顧順心，姜 琴，施鵬飛

(江蘇海洋大學 環(huán)境與化學工程學院，江蘇 連云港 222005)

藥物治療是目前臨床治療腫瘤的重要手段之一，開發(fā)具有獨特療效的抗腫瘤藥物一直是藥物研發(fā)領域的熱點。順鉑(CDDP)是最早臨床應用的金屬抗腫瘤藥物[1]，該藥物因具有廣譜抗腫瘤活性和高治愈率而在多種癌癥治療中表現不俗[2-4]，特別是針對睪丸癌的治療，它使睪丸癌患者的死亡率從100%降到10%以下[5]。但順鉑類藥物也存在嚴重的毒副作用[6]，且容易產生耐藥性、水溶性小、在體內不易代謝，因此迫切需要開發(fā)新型金屬抗腫瘤替代藥物,以減少鉑類藥物毒副作用和交叉耐藥性帶來的問題。

很多銥(Ⅲ)配合物因具有較強的細胞滲透能力以及獨特的抗腫瘤活性，而引起生物醫(yī)藥領域研究人員的廣泛關注[7-9]。不僅如此，銥(Ⅲ)配合物還表現出優(yōu)異的發(fā)光性能，包括激發(fā)/發(fā)射波長易于調節(jié)、量子產率高、斯托克斯位移值大、發(fā)光壽命長、光穩(wěn)定性好等特點，使其在發(fā)光材料研究領域也備受青睞[10-11]。鑒于發(fā)光銥(Ⅲ)配合物所具有的光學特性，可采用激光共聚焦顯微鏡來追蹤其在腫瘤組織內的攝入、分布與代謝狀態(tài)，這將有助于研究者明確銥(Ⅲ)配合物抗腫瘤的靶分子與作用機理。另外，部分配合物在光激發(fā)下還可在腫瘤細胞內誘導生成具有強氧化性能的活性氧(ROS)物種，導致細胞壞死或凋亡。目前發(fā)光銥(Ⅲ)配合物已經作為一類非常有潛力的腫瘤光動力學治療的光敏劑[12]而被廣泛研究。

Ye等[13]的研究表明，Ir(Ⅲ)配合物對多種癌細胞表現出強抗增殖活性(強于順鉑類藥物)，甚至對順鉑耐藥細胞株也有很好的藥效；該配合物具有強磷光發(fā)射性能，利用激光共聚焦顯微成像技術發(fā)現配合物能夠有效地滲透到Hela細胞中；對線粒體的形態(tài)進行實時監(jiān)控發(fā)現，配合物能誘導線粒體損傷從而殺死癌細胞。Yang等[14]研究表明，半三明治型Ir(Ⅲ)配合物對A549細胞表現出良好的抗癌活性(IC50=4.7 μmol/L)，該配合物能靶向并破壞A549細胞的溶酶體，從而導致細胞死亡。Liu等[15]研究表明環(huán)金屬化銥配合物具有雙重(轉移抑制和溶酶體損傷)抗癌機制：配合物通過血清白蛋白及靜電力猝滅機制進行運輸，且能有效地阻止癌細胞的轉移，擾亂細胞周期G0/G1期，從而誘導細胞凋亡；配合物通過能量依賴性細胞攝取機制，有效積累在溶酶體中，誘導溶酶體損傷，最終導致細胞死亡。Liu等[16]將四苯乙烯基團引入Ir(Ⅲ)配位單元，得到的系列配合物對癌細胞和正常細胞具有一定的選擇性；不同結構的配合物其抗腫瘤機制有所不同：部分配合物不僅可以催化NADH轉變?yōu)镹AD+，還可以誘導ROS富集。Lu等[17]報道了末端含芘基團的雙核三聯吡啶銥配合物，該配合物表現出強光毒性和相對較弱的暗毒性；配合物能在細胞內生成ROS，導致肺癌細胞A549和人皮膚癌細胞A431的線粒體和溶酶體功能損傷，以細胞凋亡的方式促使細胞壞死。Kuang等[18]報道了一種以蒽醌三聯吡啶衍生物作為主配體的Ir(Ⅲ)配合物，該配合物在雙光子PDT治療厭氧腫瘤方面具有非常良好的應用前景。該配合物在缺氧條件下經還原酶還原后，發(fā)光性能顯著增強，且在近紅外雙光子光激發(fā)下具有很高的穩(wěn)定性；輻照后，配合物可以誘導產生碳自由基，促進線粒體膜電位降低與細胞死亡(光激發(fā)下IC50=2.1 μmol/L, 黑暗中IC50=58.2 μmol/L,PI=27.7)；體內有A549癌細胞的雄性小鼠注射給藥后，經雙光子激發(fā)照射(730 nm, 50 mW, 1 kHz, 脈沖寬35 fs, 5 s/mm)，2 d后小鼠體重沒有明顯變化，14 d后小鼠體內的腫瘤組織顯著減小。Pracharova等[19]報道的配合物對順鉑耐藥的腫瘤細胞表現出一定的生長抑制活性；研究發(fā)現，抗腫瘤活性并非基于DNA損傷，而是通過優(yōu)先靶向內質網并抑制蛋白翻譯過程從而殺死腫瘤細胞；配合物表現出良好的PDT活性，可見光照可使IC50值降低兩個數量級。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

