屬棘皮動(dòng)物門（Echinodermata），游走亞門（Eleutherozoa），海參綱（Holothuroidea），木盾手目（Aspidochlrota），刺參科（Stichopodidae），仿刺參屬。刺參屬于溫帶參種，是國(guó)內(nèi)典型的海珍產(chǎn)品，產(chǎn)量大、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，主要分布在北太平洋的淺海區(qū)域。2020年，我國(guó)刺參養(yǎng)殖產(chǎn)量高達(dá)17.17萬(wàn) t。

體壁是刺參主要可食用部分，由上皮組織、真皮結(jié)締組織以及大量細(xì)小的鈣質(zhì)骨片組成。研究發(fā)現(xiàn)，刺參體壁在熱加工過(guò)程中，存在著動(dòng)態(tài)機(jī)械特性變化，其硬度和彈性等物理特性變化有著明顯的溫度-時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。低溫加熱時(shí)，刺參隨著加熱溫度的升高或時(shí)間的延長(zhǎng)，硬度繼續(xù)降低，彈性持續(xù)上升；在高溫加熱時(shí)，刺參組織坍塌，最終變得軟爛，降解，融化，失去原有形態(tài)。

刺參體壁中蛋白質(zhì)（多肽）含量豐富，約占干刺參體壁質(zhì)量的90%，其中70%以上為膠原蛋白。刺參體壁膠原蛋白屬于I型膠原蛋白，分子質(zhì)量一般約為300 kDa左右，是由2 條相同的(I)肽鏈和一條(I)肽鏈以氫鍵結(jié)合，互相纏繞形成的右手三股螺旋結(jié)構(gòu)，即[(I)](I)。膠原蛋白分子的熱變性溫度（）決定了其熱穩(wěn)定性，且膠原蛋白具有“可逆”或“不可逆”變性的雙重特征。“可逆”變性主要表現(xiàn)為，膠原蛋白分子在低強(qiáng)度加熱條件下，二級(jí)結(jié)構(gòu)雖發(fā)生變化，但在冷卻后又可復(fù)性成天然三螺旋結(jié)構(gòu)，互相交聯(lián)成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。而“不可逆”變性指膠原蛋白分子多肽鏈在高強(qiáng)度的加熱條件下直接降解，生成明膠，溶解度增大，從而失去原有形態(tài)。由此可見(jiàn)，刺參體壁的熱力學(xué)動(dòng)態(tài)機(jī)械變化可能與膠原蛋白的熱變性行為有關(guān)。

本研究從刺參體壁中提取了酶促溶性膠原蛋白（pepsin-solubilized collagen，PSC），之后分別采用差示掃描量熱、傅里葉紅外光譜、圓二色譜、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）技術(shù)研究刺參體壁PSC的熱穩(wěn)定性，并探究熱處理后PSC的凝膠形成能力及凝膠過(guò)程中的分子間作用力，以期揭示刺參體壁膠原蛋白在熱處理過(guò)程中的變化機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺參購(gòu)自遼寧大連當(dāng)?shù)睾ｕr市場(chǎng)。

異丙醇、硫酸鈉、丙二醇（propylene glycol，PG）、二硫蘇糖醇（1,4-dithiothreitol，DTT）、-乙基馬來(lái)酰亞胺（-ethylmaleimide，NEM） 生工生物工程（上海）股份有限公司；丙烯酰胺、,-亞甲基雙丙烯酰胺、,,,-四甲基乙二胺、電泳標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker大連寶生物科技有限公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、NaCl、DO、鹽酸、氫氧化鈉、乙酸及其他試劑（均為分析純） 天津市天河化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

差示掃描量熱儀 法國(guó)塞塔拉姆儀器公司；J-810圓二色光譜儀 日本分光公司；傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)珀金埃爾默公司；SCL-10AVP高效液相色譜儀 日本島津公司；電泳儀、MF-ChemBIS 2.0凝膠成像儀 日本ATTO公司；TA.XT.plus食品物性測(cè)試儀 北京微訊超技儀器技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 刺參體壁PSC的提取

