謝九艷，趙婷，高逸，辛迪，馮會粉，李宏，姚粟*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京，100015)2(中國合格評定國家認可中心，北京，100062)

發(fā)酵乳是以生牛(羊)乳或乳粉為原料，經(jīng)殺菌、發(fā)酵后制成的pH值降低的產(chǎn)品。與傳統(tǒng)發(fā)酵不同，發(fā)酵乳通過添加嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種等乳酸菌作為發(fā)酵劑加快發(fā)酵乳的發(fā)酵過程[1]。乳酸菌對人體的健康有很多益處，有助于增加腸道微生物的定植，治療和預防腹瀉、緩解便秘、增強人體的的免疫力等[2-3]，但是乳酸菌需要達到一定數(shù)量才能起到保健作用，因此發(fā)酵乳中的活菌數(shù)尤其重要。為保證足夠數(shù)量活的益生菌到達腸道中，GB 19302、ISO 27205等國內(nèi)外相關機構規(guī)定，發(fā)酵乳中益生菌的數(shù)量不得少于106CFU/mL[4]。近年來發(fā)酵乳產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，為提升發(fā)酵乳的品質(zhì)，乳桿菌、雙歧桿菌等益生菌加入發(fā)酵乳中以增加產(chǎn)品的芳香味道和保健功能等[1]，因此需要簡單、可靠的方法來確保商業(yè)發(fā)酵乳中發(fā)酵劑微生物和功能性微生物的含量，以保證產(chǎn)品的質(zhì)量。

目前對于發(fā)酵乳中乳酸菌活菌數(shù)的檢測主要包括分子生物學定量分析方法、丙二醇甲醚醋酸酯/疊氮溴化乙錠結合實時定量等非培養(yǎng)方法，以及傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法。非培養(yǎng)方法是以乳酸菌的基因組核酸序列或細胞中的活菌數(shù)為基礎的鑒別方法，往往對儀器設備具有較高的要求[5]。傳統(tǒng)培養(yǎng)方法是基于乳酸菌的理化特性，實現(xiàn)對乳酸菌的選擇性分離，操作簡便、設備依賴度低，適于廣泛推廣應用[3-6]。但是目前傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，往往存在培養(yǎng)基選擇性差、計數(shù)結果不準確等問題。因此根據(jù)不同乳酸菌的特性優(yōu)化選擇性培養(yǎng)基，結合菌種鑒定技術，實現(xiàn)發(fā)酵乳中乳酸菌的種水平活菌計數(shù)具有重要意義。

本文主要聚焦市售發(fā)酵乳中常用的乳酸菌組合，通過驗證和比較國內(nèi)外標準、文獻中選擇性培養(yǎng)基的選擇性，并采用快速鑒定、形態(tài)學特征、生理生化和分子生物學特征等方法確定復合菌發(fā)酵乳中的不同種類乳酸菌的活菌數(shù)，為復合菌發(fā)酵乳產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供技術參考。同時為政府監(jiān)管、行業(yè)標準法規(guī)制定提供技術支撐，對乳酸菌在乳品行業(yè)更加安全和廣泛的應用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵乳產(chǎn)品

3種代表性的不同品牌發(fā)酵乳產(chǎn)品A、B、C購于北京大型超市，產(chǎn)品中標識菌株類別及活菌數(shù)如下：

樣品1：品牌A(標識：保加利亞乳桿菌，嗜熱鏈球菌，干酪乳桿菌，乳酸菌活菌數(shù)≥1×106CFU/g);

樣品2：品牌B (標識：動物雙歧桿菌BB-12，嗜熱鏈球菌，德氏乳桿菌保加利亞亞種，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌總數(shù)1×106CFU/g);

樣品3：品牌C(標識：乳雙歧桿菌BL99，嗜熱鏈球菌，保加利亞乳桿菌，乳雙歧桿菌的≥1×106CFU/g)。

1.2 試劑與儀器

M17培養(yǎng)基，青島海博生物技術股份有限公司；Chalmers(MC)培養(yǎng)基、De Man Rogosa Sharpe(MRS)培養(yǎng)基(BD)、莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽，北京陸橋技術股份有限公司；萬古霉素鹽酸鹽，國藥集團。

拍擊式均質(zhì)器，法國 interscience 公司；pH計，梅特勒托利多儀器有限公司；厭氧產(chǎn)氣袋，日本三菱 MGC。

1.3 實驗方法

1.3.1 選擇性培養(yǎng)基活菌計數(shù)

無菌操作稱取25 g樣品,置于225 mL生理鹽水中，充分振蕩混勻，制成1∶10(g∶mL)樣品勻液。用微量移液器吸取1∶10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于裝有9 mL生理鹽水的無菌試管，振搖試管使其混合均勻，制成1∶100的樣品勻液。按上述操作順序，依次重復。選擇2～3個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，將冷卻至48 ℃的培養(yǎng)基傾注入平皿內(nèi)。