本文中未特別指明的化學品都來源于商業(yè)采購并直接使用，小牛胸腺DNA(ct-DNA)和牛血清蛋白(BSA)從Sigma-Aldrich公司購買。所有合成的化合物均在真空干燥器(CaSO4)中干燥后再進行結構表征。核磁數據(1H NMR)采用500 MHz Bruker DMX采集，利用四甲基硅烷(TMS)做內標。質譜數據用Agilent 1290-6545 LC/MS質譜儀采集。紫外-可見吸收光譜用UV-3100記錄，熒光光譜用Hitachi F-7000記錄。ct-DNA的濃度用紫外光譜標定(ε260 nm=6 600 L/(mol·cm))。在Tris-HCl的緩沖溶液中(pH=7.42)，260 nm和280 nm處紫外吸光度的比值為1.87，表明DNA中已完全去除了蛋白質雜質。稱取一定量牛血清蛋白BSA，用Tris-HCl緩沖液溶解，配制濃度為2×10-4mol/L的儲備液，置于4 ℃保存。

1.2 合成與表征

NNC配體及其Ir(Ⅲ)配合物合成路線見圖1。

圖1 NNC配體及其Ir(Ⅲ)配合物的合成路線

1.2.1N,N-二羥乙基苯甲醛的合成與表征 將52 gN,N-二(2-羥乙基)苯胺溶于70 g吡啶中，加入90 g乙酸酐后在90 ℃下攪拌24 h，冷卻至室溫，用400 mL水洗滌后用200 mL乙酸乙脂萃取。乙酸乙酯溶液用無水硫酸鎂干燥，減壓蒸除溶劑，得油狀物N,N-二乙酸乙酯基苯胺(化合物a)。1H NMR(CDCl3，500 MHz),δ:7.2(2H)，6.8(3H)，4.3(4H)，3.6(4H)，2.1(6H)。

將40 g POCl3在0 ℃攪拌滴入50 mL DMF中，溶液變?yōu)榈t色油狀物。0 ℃繼續(xù)攪拌15 min后，將50 gN,N-二乙酸乙酯基苯胺溶于30 mL 1,2-二氯乙烷并滴入淡紅色油狀物中，滴完后升溫至90 ℃，攪拌3 h得墨綠色混合溶液。冷至室溫后，倒入碎冰中攪拌，用質量分數30%的K2CO3溶液將溶液pH調節(jié)至6～8，得到黃色固體N,N-二乙酸乙酯基苯甲醛(化合物b)。1H NMR(CDCl3,500 MHz)，δ:9.6(1H)，7.7(2H)，6.8(2H)，4.2(4H)，3.6(4H)，2.0(6H)。

