唐慶華　孟秀利　于少帥　林兆威　牛曉慶　宋薇薇　覃偉權

摘 ?要：自1981年海南省屯昌縣首次發(fā)現(xiàn)檳榔黃化病（yellow leaf disease of areca palm， YLD）以來，檳榔黃化問題日趨嚴重，現(xiàn)已成為制約中國檳榔產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的最重要的因素。同時，鑒于生產(chǎn)中除檳榔黃化病外，炭疽病、細菌性葉斑病、椰心葉甲、干旱等一些其他因素也可引起檳榔黃化，以及“檳榔黃化病”病原或病因認識上存在混淆的問題，學界暫用“檳榔黃化現(xiàn)象”的表述。近年來，針對上述問題開展了一系列深入研究并取得突破性進展。本文首先簡要回顧了中國檳榔黃化病的發(fā)生及病原方面的研究進展，介紹了另一種致黃關鍵新病害——由檳榔隱癥病毒1（Areca palm velarivirus 1， APV1）引起的檳榔黃葉病毒?。╝reca palm leaf yellowing virus disease， ALYVD），以及其他2種新發(fā)現(xiàn)的病毒病害——檳榔壞死環(huán)斑病毒病和檳榔壞死環(huán)斑病毒病的研究進展。對6個示范基地的病原檢測結果表明，部分黃化植株被檳榔黃化植原體（areca palm yellow leaf phytoplasma， AYLP）或APV1單獨感染，部分植株被AYLP和APV1復合感染。本文還探討了檳榔黃化病研究中存在的病原分布不均、含量低引起的檢測困難和田間診斷易混淆等問題，并對YLD、ALYVD、葉斑類病害、根腐病害、芽腐病、椰心葉甲、干旱、寒害、除草劑藥害等9類因子引起的黃化癥狀特征進行了總結。進而分析了YLD和ALYVD 防控中存在的問題以及現(xiàn)階段面臨的緊迫形勢，從防控策略和具體措施解讀了《檳榔“黃化病“防控明白紙》，并指出了其有待進一步完善之處及防控中亟待解決的問題。最后，展望了YLD和ALYVD 2種致黃關鍵病害綜合防控中亟待實施的措施。本文旨在讓廣大科研工作者和農(nóng)技人員更好地了解檳榔“黃化病”方面的最新成果。

關鍵詞：檳榔黃化病（YLD）;檳榔黃化植原體;檳榔隱癥病毒1;檳榔黃葉病毒?。ˋLYVD）;防控明白紙中圖分類號：S436.67??????文獻標識碼：A

Forty Years of Research on “Yellow Leaf Disease of Areca Palm” in China： New Progress of the Casual Agent and the Management

Abstract： Since yellow leaf disease of areca palm （YLD） was observed in Tunchang County， Hainan Province in 1981， issues regarding to areca palm leaf yellowing are increasingly serious which have become the most important factors restricting the sustainable development of the areca palm industry in China. Meanwhile， a temporary conception ‘a(chǎn)reca yellow leaf phenomenon was proposed by the academic circle based on the facts that some other factors including areca anthracnose， areca bacterial leaf spot， coconut leaf beetle， and drought stress etc. except YLD could cause areca palm leaves to turn yellow and confusions were existed in the understanding of the causal agent or cause of ‘YLD. The questions above have been researched systematically and breakthroughs have been achieved recently. In this review， firstly， the occurrence and progress on the etiological agent of YLD were briefly retrospected， achievements of another key novel areca palm yellow leaf related disease， areca palm leaf yellowing virus disease （ALYVD） caused byAreca palm velarivirus 1（APV1）， together with 2 recently reported virus diseases areca palm necrotic spindle-spot virus disease and areca palm necrotic ringspot virus disease were introduced. Detection of the pathogens of diseased leaf samples showing yellow symptom collected from 6 demonstration bases showed that a part of the samples were only infected by AYLP or APV1 while another parts were co-infected by AYLP and APV1. Questions that the difficulty in the detection caused the even distribution and low title of the pathogen AYLP and that the easy-to-cofused symptoms for the diagnosis in field in the research of YLD were probed and characteristic yellow symptoms caused by 9 types of factors including YLD and ALYVD， leaf-spot-type diseases， root-rot-type diseases， bud rot， coconut leaf beetle， drought & chilling stress， herbicide phytotoxicity etc were summarized. Problems in the control practices and the pressing situations confronted in the management currently were then analyzed， and key points from tactical and detailed methodical perspectives in the plain paper for the management of areca palm ‘leaf yellowing related diseases were elaborated and its aspects to be further improved together certain problems in the management were pointed out. At the end， foresight of the integrated control measures for the two key leaf yellowing related diseases， which were urgent to implement， were prospected. The aim of this review is to make the latest progress regarding ‘YLD known to researchers and agricultural technicians.DA667E26-CCFB-4AE7-805F-E2D72A702372

Keywords： yellow leaf disease of areca palm?（YLD）; areca palm yellow leaf phytolasma;Areca palm velarivirus 1; areca palm leaf yellowing virus disease?（ALYVD）; plain paper for disease management

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.05.016

檳榔（Areca catechuL.）是海南省農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的“三棵樹”（橡膠、檳榔、椰子）經(jīng)濟作物之一，是種植面積僅次于天然橡膠的第二大經(jīng)濟作物^[1]。近年來，隨著消費人群持續(xù)擴大和價格不斷攀升，海南檳榔種植面積及產(chǎn)值逐年增加。根據(jù)海南省統(tǒng)計年鑒，2018年底全省檳榔種植面積超過10.99萬hm²，產(chǎn)值達到404.9億元;2020年產(chǎn)值達到543.0億元，是2010年產(chǎn)值（69.9億元）的7.77倍。目前，檳榔已成為230多萬農(nóng)民的主要經(jīng)濟來源之一^[2]，在全省農(nóng)業(yè)和農(nóng)村發(fā)展、廣大農(nóng)民增收致富中具有重要的地位。