取刺參100 g（去除內(nèi)臟，清洗干凈），加入去離子水后勻漿，13 600 r/min離心10 min，棄去上清液。取得沉淀，加入1 L Tris-HCl緩沖液（0.1 mol/L，pH 8.0，含5 mmol/L EDTA，0.5 mol/L NaCl）攪拌過(guò)夜。13 680 r/min離心10 min后取沉淀，加入去離子水清洗至中性后，再加入0.8 L去離子水，攪拌72 h。將懸浮液9 500 r/min離心5 min，得到的上層清液為含粗膠原纖維的混合溶液。17 300 r/min離心30 min取沉淀，按料液比1∶500（g/mL）加入0.1 mol/L NaOH溶液，攪拌72 h（其間每隔24 h換一次溶液）。17 300 r/min再次離心10 min后取沉淀，加去離子水反復(fù)清洗至中性后，凍干得粗膠原纖維。

將凍干的粗膠原纖維溶于0.5 mol/L乙酸溶液，料液比1∶500（g/mL），加入胃蛋白酶（加酶量為底物質(zhì)量的14%），攪拌72 h。17 300 r/min離心20 min，取上清液。向上清液中緩慢加入4 mol/L NaCl溶液，直至濃度達(dá)到0.8 mol/L，靜置過(guò)夜。13 600 r/min離心5 min取沉淀。將沉淀溶于少量0.5 mol/L乙酸溶液中，透析48 h（透析液為0.02 mol/L NaHPO-NaHPO）。13 600 r/min離心20 min后取沉淀，經(jīng)凍干得到PSC。

1.3.2 刺參體壁PSC變性溫度的測(cè)定

向0.012 5 g PSC凍干樣品中加入250 μL去離子水，以250 μL去離子水為空白，應(yīng)用差示掃描量熱儀對(duì)其變性溫度（）進(jìn)行測(cè)定，升溫速率為1 ℃/min。

1.3.3 熱處理過(guò)程中刺參體壁PSC結(jié)構(gòu)變化分析

1.3.3.1 圓二色譜分析

以0.2 mol/L乙酸溶液配制PSC懸濁液（終質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL），分別于4、20、30、40、50、60、70、80、90、100 ℃保溫2 h后進(jìn)行圓二色譜測(cè)定，掃描范圍190～260 nm，分辨率2 nm，掃描速率100 nm/min，狹縫寬度2 nm，響應(yīng)時(shí)間0.5 s。

1.3.3.2 傅里葉紅外光譜分析

以DO配制PSC懸濁液，終質(zhì)量濃度為0.5 g/L，注入CaF液體池中加熱，以5 ℃為初始溫度，1 ℃/min勻速升溫，每上升5 ℃恒溫10 min，并進(jìn)行傅里葉紅外光譜測(cè)定（分辨率2 cm，測(cè)定范圍4 000～400 cm），直至70 ℃。選取酰胺I帶（1 700～1 600 cm）區(qū)域進(jìn)行紅外圖譜分析。以1 700 cm和1 600 cm兩波數(shù)點(diǎn)為基點(diǎn)進(jìn)行基線相互校正。采用Omnic 6.0軟件（Thermo Electron Corporation，Madison，WI，USA）對(duì)譜圖進(jìn)行平滑（平滑系數(shù)為5，峰寬9.642 cm）及傅里葉自去卷積處理（峰寬36.5 cm，分辨增強(qiáng)系數(shù)2.6）。