取15 gN,N-二乙酸乙酯基苯甲醛溶解于含有12.5 g氫氧化鈉的250 mL乙醇水溶液(乙醇與水體積比為175∶75)中，攪拌7 h后用稀鹽酸(4 mol/L)調節(jié)pH至8～9。將溶液蒸干后用乙酸乙酯洗滌3遍，蒸除乙酸乙酯，得黃色油狀固體。柱層析(硅膠柱，展開劑為體積比1∶1的乙酸乙酯和石油醚)后得到黃色粉末N,N-二羥乙基苯甲醛(化合物c)，產率90%。1H NMR(CDCl3，500 MHz)，δ:9.65(1H)，7.71(2H)，6.71(2H)，3.91(5H)。

1.2.2 配體PhbpyOH的合成與表征 將2.9 g(14 mmol)N,N-二羥乙基苯甲醛、1.68 g(14 mmol)苯乙酮和2.24 g(56 mmol)質量分數10%的NaOH水溶液在常溫下攪拌12 h后，用二氯甲烷萃取，無水硫酸鎂干燥后，旋蒸去除溶劑，得到2.2 g紅色油狀物(化合物d)，產率為50.57%。

將11.8 g(50 mmol)I2溶于72 mL吡啶中，加熱到60 ℃至完全溶解，再加入7.1 g(58.7 mmol)2-乙?；拎?，升溫至95 ℃，反應3 h，靜置冷卻后析出固體。將固體濾出后用CH2Cl2洗滌，得到7.28 g灰色固體吡啶嗡鹽(化合物e)，產率44.7%。

將2.2 g(7 mmol)化合物d和2.3 g(7 mmol)化合物e溶于100 mL甲醇，回流反應30 min后分3批加入3.27 g NH4Ac，繼續(xù)回流24 h后靜置冷卻，用乙酸乙酯萃取后干燥，旋蒸除去溶劑得棕色油狀物。柱層析(硅膠柱，展開劑為體積比4∶1的乙酸乙酯和石油醚)后得到黃色粉末(化合物PhbpyOH)，產率為14%。1H NMR(CDCl3，500 MHz)，δ:8.70(t，1H)，8.67(d，1H)，8.57(d，1H)，8.20(d，2H)，7.93(d，1H)，7.88(td，1H)，7.74(d，2H)，7.47(t，1H)，7.38～7.31(m，1H)，6.77(d，2H)，4.17～3.96(m，2H)，3.88(t，4H)，3.64(t，4H)。

1.2.3 配合物Ir-NNC的合成與表征 將397 mg(2.56 mmol)的2-苯基吡啶、764 mg(1.28 mmol)的三氯化銥水合物和20 mL乙二醇水溶液(V(乙二醇)∶V(水)=3∶1)的混合溶液置于Schlenk管中，N2保護下120 ℃加熱回流24 h。反應結束后冷卻至室溫析出沉淀，離心過濾得到黃色粉末，依次用水(3×20 mL)、乙醇(3×10 mL)和乙醚(3×10 mL)分別洗滌，真空干燥后得到543.8 mg[Ir(bpy)2Cl]2(化合物f)。

將100 mg(0.093 mmol)化合物f和76.57 mg(0.186 mmol)PhbpyOH溶于30 mL二氯甲烷與甲醇的混合溶液(V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=1∶1)中，65 ℃下回流反應24 h，全程N2保護且避光處理。反應結束后減壓蒸除溶劑，得到橙色固體。將橙色固體溶于30 mL水中，加入150 mg NH4PF6固體后繼續(xù)攪拌30 min，過濾收集橙色沉淀物，依次用水(3×20 mL)、乙醇(3×10 mL)和乙醚(10 mL)洗滌，真空干燥后得到橙色粉末(化合物Ir-NNC)72.4 mg，產率為37.2%。表征結果為1H NMR(d6-丙酮，500 MHz)，δ：9.07(d，1H)，9.03(d，1H)，8.28(td，J=8.1 Hz，1H)，8.11(dd，J=8.5 Hz,2H)，8.01(ddd，5H)，7.93(td，J=7.9 Hz，1H)，7.76(d，1H)，7.70(dd，1H)，7.65～7.59(m，1H)，7.41～7.36(m，1H)，7.27(ddd，1H)，7.23～7.17(m，1H)，7.01～6.94(m，3H)，6.92(td，1H)，6.86～6.60(m，5H)，6.58～6.53(m，1H)，6.35(td，1H)，6.02(dd，1H)，5.65(dd，1H)，4.23(t，2H)，3.89～3.73(m，4H)，3.70(t，4H)。ESI-MS(+p)，m/z=912.289 1,可指認為[Ir(ppy)2PhbpyOH]+的分子離子峰。