1981年，海南省屯昌縣首次發(fā)現(xiàn)檳榔黃化病^[3]（yellow leaf disease of areca palm， YLD）。此前，國內(nèi)已有學者^[4]根據(jù)大田流行規(guī)律、電鏡、抗生素檢測得出中國的YLD病原為植原體的結論，后續(xù)的分子檢測^[5-6]也支持該結論。然而，調(diào)查發(fā)現(xiàn)除黃化病外，一些生物因素（如炭疽病、椰心葉甲等病蟲害）、非生物因素（生理性缺素、氣候條件、除草劑等）也可引起檳榔葉片變黃。在陵水、萬寧等重病區(qū)，已有大面積檳榔園遭受YLD以及其他黃化因子等為害，產(chǎn)量損失嚴重，重病園幾近絕產(chǎn)，造成許多農(nóng)戶喪失種植信心，致使黃化檳榔園失管情況非常突出。許多農(nóng)戶甚至一些農(nóng)技人員在檳榔黃化病病原或病因認識上產(chǎn)生了較大混淆^[2]，把不同原因造成的檳榔黃化均稱為“檳榔黃化病”，“檳榔黃化”由此成為一個由多種病蟲及生理性因素等伴隨發(fā)生的復雜問題。因此，再用“檳榔黃化病”來描述生產(chǎn)中的檳榔黃化問題顯然不切實際。在此背景下，學界暫用“檳榔黃化現(xiàn)象”的概括性說法，旨在留待后續(xù)研究者對各種因子引起的黃化癥狀進行澄清和區(qū)分。近10年來，YLD以及其他黃化相關病害日趨嚴重^[7-9]，已對海南農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展造成嚴重威脅，引起了各級政府部門、廣大檳榔種植戶以及相關企業(yè)的普遍關注。為了加快YLD及相關病害的基礎與防控技術研究，海南省科學技術廳設立了“2018年海南省檳榔病蟲害重大科技計劃項目”（No. ZDKJ201817，簡稱“海南省重大項目”），以支持相關科研團隊進行重點攻關。近年來，筆者項目團隊在檳榔黃化相關病害、病原及檢測技術等基礎研究上取得了突破性進展。例如，研究發(fā)現(xiàn)除檳榔黃化植原體（areca palm yellow leaf phytoplasma， AYLP）外，檳榔隱癥病毒1^[10]（Areca palm velarivirus 1， APV1）也是引起生產(chǎn)上檳榔大面積黃化的一種病原，其所致病害現(xiàn)命名為檳榔黃葉病毒?。?em>Areca palm leaf yellowing virusdisease， ALYVD）^[11]。同時，還發(fā)現(xiàn)了2種新的病毒病害，即檳榔壞死梭斑病毒病（Areca palm necrotic spindle-spot virus， ANSSV）^[12]和檳榔壞死環(huán)斑病毒病（Areca palm necrotic ringspot virus， ANRSV）^[13]。目前，對YLD和這3種病毒病害的病原檢測技術等方面取得了豐碩進展。新病害ALYVD的發(fā)現(xiàn)以及YLD的研究基礎依然薄弱的現(xiàn)狀給當前和今后的研究提出了新的課題，促使筆者對這2種病害的癥狀及流行規(guī)律等進行進一步深入研究。在生產(chǎn)上，鑒于YLD和ALYVD日趨嚴重而缺乏一套系統(tǒng)的防控措施的現(xiàn)狀，筆者項目團隊于2020年7—9月撰寫了《檳榔黃化病防控明白紙》，并在萬寧市召開了“《檳榔黃化病防控明白紙》研討推介會”（以下簡稱為《明白紙》。召開該推介會時由APV1引起的檳榔黃葉病毒病尚稱為檳榔黃化病或病毒性檳榔黃化?。@標志著國內(nèi)“檳榔黃化病”在防控策略和方法上已上升到一個新階段。然而，迄今尚無評論性文章對《明白紙》進行解讀。為此，對上述問題進行分析總結進而明確今后的攻關重點，以加快推進《明白紙》的宣貫，促進YLD和ALYVD這2種致黃關鍵病害的基礎研究與科學防控。

本文通過介紹YLD和ALYVD?2種致黃關鍵病害及其病原、病原檢測技術上的最新進展，分析由于發(fā)現(xiàn)ALYVD而延伸的新問題，探討新的攻關重點;梳理“檳榔黃化現(xiàn)象”各因子引起的黃化癥狀特點;解讀《明白紙》，并分析其有待進一步補充、完善之處，對今后5～10 a在YLD和ALYVD?2種致黃關鍵病害攻關中有望獲得突破的檢測及防控技術進行展望。

1 ?檳榔黃化病及相關病毒病研究進展

1.1 ?檳榔黃化病

檳榔黃化病（yellow leaf disease of areca palm， YLD）于1914年在印度喀拉拉邦（Kerala）部分地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)^[14]。關于印度YLD的病原或病因探索史，國內(nèi)學者（如車海彥等^[9]、朱輝等^[15]）已做了相關綜述，本文重點介紹檳榔黃化病原及檢測技術上的研究進展。1971年，NAYAR^[16]從病葉組織上培養(yǎng)獲得一種微生物，電鏡觀察后發(fā)現(xiàn)這是一種類菌原體MLO（即植原體）^[17]，由此最早提出植原體與黃化病相關。隨后的常規(guī)技術（包括電鏡觀察^[17-18]、狄納氏染色^[19]）、菟絲子^[20]、媒介昆蟲甘蔗斑袖蠟蟬（Proutista moesta）接種^[20]、血清學^[18]和分子檢測技術[包括巢式PCR^[21-22]、實時熒光PCR（Real-time PCR）^[22]、環(huán)介導等溫擴增（loop-?ediated isothermal amplification， LAMP）^[23]]均證實印度檳榔黃化病病原為植原體。迄今，已發(fā)現(xiàn)印度檳榔黃化植原體具有組或亞組水平上的多樣性^[24]，存在16SrⅪ-B亞組^{[21-22， 25]}、16SrⅠ-B組^[26]和16SrⅪⅤ組^[27]3個組或亞組的植原體。由于植原體難以人工培養(yǎng)，無法完成經(jīng)典的柯赫氏法則。因此，菟絲子、甘蔗斑袖蠟蟬接種實驗為印度檳榔黃化植原體的病原性質(zhì)提供了充分證據(jù)。同時，檳榔體內(nèi)植原體含量低的特點制約了印度檳榔黃化植原體的檢出，即便用LAMP技術檢測，40份病株DNA樣品中僅30份檢測呈陽性^[23]。DA667E26-CCFB-4AE7-805F-E2D72A702372