1.3.4 熱處理過(guò)程中刺參體壁PSC降解作用分析

1.3.4.1 HPLC分析

以0.01 mol/L NaHPO-0.1 mol/L NaSO緩沖溶液（含0.1 g/L SDS）制備終質(zhì)量濃度為1 mg/mL的PSC溶液，分別于20、40、60、80、100 ℃保溫2 h后，13 680 r/min離心30 min，取上清液過(guò)0.45 μm水系膜，采用HPLC法確定PSC熱處理過(guò)程中分子質(zhì)量的變化規(guī)律，以未加熱樣品作為對(duì)照組。TSK-gel G4000-SWxl（7.8 mm×30.0 cm）凝膠過(guò)濾色譜柱，進(jìn)樣量10 μL；進(jìn)樣質(zhì)量濃度1 mg/mL；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；流動(dòng)相為0.01 mol/L NaHPO-0.1 mol/L NaSO緩沖溶液（含0.01 g/L SDS）；洗脫流速0.7 mL/min。分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品分別選用肌球蛋白（200 kDa）、-半乳糖苷酶（116 kDa）、磷酸酶b（97.2 kDa）、牛血清蛋白（66.4 kDa）、卵清蛋白（43 kDa），分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線為=－0.081 5＋6.170 5（=0.996 9），式中：為保留時(shí)間/min，為分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值（lg Da）。

1.3.4.2 SDS-PAGE分析

將PSC樣品溶于上樣緩沖液（8 mol/L尿素，0.5 g/L SDS，0.5 g/L-巰基乙醇，250 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl），終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，分別于4、20、30、40、50、60、70、80、90、100 ℃保溫2 h后，13 680 r/min離心30 min，取10 μL上清液進(jìn)行垂直板SDS-PAGE。5%濃縮膠（7.5 mA），7%分離膠（15 mA），采用SDSTris-甘氨酸系統(tǒng)為電極緩沖液，電泳完畢后，加入75%考馬斯亮藍(lán)-乙酸-甲醇溶液染色液振蕩染色過(guò)夜后，SDSPAGE脫色液（50%乙醇、9%冰乙酸）脫色，直至條帶清晰，應(yīng)用Bio-lmaging Systems MF-ChemBIS 2.0的凝膠成像儀成像。

1.3.5 熱處理后刺參體壁PSC凝膠強(qiáng)度測(cè)定

將0.012 5 g PSC溶于250 μL超純水，分別于20、30、40、50、60、70、80、90 ℃和100 ℃加熱2 h后，4 ℃垂直靜置24 h，以未加熱樣品作為對(duì)照組。采用食品物性測(cè)試儀TA.XT.plus測(cè)定凝膠強(qiáng)度并利用下式計(jì)算相對(duì)凝膠強(qiáng)度，P/5探頭，高度設(shè)定為20 mm，下行18 mm，下行速率0.5 mm/s，上行速率10 mm/s。

1.3.6 刺參體壁PSC凝膠過(guò)程中的分子間的作用力

將0.012 5 g PSC分別加入到250 μL不同含量NEM、DTT、SDS、PG、尿素及NaCl溶液中。70 ℃加熱2 h后，4 ℃垂直靜置24 h，采用食品物性測(cè)試儀測(cè)定凝膠強(qiáng)度并計(jì)算相對(duì)凝膠強(qiáng)度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以上實(shí)驗(yàn)均至少3 組平行。所得數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0進(jìn)行顯著性分析（＜0.01，差異顯著），并利用Origin 9.0和Excel 2010軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺參體壁PSC的變性溫度

刺參體壁中的膠原蛋白為I型膠原蛋白，由-鏈-異三聚體鏈接形成的三螺旋結(jié)構(gòu)組成。三螺旋構(gòu)象的特征在于重復(fù)的甘氨酸-脯氨酸-羥脯氨酸（Gly-Pro-Hyp）骨架，其中Pro和Hyp都配備了環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可有效增強(qiáng)膠原結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，另外，Hyp的羥基也可提供有助于穩(wěn)定三螺旋構(gòu)象的氫鍵。因此，膠原分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定主要靠-鏈鏈間和鏈內(nèi)氫鍵維持。但膠原蛋白對(duì)熱極為敏感，并且會(huì)根據(jù)溫度環(huán)境發(fā)生不同的結(jié)構(gòu)變化，一般，膠原蛋白在劇烈受熱（加熱溫度高于變性溫度）時(shí)，氫鍵易發(fā)生斷裂，三螺旋結(jié)構(gòu)受損。如圖1所示，刺參體壁PSC的變性溫度為35.3 ℃，說(shuō)明刺參體壁PSC在溫度高于35.3 ℃受熱時(shí)，維持其三股螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的非共價(jià)結(jié)合力將減弱，膠原分子解纏繞，分子結(jié)構(gòu)將從有序折疊態(tài)變?yōu)闊o(wú)規(guī)卷曲態(tài)，天然構(gòu)象被破壞。