1.3 單晶結構分析

配體PhbpyOH的單晶通過其在溶劑(V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶1)中緩慢揮發(fā)得到。選取表面光滑、無裂紋、大小合適的單晶，置于帶有石墨單色器的Bruker APEX CCD X-ray衍射儀上，于296 K下使用MoKα(k=0.071 073 nm)射線收集衍射數據，使用Bruker APEX2[20]和Bruker SAINT[21]程序進行衍射數據的收集和還原。使用Olex2[22]軟件進行晶體解析。Olex2.Solve程序對配體PhbpyOH晶體結構進行初解, 并使用SHELXTL-2018[23]程序對晶體結構進行精修獲得非氫原子坐標和各向異性參數，氫原子由理論計算方法得到。CCDC:2125620。

1.4 DFT理論計算

配體和配合物的DFT計算采用Gaussian 09程序包進行，利用B3LYP密度泛函理論對分子結構進行了優(yōu)化。在基態(tài)和激發(fā)態(tài)優(yōu)化的基礎上，運用TDDFT方法研究了激發(fā)態(tài)的電子性質。在計算過程中，配體的所有原子采用 6-31g(d)基組，配合物采用了6-31g(d)(H，O，N，C)/LANL2DZ(Ir)混合基組。

1.5 單線態(tài)氧量子產率

在體外使用9,10-蒽二基-二(亞甲基)二丙二酸ABDA作為1O2指示劑,用功率為6 W的紫外燈在365 nm處激發(fā)配合物Ir-NNC(初始濃度為10 μmol/L)的乙腈溶液,每間隔10 s記錄一次ABDA的吸光度(418 nm處)。采用不含配合物的ABDA的乙腈溶液作為對照試驗，采用Ru(bpy)3Cl2(ΦΔ=0.56)敏化ABDA為參考，計算Ir-NNC敏化ABDA的量子產率。量子產率計算公式為

其中：sam表示配合物Ir-NNC；std表示Ru(bpy)3Cl2；S表示ABDA吸光度圖的斜率；F表示吸收校正因子，F=1-10-OD(OD為Ru(bpy)3Cl2和配合物的光密度)。

1.6 雙光子熒光光譜

雙光子激發(fā)熒光光譜使用鎖模鈦寶石激光器(Coherent Mira900F)作為激發(fā)光源，脈沖持續(xù)時間200 fs，重復頻率76 MHz，采用單掃描條紋相機(Hamamastu C5680-01)及單色儀記錄雙光子熒光信號。樣品溶于DMSO，濃度1.0×10-3mol/L。

1.7 與DNA和BSA相互作用的分子模擬

采用Autodock程序對配合物與DNA(或BSA)之間的相互結合進行模擬。Ir-NNC的結構通過DFT(B3LYP)方法優(yōu)化得到，DNA(PDB ID 1BNA)和BSA(PDB ID 4f5sBSA)的分子結構從蛋白質數據庫中獲得(http://www.rcsb.org/pdb)。在建模時，DNA-Ir-NNC的網格盒大小為6.8 nm×7.6 nm×12.6 nm，網格間距為0.037 5 nm。BSA-Ir-NNC的網格盒大小為15.0 nm×6.6 nm×10.4 nm，網格間距為0.1 nm。運用拉馬克遺傳算法(LGA)計算結合在DNA/BSA上的Ir-NNC可能出現的構象，進行100次GA運算，其他參數使用默認值。利用Pymol軟件分析結合自由能最低的構象的對接結果。