在中國，YLD（早期稱為檳榔黃葉?。┳钤缬?981年在海南省屯昌縣發(fā)現(xiàn)^[3]，剛開始認為是一種土壤缺鉀引起的生理性病害^[1]，但采取追施鉀肥措施后黃化癥狀并未得到減輕，病害仍繼續(xù)發(fā)展^[3]，這表明YLD并不是一種生理性病害。1995年，金開璇等^[3]開展了電鏡觀察試驗，結果發(fā)現(xiàn)病株中存在類菌原體和類細菌，由此提出中國檳榔黃化病為類細菌（引起束頂型癥狀）和類菌原體（引起黃化型癥狀）復合侵染引起。隨后，羅大全等^[4]先后進行了2次電鏡觀察實驗，發(fā)現(xiàn)黃化型和束頂型2種癥狀類型的病株葉脈和花苞組織樣品韌皮部篩管細胞均存在植原體，但未觀察到其他病原物。同時，羅大全等^[4]發(fā)現(xiàn)四環(huán)素注射可抑制染病檳榔病情，由此提出植原體是引起海南省黃化病的一種病原。隨后，羅大全等^[5]通過巢式PCR從病樣DNA成功擴增到植原體特異條帶（束頂型樣品未檢測到，但電鏡實驗中觀察到植原體），實驗證明黃化型的檳榔黃化病由植原體引起，但并未明確束頂型檳榔黃化病病原問題。車海彥等^[6]、周亞奎等^[28]根據(jù)巢式PCR產(chǎn)物測序和比對結果分別將擴增得到的AYLP劃分為16SrI-G亞組和16SrI-B亞組。于少帥等^[29]則將保亭、屯昌、萬寧等市（縣）擴增到的AYLP劃分為16SrI組。同時，還發(fā)現(xiàn)各株系與海南苦棟叢枝、長春花綠變、馬松子變?nèi)~、辣椒黃化皺縮、蛇婆子叢枝、細圓藤叢枝等植原體同源性為100%。該結果表明YLD可能通過這些寄主植物進行傳播擴散。車海彥^[30]以16S rDNA序列開發(fā)了Real-time PCR檢測方法，結果顯示該方法與傳統(tǒng)巢式PCR方法的檢測靈敏度相同。隨后用該方法對表現(xiàn)黃化癥狀的30株病株的未展開花苞、心葉以及第2、3、5片葉葉脈總DNA樣品進行了檢測，檢出率分別為100.0%、80.0%、26.7%、46.7%、60.0%，根及病株果實育出的幼苗樣品DNA中均未檢測到植原體信號。不同部位植原體檢測率不同，這表明檳榔黃化植原體在檳榔體內(nèi)具有不均勻分布的特點。此外，車海彥等^[31]于2019年2月至2020年1月對瓊海市嘉積鎮(zhèn)和萬寧市龍滾鎮(zhèn)2個染病檳榔園葉片內(nèi)的病原植原體進行了連續(xù)監(jiān)測和病原檢測，發(fā)現(xiàn)病葉中AYLP的檢出率總體隨著溫度升高而增加，反之減少。該結果表明病株葉片內(nèi)AYLP含量具有一定的周年消長規(guī)律性：在一定的溫度范圍內(nèi)，葉片中的AYLP含量與溫度成正相關（例如月平均溫度最低的12月，2個檳榔園的監(jiān)測植株葉片的AYLP檢出率均為0，而月平均溫度最低的6月，2個檳榔園的AYLP檢出率均為80%）。孟秀利等^[32]根據(jù)16S rDNA序列設計了巢式PCR引物組和F4/R1-F2/R2并建立新的巢式PCR檢測方法，發(fā)現(xiàn)該組合檢測效果優(yōu)于植原體檢測常用的引物組合R16mF2/R16mR1-R16F2n/R16R2。故筆者團隊近年來主要應用該方法進行疑似檳榔黃化病樣品的檢測。在實現(xiàn)檳榔黃化植原體穩(wěn)定檢測的基礎上，筆者團隊還進一步研發(fā)了靈敏、高效的LAMP^[33]和微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR， ddPCR）^[34]檢測方法，二者分別是基于16S rRNA基因和tuf基因序列開發(fā)完成。實驗結果顯示LAMP檢測極限為200?ag/μL（即目標片段濃度為53個拷貝/μL）^[33]。ddPCR的檢測極限為0.07個拷貝/μL，約是LAMP檢測技術靈敏度的1000倍^[34]。這2種高靈敏度檢測技術有望應用于YLD的早期診斷和種苗檢測等。