圖1 刺參體壁PSC的差示掃描量熱結(jié)果Fig.1 Differential scanning calorimetric analysis of PSC from the body wall of sea cucumber

2.2 熱處理過(guò)程中刺參體壁PSC結(jié)構(gòu)變化

膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的圓二色譜特征一般是在225 nm附近有一個(gè)正吸收峰，在197 nm附近有一個(gè)負(fù)吸收峰，但吸收峰的位置會(huì)隨著氨基酸序列和長(zhǎng)度的變化發(fā)生偏移。對(duì)不同溫度處理過(guò)的刺參體壁PSC進(jìn)行圓二色譜測(cè)定，結(jié)果如圖2所示，對(duì)照組PSC樣品具備完整的三螺旋結(jié)構(gòu)，在220 nm處存在正吸收峰，在197 nm存在強(qiáng)烈的負(fù)吸收峰。在低于35 ℃處理?xiàng)l件下加熱PSC，樣品吸收峰幾乎無(wú)變化，說(shuō)明此時(shí)刺參體壁PSC三螺旋結(jié)構(gòu)仍保持良好；當(dāng)溫度達(dá)到35 ℃后，PSC的三螺旋結(jié)構(gòu)開始解纏繞，從而轉(zhuǎn)變?yōu)樗缮⒌? 條亞基鏈，正吸收峰完全消失。這一結(jié)果與段蕊等研究鏈魚鱗膠原蛋白加熱過(guò)程中圓二色譜圖的變化類似，當(dāng)加熱溫度超過(guò)變性溫度時(shí)，膠原蛋白的螺旋分子中不穩(wěn)定區(qū)域的螺旋發(fā)生松散，從而引起圓二色譜吸收峰值的變化。

圖2 刺參體壁PSC在熱處理過(guò)程中的圓二色譜Fig.2 Circular dichroism analysis of PSC from the body wall of sea cucumber

如圖3A所示，PSC的特征結(jié)構(gòu)吸收峰包括3 305、3 082、1 657、1 559 cm以及1 242 cm，分別歸屬于酰胺A帶N—H伸縮振動(dòng)（氫鍵）、酰胺B帶N—H非對(duì)稱和對(duì)稱伸縮振動(dòng)、酰胺I帶C＝O伸縮振動(dòng)和N—H彎曲振動(dòng)、酰胺II帶N—H彎曲振動(dòng)和C—N伸縮振動(dòng)，以及酰胺III帶由蛋白酰胺鍵C—N伸縮振動(dòng)和N—H變形及甘氨酸中—CH基團(tuán)和脯氨酸側(cè)鏈的搖擺振動(dòng)。

紅外譜圖中酰胺I帶可以良好地表現(xiàn)膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的變化，因此本研究在刺參體壁PSC熱處理過(guò)程紅外譜圖數(shù)據(jù)分析的過(guò)程中，只選取了1 700～1 600 cm波段的數(shù)據(jù)進(jìn)行了具體分析。如圖3B所示，可發(fā)現(xiàn)刺參體壁PSC在連續(xù)加熱過(guò)程中酰胺I帶吸收強(qiáng)度隨溫度變化而變化，且峰形隨加熱溫度的增大變得平緩且藍(lán)移，由此推測(cè)，隨著溫度的升高，刺參體壁PSC的三螺旋結(jié)構(gòu)遭到破壞。當(dāng)加熱溫度超過(guò)35 ℃時(shí)，即超過(guò)變性溫度，膠原蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞，其中歸屬于-螺旋結(jié)構(gòu)伸縮振動(dòng)的1 656 cm處峰值降低最為劇烈，因溫度越高，膠原蛋白變性程度越大，分子內(nèi)各種次級(jí)鍵被破壞，高度有序的螺旋結(jié)構(gòu)向無(wú)規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變。