2 結果與討論

2.1 配體與配合物的結構

配體分子的X-ray單晶衍射結構如圖2a所示，配合物經DFT優(yōu)化的結構如圖2b所示。

從圖2a可以看出，純配體PhbpyOH中的兩個吡啶環(huán)與苯環(huán)具有一定的共平面性，最大偏差為24.63°。而在配合物Ir-NNC中，由于配位中心的位阻效應，PhbpyOH中的苯環(huán)平面與聯吡啶平面的夾角增大，達到74.75°。從Ir-NNC的DFT優(yōu)化的結構(圖2b)可以看出，PhbpyOH中的苯環(huán)沒有參與配位，這與質譜結果是一致的。Ir(Ⅲ)配位中心采取畸變的正八面體結構，其中的Ir—N鍵長與文獻[24]報道的結果接近。

a 配體的單晶衍射結構

2.2 配體與配合物的吸收光譜

配體和配合物的紫外-可見吸收光譜見圖3。配體PhbpyOH在250～400 nm范圍內呈現出3個吸收帶，分別是不同共軛體系之間的π→π*躍遷所致。配合物中n→π躍遷的吸收帶的強度明顯增加且發(fā)生了一定的紅移。與Ir(Ⅲ)配位后，配體PhbpyOH中的π→π*躍遷強度顯著降低，且配合物在415 nm處新出現一個強吸收峰，可歸屬為金屬到配體的荷移躍遷(MLCT)。

圖3 配體和配合物的紫外-可見吸收光譜

為了進一步明確配體和配合物中激發(fā)態(tài)的能級與結構，采用TDDFT進行了結構優(yōu)化和分子軌道能量計算，結果如圖4所示。PhbpyOH的HOMO軌道電子云主要集中在N,N-(2羥乙基)氨基、苯基、多聯吡啶基團的中心吡啶環(huán)區(qū)域內，LUMO軌道電子云主要集中在聯吡啶部位，分子中的N,N-(2羥乙基)氨基是強給電子基團，而聯吡啶基團起到吸電子的作用，這種D-π-A結構有利于分子內的電荷轉移。結合上述紫外-可見吸收光譜圖可知，261 nm處的吸收帶可歸屬于多吡啶基團的π→π*的躍遷吸收(HOMO-1→LUMO)，而345 nm處的吸收帶則歸屬于配體整個分子的π→π*躍遷吸收(HOMO→LUMO)。在配合物Ir-NNC中，HOMO軌道電子云主要集中在PhbpyOH的聯吡啶區(qū)域上，HOMO-2軌道電子云主要集中在PhbpyOH的N,N-(2羥乙基)氨基、苯基基團上，而LUMO軌道電子云主要集中在苯基吡啶Ir(Ⅲ)配位單元上，HOMO→LUMO表現出明顯的MLCT特性。

圖4 配體和銥配合物的分子軌道

2.3 配體與配合物的單、雙光子發(fā)射光譜

配體PhbpyOH和配合物Ir-NNC在多種溶劑中都呈現出較強的熒光發(fā)射，如圖5所示。對比化合物在不同極性的溶劑中的熒光發(fā)射峰，發(fā)現它們都呈現明顯的溶致變色現象，表明配體和配合物的激發(fā)態(tài)都具有一定的極性且都呈現出電荷轉移發(fā)光。溶劑極性的增加促使溶劑分子與溶質分子的偶極—偶極相互作用增強，使激發(fā)態(tài)的能量降低，造成熒光光譜發(fā)生紅移。與配體PhbpyOH(λem=518 nm，DMSO)比較，在同一溶劑中配合物Ir-NNC(λem=621 nm，DMSO)的最大熒光發(fā)射波長發(fā)生了明顯的紅移，而且熒光發(fā)射強度降低約1/2。表明Ir(Ⅲ)的配位對配體的電子云結構產生了巨大的影響。