1.2 檳榔黃葉病毒病

近年來，筆者項目團隊在病原檢測、監(jiān)測技術等方面均取得了可喜進展，其中一個重要發(fā)現(xiàn)是鑒定了另外一種檳榔黃化相關病害——檳榔黃葉病毒?。ˋLYVD）。2015年，中國科技大學YU等^[35]用2012年采集于海南的黃化檳榔樣品進行了小RNA測序，發(fā)現(xiàn)了一種侵染檳榔的新病毒，命名為檳榔隱癥病毒1（Areca palm velarivirus 1， APV1）。該研究為檳榔黃葉病毒病的發(fā)現(xiàn)奠定了基礎。2020年，海南大學WANG等^[10]對采集的來自檳榔黃化病流行區(qū)以及非流行區(qū)的樣品進行了檢測，結果來自流行區(qū)（保亭等8個市、縣）有黃化癥狀的樣品均檢測到APV1（檢出率100%），來自流行區(qū)瓊海和萬寧的部分無黃化癥狀樣品也檢測到APV1（檢出率分別為50%和21%），而來自非流行區(qū)儋州和海口的樣品均未檢測到APV1（0%）。該結果表明APV1與海南“檳榔黃化病”高度相關。最近，該團隊通過雙條拂粉蚧（Ferrisia virgata）接種試驗成功完成了APV1病原性質(zhì)驗證。用帶毒雙條拂粉蚧接種檳榔幼苗30?d后檢測到APV1，60?d后幼苗逐漸開始表現(xiàn)與田間“檳榔黃化病”類似的不均勻黃化癥狀特征（葉肉褪綠變黃而葉脈保持綠色），75 d后檢測呈陽性幼苗數(shù)量達到峰值，不再增加^[36]。CAO等^[37]對新測序的20個APV1株系的全基因組序列進行了比對分析，結果發(fā)現(xiàn)APV1基因組存在3'端序列高度保守（核苷酸序列同源性>95%）的7個開放閱讀框和5'端則具有序列多樣性（核苷酸序列同源性為81%～87%）的3個開放閱讀框。系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明20個APV1株系可分為3個遺傳譜系，其中16個株系聚類于譜系A，這表明譜系A是海南檳榔上最具流行性的APV1基因型。同時，研究發(fā)現(xiàn)3個譜系中均存在不同基因型混合感染的情況，這與APV1基因組具有較高水平的遺傳重組密切相關，這表明不同基因型混合感染可引起APV1基因組的重組。目前針對APV1開發(fā)了反轉錄-PCR（RT-PCR）^[10]和酶聯(lián)免疫檢測方法^[38]。雙條拂粉蚧接種試驗結果表明APV1也是引起檳榔黃化的一種病原。由APV1引起的病害最初稱為“檳榔黃化病”^[10]，現(xiàn)從檳榔黃化病中分離出來，命名為檳榔黃葉病毒?。ˋLYVD），從而區(qū)分此前已經(jīng)存在的、已納入農(nóng)業(yè)行業(yè)標準^[39]的由檳榔黃化植原體引起的檳榔黃化病。2020年前，學界一直認為檳榔黃化植原體是導致海南檳榔大面積黃化的“元兇”（盡管也有一些質(zhì)疑，但并未證實還有其他病原），APV1與檳榔黃葉病毒病的發(fā)現(xiàn)則打破了這種認知局限，促使筆者項目團隊從更新、更全面的角度重新審視海南“檳榔黃化病”并開展病害防控等相關研究。DA667E26-CCFB-4AE7-805F-E2D72A702372

為了更好地推進示范基地的病害防控工作，筆者項目團隊對6個基地的黃化植株進行了病原檢測。檢測結果顯示（表1，尚未發(fā)表），所有基地均檢出AYLP和APV1?2種病原，表明6個基地均存在AYLP和APV1感染;而且6個基地的部分植株黃化是由AYLP或APV1單獨感染引起，部分植株是由AYLP和APV1復合感染引起。

1.3 檳榔壞死環(huán)斑病毒病和檳榔壞死梭斑病毒病

除了檳榔黃葉病毒病外，YAND等^[12-13]發(fā)現(xiàn)

了另外2種新的病毒病害——檳榔壞死梭斑病毒病和檳榔壞死環(huán)斑病毒病，并在病原檢測技術和致病機理研究方面取得了突破性進展。檳榔壞死梭斑病毒病于2017年10月在保亭縣首次發(fā)現(xiàn)，且僅在保亭有發(fā)現(xiàn)。檳榔壞死環(huán)斑病毒病于2019年首次報道，定安、瓊海、瓊中、萬寧、保亭、陵水、臨高、屯昌、瓊中、文昌均有發(fā)生，其中，萬寧、定安和瓊海局部區(qū)域分布較廣，發(fā)病率分別達46%、45%和36%^[13]。這2種病害的病原分別為ANRSV^[12]和ANSSV^[13]。目前，針對ANRSV和ANSSV已研發(fā)了3種高效、靈敏的核酸檢測方法，包括反轉錄-PCR（RT-PCR）、反轉錄環(huán)介導等溫擴增技術（RT-LAMP）^[40]和反轉錄重組酶聚合酶-側流層析試紙條（RT-RPA-LFD）檢測方法^[41]。同時，孫迪^[41]根據(jù)病毒外殼蛋白特異抗原決定簇制備了多克隆抗體，以此建立了血清學檢測方法。最近，該團隊在前導蛋白酶功能上取得了原創(chuàng)性進展，在國際上得到了較大關注。QIN等^[42]通過基因組注釋和序列分析表明ANSSV和ANRSV在分類上歸屬于馬鈴薯Y病毒科的一個新屬——檳榔病毒屬（Arepavinus）。不同于該科其他病毒，ANSSV和ANRSV編碼特異的前導蛋白酶為一個串聯(lián)的半胱氨酸蛋白酶（HCPro1-HCPro2）。通過構建酶切位點突變載體和體外翻譯等實驗，發(fā)現(xiàn)ANSSV編碼的HCPro1和HCPro2的切割位點分別是273G/S274和574G/G575。進一步的基因沉默抑制子實驗表明，與其他Potyviral HCPro不同，HCPro2是病毒沉默抑制子，其抑制基因沉默活性獨立于上游蛋白酶HCPro1的酶切事件。該研究為進一步深入研究病毒致病新機制奠定了基礎。