圖3 PSC的紅外光譜圖（A）和在連續(xù)加熱過(guò)程中1 700～1 600 cm－1波段紅外光譜二階導(dǎo)圖譜（B）Fig.3 FTIR spectra of PSC (A) and second derivative spectra at 1 700-1 600 cm-1 of PSC during heating (B)

2.3 熱處理過(guò)程中刺參體壁PSC降解作用

采用HPLC對(duì)刺參體壁PSC降解規(guī)律進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)（圖4A），PSC未處理組樣品分子質(zhì)量主要分布范圍為362.4～244.4（7.5～9.6 min）、210.3 kDa（10.4 min）及141.8 kDa（12.5 min）。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，膠原的基本結(jié)構(gòu)是由分子質(zhì)量為360 kDa的巨型原膠原蛋白分子組成，該分子由3 條-鏈組成的三股螺旋構(gòu)象（即膠原域），每條-鏈大約有1 000 個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量約為120 kDa。由此可見(jiàn)，PSC中包含-鏈、-鏈（雙-鏈折疊）及鏈（3 條-鏈交聯(lián)）3 種結(jié)構(gòu)。當(dāng)加熱溫度為20～40 ℃時(shí)，PSC的分子質(zhì)量幾乎無(wú)變化，說(shuō)明PSC仍良好持有原有分子構(gòu)象。當(dāng)加熱溫度升至60 ℃時(shí)，HPLC圖譜中7.5～12.5 min處吸收峰顯著降低，在17.8 min處出現(xiàn)明顯吸收峰，說(shuō)明受熱影響，-鏈和-鏈逐漸解旋，-鏈開始降解，生產(chǎn)小分子物質(zhì)（約5.2 kDa）；當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃時(shí)，PSC樣品中多鏈結(jié)構(gòu)已完全解纏繞；100 ℃時(shí)，PSC的大分子基本結(jié)構(gòu)特征已不存在，全部降解為7.6 kDa的多肽物質(zhì)。

如圖4B所示，進(jìn)一步采用SDS-PAGE對(duì)刺參體壁PSC進(jìn)行分析，同樣發(fā)現(xiàn)PSC結(jié)構(gòu)中包含-鏈、-鏈及-鏈。60 ℃加熱時(shí)，PSC樣品中氫鍵受熱斷裂，-鏈開始解纏繞，條帶顏色變淺；當(dāng)加熱溫度達(dá)到70 ℃時(shí)，由雙-鏈折疊形成的-鏈開始水解；80 ℃時(shí)，-鏈、-鏈已完全消失，且-鏈中氫鍵也受熱破壞嚴(yán)重，降解作用顯著；加熱溫度達(dá)90 ℃時(shí)，與HPLC結(jié)果一致，PSC的大分子肽鏈結(jié)構(gòu)已不存在，推測(cè)可能已完全降解為小分子肽，但由于分離膠的濃度較低，所以未能檢出。綜合以上結(jié)果說(shuō)明，加熱溫度超過(guò)變性溫度35.3 ℃時(shí)，PSC三螺旋結(jié)構(gòu)開始解旋；當(dāng)加熱溫度超過(guò)70 ℃時(shí)，-肽鏈逐漸降解成小分子多肽。