a 配體

不僅如此，配體和配合物在760 nm的飛秒激光激發(fā)下，還表現出雙光子激發(fā)熒光效應(TPEF)，如圖6所示。相同的測試條件下，配合物Ir-NNC在DMSO溶液中的雙光子激發(fā)熒光相較配體PhbpyOH的峰值紅移約40 nm，但發(fā)光強度要明顯弱于PhbpyOH。配體PhbpyOH在DMSO中的最大TPEF發(fā)射波長位于528 nm，與其在DMSO中的單光子激發(fā)熒光(OPEF)相比，紅移了約10 nm，這主要是由于在TPEF測量時樣品濃度遠大于OPEF的(約為150倍)，造成了熒光的再吸收作用所致[25]。配合物Ir-NNC的TPEF峰位于567 nm處，其相對于OPEF譜帶的峰藍移了50 nm，說明單光子激發(fā)與雙光子激發(fā)具有不同的激發(fā)態(tài)能級和結構。TPEF來源于能級更高的單線態(tài)激發(fā)態(tài)1MLCT，而OPEF則源自低能級的三線態(tài)激發(fā)態(tài)3MLCT。

a 配體

2.4 與DNA和BSA的相互作用

研究發(fā)現,大多數銥配合物的抗腫瘤作用都是通過光誘導產生具有細胞毒性的1O2，從而殺死腫瘤細胞[17]。使用ABDA作為1O2指示劑并以Ru(bpy)3Cl2為參照，測試了配合物Ir-NNC的相對1O2量子產率。隨著光照時間的增加，含有Ir-NNC的ABDA溶液的吸光度呈現出一定的下降趨勢，這表明在體外銥配合物Ir-NNC可在光照下誘導生成1O2，其量子產率約為0.1。

臨床使用的許多抗癌藥物都以DNA為作用靶點，它們與DNA的相互結合可引起DNA復制障礙，從而抑制癌細胞的分裂[26]。研究銥配合物與DNA分子的相互作用，對于明確其抗腫瘤的生物靶分子具有重要意義。由圖7a可以看出，隨著ct-DNA濃度逐漸增加，Ir-NNC的紫外-可見吸收光譜表現出明顯的減色效應，但并無明顯的紅移效應，說明配合物不是通過嵌入作用與DNA結合[27]。而當配合物結合到DNA的溝區(qū)時，僅出現減色效應，可能是配合物的發(fā)色團被DNA的堿基覆蓋所導致[28]。

血清白蛋白是血漿中含量最為豐富的載體蛋白，能與進入血液中的大多數內源性和外源性化合物結合，從而在體內起到存儲和轉運的作用。研究銥配合物與血清蛋白之間的相互作用[29]，有助于了解配合物在體內的運輸和分布情況，對于闡明銥配合物抗腫瘤的作用機制具有重要意義。由圖7b可知，隨著BSA濃度逐漸增加，275 nm處的吸收峰出現增色效應，這是BSA分子中色氨酸和酪氨酸的特征吸收峰所致。在300 nm和425 nm處配合物的紫外-可見光譜吸收峰均表現出明顯的減色和紅移現象，并在297 nm出現等吸收點，表明配合物Ir-NNC可結合到BSA上并形成Ir-NNC-BSA復合物。

a DNA

Dock分子建模法是用于探索小分子與生物大分子的結合位點和結合能的一項重要技術[30-31]。為了進一步明確Ir-NNC與DNA和BSA的結合位點，本文利用Autodock模擬了配合物與DNA和BSA之間的相互作用。對接結果表明，銥(Ⅲ)配合物Ir-NNC進入DNA的小溝區(qū)而不是插入DNA堿基對之間(這與紫外滴定的結果一致)，結合自由能為-20.75 J/mol。如圖8a所示，Ir-NNC的2個羥乙基與DNA行成4個氫鍵，分別是H92與DNA的DC-15(0.21 nm)，H97與DT-8(0.24 nm)，DG-16(0.20 nm)，O56與DC-9(0.24 nm)。由圖8b可以看出，Ir-NNC在BSA中的結合位置為ⅠB亞結構域，該結合自由能為-14.98 J/mol。圖8c可知，Ir-NNC的H97和H92分別與氨基酸殘基ASP-118(0.25 nm)和GLU-125(0.19 nm,0.27 nm)形成了3個氫鍵。氫鍵的存在可以穩(wěn)定復合物Ir-NNC-BSA的結構。

a 與雙螺旋DNA的對接(單位：?)

3 結論