1.4 中國檳榔黃化病研究中存在的問題及黃化因子特征分析

目前，一直制約國內(nèi)檳榔黃化病研究的2個關鍵問題是：（1）檳榔黃化植原體具有分布不均的特點^[30]，而且含量很低^{[2， 23]}，給病原檢測、致病機理等研究帶來了挑戰(zhàn)。研究發(fā)現(xiàn)用傳統(tǒng)的巢式PCR方法進行檢測時植原體檢出率較低。例如周亞奎等^[28]在萬寧、瓊海、陵水采集了28株病株的葉片樣品，僅來自萬寧和瓊海的9份樣品檢測到植原體。曹學仁等^[43]在采集的49個黃化樣品中僅15個樣品檢測到植原體。筆者團隊改進后的巢式PCR方法的檢測極限也僅為25 ng/μL（樣品總DNA濃度，尚未發(fā)表）。因此，若無YLD病原檢測經(jīng)驗或植原體研究背景的研究人員的協(xié)助與指導，在進行檳榔黃化植原體檢測時則經(jīng)常會遇到例如樣品采集、巢式PCR污染等各種問題，造成檢測試驗失敗。（2）不同因子造成的“真假”檳榔黃化病并存情況較多，給YLD（包括新病害ALYVD）的病原認識和診斷帶來了極大困擾。在省重大項目立項之前，調(diào)查發(fā)現(xiàn)除YLD外，一些生物因素（如炭疽病、細菌性葉斑病^[44]等葉斑類病害，褐根病、紅根病^[45]等根部病害，以及害蟲椰心葉甲^{[2， 7]}）均可引起檳榔葉片變黃。此外，非生物因素如除草劑^{[43， 46]}、氣候（干旱、寒害）、生理性缺素^[45]等也會導致檳榔葉片變黃。在陵水、萬寧、瓊海等病區(qū)，通常是YLD與1種或多種病蟲害同時發(fā)生，且多種病害引起的病斑癥狀非常相似、發(fā)病初期難以區(qū)分。加上營養(yǎng)和氣候等因素干擾，田間YLD與“假檳榔黃化病”并存情況較多，很容易造成混淆。許多農(nóng)戶因缺乏相關的植保知識，將生產(chǎn)上各種因子引起的檳榔黃化均稱為“檳榔黃化病”或“檳榔黃葉病”（也有農(nóng)戶將其稱為“葉瘟”）。同時，學界對YLD的病原或病因是否僅有植原體這個問題也有較大分歧。在此背景下，為了回應YLD病原認識上的分歧以及實際生產(chǎn)中多種致黃因子存在的問題，學界暫時采用“檳榔黃化現(xiàn)象”（檳榔在生長過程中所表現(xiàn)出的葉片變黃的表征或癥狀）的概括性概念，以待后續(xù)研究進行澄清，進而查明YLD的本質(zhì)（病原或病因）。對YLD進行精準診斷和識別正是省重大項目中需要完成的一個重要任務。