圖4 PSC在不同加熱溫度下的降解程度Fig.4 Degradation of PSC during heating

2.4 熱處理后刺參體壁PSC的凝膠強(qiáng)度

對(duì)刺參體壁PSC經(jīng)不同溫度加熱后的凝膠形成能力進(jìn)行分析（圖5）發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加熱溫度低于40 ℃時(shí)，PSC的凝膠強(qiáng)度雖顯著增強(qiáng)，但增強(qiáng)幅度較?。ǎ?0%）。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)加熱溫度低于變性溫度時(shí)，可觸發(fā)膠原單體自發(fā)的原纖維生成過(guò)程。一般情況下，膠原原纖維的形成是膠原的固有行為，且膠原單體的自組裝過(guò)程基本符合成核和傳播模型理論。核區(qū)是由有限數(shù)量的膠原分子聚集形成，然后隨著長(zhǎng)度和直徑的增長(zhǎng)發(fā)展成成熟的原纖維。但這種熱驅(qū)動(dòng)的聚集過(guò)程與水在膠原分子周圍遷移所產(chǎn)生的熵有關(guān)，即隨溫度的升高，膠原蛋白聚集性越強(qiáng)，因此，相鄰膠原分子非極性區(qū)域之間的疏水相互作用將逐漸受限，凝膠強(qiáng)度難以大幅提高。當(dāng)PSC經(jīng)40～70 ℃加熱后冷卻，凝膠強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，其中經(jīng)70 ℃加熱處理后的PSC樣品凝膠強(qiáng)度達(dá)到最大，這可能是因?yàn)楫?dāng)加熱溫度超過(guò)變性溫度后，膠原蛋白的氫鍵和共價(jià)鍵被切斷，導(dǎo)致三螺旋結(jié)構(gòu)的展開，隨著二級(jí)結(jié)構(gòu)-螺旋到無(wú)規(guī)卷曲的轉(zhuǎn)變，膠原蛋白轉(zhuǎn)化為可溶性明膠。通過(guò)不斷的解聚和延伸，分子位點(diǎn)上的含硫氨基酸逐漸暴露出來(lái)。之后，當(dāng)溫度回到變性溫度以下時(shí)，水解的膠原蛋白通過(guò)二硫鍵的相互作用發(fā)生不可逆的聚集，從而形成具有三維網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定凝膠。

圖5 刺參體壁PSC經(jīng)不同溫度加熱所制備凝膠的相對(duì)凝膠強(qiáng)度Fig.5 Relative gel strength of heat-induced gels of PSC from sea cucumber body wall at different temperatures

2.5 刺參體壁PSC凝膠過(guò)程中的分子間作用力

凝膠體系通?？繗滏I、離子相互作用、疏水相互作用、二硫鍵等不同的分子間作用力或組合維系。本研究分別采用尿素破壞PSC凝膠過(guò)程中氫鍵的相互作用，以SDS、PG破壞疏水鍵的作用，以DTT和NEM還原二硫鍵，利用NaCl增強(qiáng)離子鍵作用。如圖6所示，在添加了NEM、DTT、尿素及NaCl后，PSC的凝膠強(qiáng)度隨顯著減弱；而添加SDS和PG的PSC凝膠體系的凝膠強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，說(shuō)明在PSC凝膠形成過(guò)程中主要依靠疏水鍵、氫鍵、二硫鍵及靜電斥力的相互作用。二硫鍵是膠原蛋白熱誘導(dǎo)凝膠形成的主要化學(xué)鍵之一，凝膠化過(guò)程中膠原蛋白頭部的二硫鍵在凝膠形成的過(guò)程中起重要作用。Zhong Chan等發(fā)現(xiàn)膠原蛋白具有由12 個(gè)保守半胱氨酸殘基形成的6 個(gè)二硫鍵，具備穩(wěn)定膠原結(jié)構(gòu)的重要作用，而通過(guò)內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)，可引起I型膠原的明膠水解和降解；此外，Omura等利用葡萄糖氧化酶的作用增加魚糜凝膠中二硫鍵含量，從而提升凝膠效果。氫鍵是膠原蛋白凝膠中數(shù)量極大且對(duì)凝膠強(qiáng)度影響最為重要的弱偶極鍵。根據(jù)王嵬等報(bào)道，在受熱過(guò)程中，PSC肽骨架結(jié)構(gòu)中本用于維持空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的羰-酰胺基團(tuán)間的氫鍵可能發(fā)生斷裂，二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，冷卻時(shí)，PSC通過(guò)廣泛的水合作用，重新生成氫鍵，從而再次建立穩(wěn)定的蛋白質(zhì)構(gòu)象。除此之外，PSC在受熱過(guò)程中，肽鏈?zhǔn)嬲?，大量的非極性基團(tuán)暴露于水中，而這些疏水結(jié)構(gòu)附近的水分子通過(guò)分子間氫鍵定向排列，使得溶膠體系變得有序化，從而引起膠原分子的凝集，在復(fù)冷條件下形成凝膠體系。此外，由于膠凝的聚集過(guò)程受疏水作用的影響，靜電相互作用在膠原蛋白質(zhì)聚集過(guò)程中通常表現(xiàn)為靜電斥力。