經(jīng)過近年來的調(diào)查研究，生物和非生物因素中各種因子的致黃特點現(xiàn)已基本明確。（1）YLD和ALYVD是2種致黃關鍵病害。這是導致生產(chǎn)上檳榔大面積黃化、樹勢衰弱、減產(chǎn)的2種致黃關鍵病害，目前尚無有效的防治藥劑，只能采取綜合措施進行防控。其田間癥狀特點比較類似（盡管目前作了癥狀初步區(qū)分，但還需進一步補充完善），表現(xiàn)為發(fā)病初期樹冠倒數(shù)第2、3片羽狀復葉的部分小葉首先黃化，隨后黃化癥狀向上層葉片擴展，發(fā)病中后期樹冠縮小呈束頂狀，嚴重者植株死亡。這2種病害有發(fā)病中心。（2）葉斑類病害。包括炭疽病、細菌性葉斑病^[44]以及新報道的壞死梭斑病毒病^[12]和壞死環(huán)斑病毒病^[13]等，其癥狀特點為在葉片局部產(chǎn)生帶黃色暈圈的病斑，嚴重者葉片上病斑累累。炭疽病僅在瓊中等局部區(qū)域發(fā)病較重，細菌性葉斑病多在臺風季節(jié)爆發(fā)，病害嚴重時雖可導致葉片枯死，但防治較容易。壞死梭斑病毒病目前僅在保亭有發(fā)現(xiàn)，壞死環(huán)斑病毒則在定安、瓊海、萬寧等市（縣）均有發(fā)生。YLD和ALYVD 2種病毒病的傳播途徑、防控方法及其對產(chǎn)量的影響等研究尚待開展。（3）根腐病害。包括褐根病、紅根病、黑紋根病^[45]。其癥狀特點為發(fā)病后植株下層老葉首先變黃、下垂，嚴重者植株死亡。3種根病地上部分的黃化表現(xiàn)在下層葉片，容易與YLD和ALYVD進行區(qū)分。此外，根腐病從表現(xiàn)癥狀到植株死亡通常僅需幾周至幾個月，而YLD從表現(xiàn)癥狀到死亡常長達5～7 a^[7]（ALYVD有待進一步研究）。根腐病多是單個而非連片檳榔園發(fā)生，一旦發(fā)病常引起植株死亡，防治存在一定難度。（4）芽腐病。該病表現(xiàn)為感染后心葉首先變黃，常造成植株死亡。芽腐病在瓊中縣有發(fā)生，但多為零星發(fā)生。（5）藻斑病。常造成下層葉片衰弱，葉柄、葉片、葉鞘上均長出帶有黃色暈圈的麻點狀小病斑，病斑上?？梢婞S褐色毛氈狀物，易與其他葉斑病區(qū)分。該病為害較小。（6）椰心葉甲。該蟲在陵水、萬寧、瓊海等市（縣）發(fā)生嚴重，可以引起整園甚至局部區(qū)域檳榔園連片枯黃，其為害甚至超過YLD和ALYVD。椰心葉甲主要危害心葉，造成樹冠縮小，心葉甚至植株死亡，對產(chǎn)量影響較大，可通過噴施高效氯氰菊酯、辛硫磷等藥劑或釋放天敵寄生蜂（椰甲截脈姬小峰和椰心葉甲嚙小峰）進行有效防治。（7）干旱和寒害。干旱可季節(jié)性地引起局部或大范圍檳榔園葉片因缺水而失綠變黃，多表現(xiàn)在下層葉片。干旱對于新定植的1～2 a的幼樹甚至成齡樹影響較大，若不及時灌水，達到一定極限后下部1～2片葉常在一周至幾周內(nèi)快速干枯、死亡。干旱造成的黃葉癥狀可通過灌水措施得到緩解、恢復，無灌溉條件時到雨季也可逐漸恢復健康綠色狀態(tài)。海南每年5—8月為高溫干旱季節(jié)，干旱通常是對全島范圍內(nèi)的檳榔均有影響，不具發(fā)病中心的特點。寒害多發(fā)生于1月或12月，持續(xù)數(shù)天低溫（通常是低于10℃）天氣會引發(fā)寒害。2021年1月海南遭遇低溫（1月13日瓊中縣黎母山鎮(zhèn)監(jiān)測到-0.3℃低溫），全島西至澄邁、南到三亞的檳榔均有寒害發(fā)生。初期癥狀表現(xiàn)為葉片出現(xiàn)褪綠、干枯病斑，此后葉片呈淡綠至淺黃色。調(diào)查發(fā)現(xiàn)萬寧、瓊海、定安等地大面積檳榔受寒害影響葉片變黃情況較普遍，至4月初才逐漸恢復。臺風也有一定影響，除了對檳榔葉片直接傷害外，還表現(xiàn)在引起檳榔細菌性葉斑病的爆發(fā)以及造成椰心葉甲大面積擴散。此外，水害漚根也會引起葉片變黃，多見于地勢低洼、排水不良的檳榔園。（8）生理性缺素及肥害。生理性黃化多見于管理不善或失管檳榔園，表現(xiàn)為全園植株樹勢衰弱，全株葉片因營養(yǎng)不良表現(xiàn)為淺綠色，略帶黃色。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，剛定植1～2 a幼樹有時也會出現(xiàn)生理性黃化的情況。肥害多發(fā)生于集中過量施用硝酸鉀、硫酸鉀、氯化鉀等化學肥料或未腐熟的牛糞、羊糞、豬糞等有機肥^[45]，導致燒根從而引起下層葉尖、葉緣失綠變黃，葉尖多變褐枯死。生理性缺素或肥害引起的黃化無發(fā)病中心。楊旭光等^[47]研究表明檳榔園水肥供施情況和土壤中養(yǎng)分狀況與檳榔黃化病的發(fā)生無必然聯(lián)系。（9）除草劑藥害。除草劑問題是在2013年前后才引起注意和重視的。筆者調(diào)查發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)上常用草甘膦等滅生性除草劑，造成地表根系變褐壞死，葉片褪綠變黃、枯死，最后整株枯死。吳童童等^[46]發(fā)現(xiàn)在生產(chǎn)中除草劑使用非常普遍，且除草劑使用歷史越長、頻率越高時，園中檳榔長勢越差。除草劑雖與檳榔園黃化有一定相關性，但其引起的黃化不具備發(fā)病中心的特點。綜上，生產(chǎn)上引起檳榔黃化的因素盡管較多，且多個因子常同時并存于黃化檳榔園，通過綜合考慮田間癥狀、病蟲害發(fā)生歷史、種苗來源、水肥管理及除草劑施用等情況，通?？梢詤^(qū)分YLD（和/或ALYVD）與其他因素引起的黃化。YLD與ALYVD則需綜合考慮田間癥狀并結合分子檢測結果進行區(qū)分。DA667E26-CCFB-4AE7-805F-E2D72A702372

迄今，已基本理清YLD和ALYVD與其他8類因子的“黃化”癥狀，筆者認為對各種因子引起的“檳榔黃化現(xiàn)象”進行澄清，解析檳榔黃化病本質(zhì)的時機已日趨成熟。鑒于YLD和ALYVD分布廣泛、造成的損失嚴重、防控難度大、社會關注程度高，建議今后將這2種致黃關鍵病害作為核心對象進行重點防控。

1.5新的科學問題及今后的攻關重點

新病害ALYVD的發(fā)現(xiàn)拓寬了對老病害YLD的認識，也提出了新的科學問題：（1）YLD和ALYVD的癥狀區(qū)別表現(xiàn)在哪些方面？（2）YLD和ALYVD病害的流行規(guī)律如何？（3）YLD和ALYVD病害是如何傳播的？（4）YLD和ALYVD病害致黃機理存在哪些異同？

針對檳榔黃化病，現(xiàn)階段需要聚焦的攻關重點有3個。（1）現(xiàn)有的檢測技術各有不足。例如改進的巢式PCR方法靈敏度依然偏低且費時費力;雖然LAMP靈敏、快速（約3 h即可獲得檢測結果）、結果可視化，但技術操作過程中需格外避免污染的問題;ddPCR靈敏度極高但檢測儀器昂貴且成本偏高（1個樣品3次重復平均檢測費用為240～250元;巢式PCR為1.8～2.0元;LAMP為25～100元。美國和日本試劑價格差異較大，筆者注），故LAMP和ddPCR這2種方法并未用于高通量檢測工作。因此，需繼續(xù)研發(fā)其他檢測方法，對不同檢測方法進行對比和評價，進而篩選出1～2種靈敏、高效的檢測方法是亟需攻關的重點。（2）雖然對YLD和ALYVD的癥狀進行了初步區(qū)分，但還需重點對這2種病害癥狀的擴展情況進行細致觀察，進一步明確其癥狀和流行規(guī)律的異同。（3）植原體是一類通過媒介昆蟲傳播的病原菌^[48]，一旦確認YLD的媒介昆蟲并研發(fā)相應防治技術可為檳榔黃化病的防控提供有力支撐。目前，已在柑橘棘粉蚧等6種刺吸式口器昆蟲體內(nèi)檢測到AYLP^[49]。因此，加快疑似媒介昆蟲接種驗證、傳毒特征研究，并開展防治技術研究也是當前的攻關重點。

2 ?檳榔黃化病和檳榔黃葉病毒病的防控

迄今，檳榔黃化病和檳榔黃葉病毒病2種病害流行規(guī)律、監(jiān)測以及防控方面的進展更多地來自前者（如病害監(jiān)測和防控實踐^[50]）。然而，受廣大農(nóng)戶對檳榔黃化病認知、檳榔價格持續(xù)處于高位等方面的影響，此前一些學者提出的YLD防控措施（如砍除病株）在實際生產(chǎn)中實施的并不多，全省僅有三亞市組織實施了砍除病株的措施^[51]。同時，ALYVD的發(fā)現(xiàn)也大大增加了防控難度。因此，有必要重新梳理YLD和ALYVD?2種致黃關鍵病害的基礎資料并制定針對性的防控策略和措施。

2.1 防控形勢緊迫

從1995年金開璇等^[3]最早提出植原體（即類菌原體MLO）與黃化型YLD有關開始，20多年以來YLD（包括ALYVD）并未得到有效控制，甚至不斷蔓延危害，發(fā)生范圍、面積逐步擴大，病情日趨嚴重。海南全省（不含三沙市）調(diào)查結果表明，由AYLP和APV1引起的檳榔黃化面積為4.00～5.33萬hm²（尚未發(fā)表），若任由其繼續(xù)擴散蔓延，將會給海南經(jīng)濟、社會及生態(tài)帶來難以估量的損失。與此同時，生產(chǎn)上還缺乏一套公認的、能夠科學指導防控檳榔黃化病和檳榔黃葉毒病的指南。鑒于此，筆者團隊結合近年來的科研成果編寫了《檳榔“黃化病”防控明白紙》（此處檳榔“黃化病”指黃化病和黃葉病毒病，下同。為了便于廣大檳榔種植戶的理解和接受，《明白紙》未對YLD和ALYVD進行區(qū)分）?！睹靼准垺烦浞纸梃b了柑橘黃龍病^[52]、椰子致死性黃化病^{[48， 53]}、棗瘋病^[54-55]、葡萄金黃化病^[46]等類似病害的防控措施（表2），根據(jù)植保領域專家學者、一線農(nóng)技人員提出的建議進行完善，于2020年9月在萬寧市正式向各市（縣）農(nóng)技人員和廣大檳榔種植戶推介，得到了廣泛關注。

2.2 《明白紙》解讀

《明白紙》提綱挈領地介紹了檳榔“黃化病”病原、癥狀、危害等級、傳播途徑，確

立了“預防為主、分類防控”的策略，并提出了綜合防控措施?！睹靼准垺返闹朴喤c推介實施是檳榔黃化病和黃葉病毒病研究和防控中的一個里程碑，以下作簡要解讀。

2.2.1 ?危害等級標準??檳榔園危害等級標準：輕病園，全園發(fā)病率20%以下;中病園，全園發(fā)病率20%～50%;重病園，全園發(fā)病率50%～70%;特重病園，全園發(fā)病率70%以上。這是分類防控策略的依據(jù)。

2.2.2 ?傳播途徑??傳播途徑主要是種苗和媒介昆蟲，這是種植健康種苗、防治介體昆蟲的依據(jù)。

2.2.3 ?檳榔園黃化病3個關鍵預防措施??（1）選用無病種苗，嚴禁從疫區(qū)引進種果和種苗;嚴禁用感病檳榔園的種果進行育苗;嚴禁在感病檳榔園及周邊育苗。（2）檳榔園禁用草甘膦除草劑。（3）不在病園內(nèi)新種幼苗。

2.2.4 ?檳榔園黃化病分類防控措施??（1）針對新建檳榔園，從種苗開始進行預防，種植無病種苗，隔離種植，遠離感病檳榔園，建議間隔至少1 km以上，避免連片種植。（2）針對健康園，以預防為主。加強肥水管理;全面除殺刺吸式口器害蟲，預防病害傳播入園;一旦確認園內(nèi)有植株感染植原體或APV1，做到發(fā)現(xiàn)一株清除一株。（3）針對輕、中和重病檳榔園，控治并舉，采用“五板斧”措施。即，“一養(yǎng)”：加強肥水管理，養(yǎng)根養(yǎng)樹，提高檳榔樹體營養(yǎng)，增強樹勢?！岸T”：誘抗，結合除殺刺吸式口器害蟲，葉面噴施免疫誘抗劑、葉面肥，誘導檳榔產(chǎn)生抗性和提高免疫力?！叭{(diào)”：生態(tài)調(diào)控，通過豐富林間生物多樣性，改善林下微生態(tài)環(huán)境，達到涵養(yǎng)水源、以草（或其他作物）控草甚至增加收入的目的?！八闹巍保壕C合治理，結合免疫誘抗處理對病原及傳播媒介采用化學、物理等防控技術，降低菌源、阻止傳播。“五除”：加強病害管理，清除病葉和病株，減少傳染源。（4）針對特重病園，全園更新。清除全園后，種植其他短期經(jīng)濟作物，至少2 a后再重新種植健康檳榔。DA667E26-CCFB-4AE7-805F-E2D72A702372