圖6 PSC在不同溶液中形成凝膠的相對(duì)凝膠強(qiáng)度Fig.6 Relative gel strength of gels formed from PSC in different solutions

3 結(jié)論與討論

海參體壁是典型的可變膠原結(jié)締組織，可通過(guò)調(diào)節(jié)加熱強(qiáng)度控制肌肉組織的質(zhì)構(gòu)特性，因此，探究海參膠原蛋白的熱變性及凝膠規(guī)律對(duì)提升海參加工品質(zhì)具有重要意義。通過(guò)對(duì)刺參體壁PSC受熱過(guò)程中性質(zhì)變化研究發(fā)現(xiàn)，PSC變性溫度為35.3 ℃。當(dāng)加熱溫度低于變性溫度時(shí)，PSC仍可保持良好的三螺旋結(jié)構(gòu)。當(dāng)PSC受熱溫度為40～70 ℃時(shí)，PSC三螺旋結(jié)構(gòu)逐漸解纏繞，二級(jí)結(jié)構(gòu)雖然受損，但-肽鏈仍可在冷卻過(guò)程中依靠分子間氫鍵和二硫鍵的相互作用重新交聯(lián)，形成強(qiáng)凝膠體系，且凝膠強(qiáng)度隨加熱溫度的升高而增強(qiáng)；當(dāng)加熱溫度為80～100 ℃時(shí)，PSC三螺旋結(jié)構(gòu)解旋完全，-肽鏈降解為小分子多肽，且冷卻后難以所形成強(qiáng)凝膠體系，凝膠強(qiáng)度隨加熱溫度的升高而下降。由以上結(jié)果可知，海參熱加工過(guò)程中，若加熱溫度為40～70 ℃時(shí)，冷卻后的海參仍可保持良好的機(jī)械性能；而過(guò)高的熱處理溫度（＞80 ℃）極有可能導(dǎo)致海參喪失良好的彈性及咀嚼性。

海參體壁熱加工過(guò)程中涉及粗膠原纖維的解旋、水解，膠原蛋白分子的降解、聚集及玻璃化轉(zhuǎn)化等多種化學(xué)過(guò)程。本研究針對(duì)刺參體壁酶溶性膠原蛋白的熱變性進(jìn)行研究，并獲得了相應(yīng)的結(jié)果，為研究海參熱加工提供了有力的依據(jù)，但存在科學(xué)問(wèn)題需進(jìn)一步探索：1）海參體壁結(jié)構(gòu)中除具有膠原蛋白外，還存在大量的黏多糖成分，可利用紅外光譜、圓二色譜等技術(shù)，原位探究黏多糖-膠原蛋白動(dòng)態(tài)互作關(guān)系；2）在膠原蛋白溶膠-凝膠過(guò)程中，水合作用的消減及增強(qiáng)起到了重要影響，因此，亟需探究膠原蛋白凝膠形成過(guò)程中水分子的動(dòng)態(tài)分布規(guī)律。