《明白紙》充分考慮了以下4個因素：（1）檳榔是一種常綠棕櫚植物，經(jīng)濟壽命可長達30 a;（2）現(xiàn)有的種植管理模式（單一、“懶人”模式）;（3）種植4～5 a后才開始結果，在此期間農(nóng)戶通常一直無收獲回報;（4）染病2～3 a內(nèi)，整園產(chǎn)量通常不會大幅下降，水肥管理好的檳榔園產(chǎn)量會保持一個較高的水平;（5）近年來鮮果價格較高，絕大部分農(nóng)戶尚不愿接受砍除病株的措施，主動砍除病株的農(nóng)戶僅是極少數(shù)。整體而言，對于中、重度發(fā)病檳榔園采取的是一種帶病維持生產(chǎn)的策略。然而，從整個檳榔產(chǎn)業(yè)的長遠發(fā)展來看，病園更新的措施必不可少（參考柑橘黃龍病園更新措施^[7]），否則2種病害仍將持續(xù)擴展，危害繼續(xù)加重。雖然YLD和ALYVD尚無特效防控藥劑，但通過上述綜合防控措施可在一定程度上達到控制病害蔓延、延長檳榔植株經(jīng)濟壽命、提高或維持產(chǎn)量的目的。

2.3 《明白紙》需進一步完善之處及防控中亟待解決的問題

目前，海南全省的YLD和ALYVD防控形勢仍非常緊迫。及時發(fā)布《明白紙》為這2種病害的科學防控提供了指南。然而，目前對這2種病害的了解依然不夠深入，《明白紙》中病害基礎介紹及防控措施的部分內(nèi)容還需進一步完善。如，媒介昆蟲研究尚顯不足。雖然已發(fā)現(xiàn)柑橘棘粉蚧、雙條拂粉蚧可以傳播APV1^[36]，YLD帶“毒”昆蟲方面也有階段性進展^[11]，然而這些昆蟲的交配產(chǎn)卵、種群動態(tài)等生物生態(tài)學特性、傳毒特征以及防治技術等研究尚待開展。這些研究結果將進一步有針對性地補充和完善《明白紙》的基礎知識以及防控目標、防控技術和方法等。

檳榔黃化病和檳榔黃葉病毒病防控中還面臨很多問題，但最根本或亟需解決的問題有3個：（1）轉變主管部門對YLD及ALYVD的防控認識與指導思想。只有充分認識到現(xiàn)有的種植模式及技術措施無法完全根治YLD及ALYVD的事實，才能轉變“治療”“治愈”觀念，形成YLD及ALYVD可防可控不可治的統(tǒng)一認識^[56]，從而牢固樹立“預防為主，分類防控”的戰(zhàn)略指導原則，依照《明白紙》中的措施系統(tǒng)推進防控工作。（2）轉變廣大農(nóng)戶長期以來的檳榔“懶人種植”模式（管理意識淡薄，重種植、輕管理，管理投入不足或幾乎不投入）以及對病害的認知。只有徹底摒除僥幸心理，改變先前“靠天吃飯”的種植模式，加強水、肥、草管理和病蟲害防控，及時清除病株殘體，才能形成有利于檳榔健康生長、YLD及ALYVD防控的條件。（3）建立種子種苗檢疫制度和健康種苗保障體系。近年來海南檳榔種苗市場非常活躍，萬寧等疫區(qū)一些農(nóng)戶留老果育苗的情況較多，多個種苗公司年育苗量達到幾萬甚至幾十萬株。調(diào)查發(fā)現(xiàn)大多未做隔離或預防措施，這些來自疫區(qū)的種苗具有較大的帶“毒”風險，筆者的采樣檢測結果也證實了這一點^[11]。因此，建議加快檳榔種果種苗檢疫制度及健康種苗繁育體系建設，禁止疫區(qū)農(nóng)戶和種苗公司育苗售賣，非疫區(qū)的種苗也需具有檢測資質(zhì)的單位現(xiàn)場抽樣、檢測，獲得健康種苗報告后方可銷售。

3 ?展望

近年來，海南省重大項目團隊在YLD及ALYVD研究上取得階段性進展。在檳榔黃化相關病害方面，明確了2種致黃關鍵病害——YLD和ALYVD，并區(qū)分了這2種病害與其他8類因子的黃化癥狀，對“檳榔黃化現(xiàn)象”說法進行了澄清。在病原檢測方面，針對YLD和ALYVD研發(fā)了可供病害早期診斷的靈敏、高效、快速的檢測新方法，后續(xù)有望開發(fā)出可用于田間檢測的方法和產(chǎn)品。在傳播途徑和防控方面，筆者發(fā)現(xiàn)來自萬寧等疫區(qū)的部分種苗有AYLP和/或APV1感染（尚未發(fā)表），為種苗檢疫措施的實施提供了依據(jù)。同時，在萬寧、定安2個病園遺留的檳榔老果組織DNA樣品中檢測到AYLP^[32]，若證實帶“毒”種果育出的種苗同樣帶有AYLP和/或APV1，則將進一步研究種苗脫毒或組培脫毒，為健康種苗供應、病害防控提供保障。此外，YLD帶“毒”昆蟲^[11]及ALYVD媒介昆蟲^[36]方面的研究也有一定進展，后續(xù)研發(fā)的防治技術將進一步提高這2種病害傳播媒介的防治效果?？傊A期5～10 a內(nèi)在YLD及ALYVD病原檢測、種苗脫毒、媒介昆蟲防治方面有望獲得突破，《明白紙》的不斷完善也將進一步發(fā)揮對YLD及ALYVD防控的指導作用。

近10?a來，檳榔致黃關鍵病害YLD及ALYVD危害逐年加重，發(fā)病面積不斷擴大，現(xiàn)已給海南檳榔產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展和農(nóng)民增收帶來了嚴峻考驗，其科研攻關和有效防控需要從“產(chǎn)學研推用”多個層面協(xié)調(diào)進行^[57]，通過政府指導與專項資金支持（科研資助、重病園更新及帶毒種苗銷毀補償?shù)龋⒖蒲袡C構重點攻關、企業(yè)技術推廣、農(nóng)戶依據(jù)《明白紙》的措施積極加強管理和病蟲害防控，YLD及ALYVD引發(fā)的檳榔黃化問題將得到有效控制，以保障檳榔產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。

致謝??感謝海南大學黃惜教授團隊在示范基地病樣APV1檢測工作中的幫助與支持。

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