參照GB 4789.35—2016對3種樣品中的乳酸菌進行計數(shù)，每種樣品分別采用MC培養(yǎng)基、改良MRS培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基進行計數(shù)。同時，根據(jù)樣品標識中的菌種類別選用適宜的培養(yǎng)基進行菌種的選擇性分離培養(yǎng)和計數(shù)，選擇性培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件如表1所示。

表1 選擇性培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件Table 1 Selective medium and culture conditions

1.3.2 菌株分離鑒定

從選擇性培養(yǎng)基上隨機選取5個單菌落，通過平板劃線法進行分離純化，獲得純菌株。

1.3.2.1 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)快速鑒定

選取新鮮培養(yǎng)的分離株到裝有300 μL超純水的離心管中，形成菌懸液；加入無水乙醇，渦旋離心取沉淀；加入50 μL 70%(體積分數(shù))的甲酸水溶液，渦旋混合均勻；加入50 μL乙腈，通過移液器反復吹打使其混合均勻；離心取上清液加入到靶板孔中，室溫下晾干；滴加 α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA)基質(zhì)溶液室溫下晾干，形成結晶；將點好樣品的靶板放入儀器內(nèi)，微生物鑒定標配方法MBT_FC，上機測試，并采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.3.2.2 多相鑒定

利用細菌基因組DNA提取試劑盒(OMEGA公司)提取分離株的基因組DNA。以基因組DNA為模板，利用通用引物27F和1492R對菌株的16S rRNA基因進行PCR擴增。反應體系按照PCR Mixture使用說明進行配制(Tiangen公司)。反應程序為：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30個循環(huán)后72 ℃延伸10 min。利用特異性引物對groEL基因和groEL基因序列進行擴增[8]，PCR反應體系同上。擴增產(chǎn)物測序后，將序列結果遞交到EzBioCloud和NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對分析[9]。采用MEGA 4軟件中的Clustal功能對分離株與近緣種菌株的16S rRNA基因、pheS基因或groEL基因進行多序列比對，并使用鄰接法進行系統(tǒng)發(fā)育及分子進化分析[10]。

將分離得到9個分離株接種到適宜培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一定時間后，收集新鮮菌體，加入2.5% 戊二醛4 ℃固定過夜。離心收集菌體，100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)漂洗3次。30%、50%、70%、85%、95%乙醇梯度脫水后100%乙醇脫水3次。干燥后用噴金—離子濺射儀BAL-TEC SCD005進行噴金，使用掃描電鏡Hitachi SU8010進行菌體形態(tài)觀察[11]。使用VITEK 2 Compact鑒定系統(tǒng)對分離株的底物利用特征進行測定。

2 結果與分析

2.1 選擇性培養(yǎng)基和GB 4789.35的活菌計數(shù)

根據(jù)發(fā)酵乳上的標識，依據(jù)表1中選擇性培養(yǎng)基和GB 4789.35對3種品牌的發(fā)酵乳進行選擇性計數(shù)，結果如表2所示。GB 4789.35對3個樣品的乳酸菌總數(shù)的計數(shù)結果均高于選擇性培養(yǎng)基。其中選擇性培養(yǎng)基M17對嗜熱鏈球菌的計數(shù)結果均高于GB 4789.35中的MC培養(yǎng)基。

在樣品1中，選擇性培養(yǎng)基MRS(含50 μg/mL的萬古霉素)和酸化MRS的計數(shù)結果之和為樣品中的乳桿菌總數(shù)，GB 4789.35中MRS培養(yǎng)基的計數(shù)結果為乳桿菌總數(shù)。MRS培養(yǎng)基的計數(shù)結果遠高于選擇性培養(yǎng)基。在樣品2和樣品3中，GB 4789.35的MRS培養(yǎng)基主要用于乳桿菌和雙歧桿菌總數(shù)的計數(shù)。本文采用的選擇性培養(yǎng)基酸化MRS和雙歧桿菌培養(yǎng)基同樣用于上述兩種菌種的計數(shù)，MRS培養(yǎng)基的計數(shù)結果均高于選擇性培養(yǎng)基。

表2 選擇性培養(yǎng)基和GB 4789.35—2016的活菌計數(shù)及快速鑒定結果Table 2 The viable counting and rapid identification result of selective medium and GB 4789.35—2016

2.2 菌株分離鑒定

2.2.1 MALDI-TOF快速鑒定

從每種計數(shù)平板上隨機挑選5個菌落，進行分離純化后，通過MALDI-TOF快速鑒定，確定培養(yǎng)基對目標菌種的選擇性，結果如表2所示。

在樣品1中，M17和MRS(含50 μg/mL的萬古霉素)對樣品中嗜熱鏈球菌和干酪乳桿菌具有很好的選擇性，隨機挑選的5個菌落經(jīng)MALDI-TOF鑒定，結果均為嗜熱鏈球菌和干酪乳桿菌。表明在發(fā)酵乳中含有干酪乳桿菌的情況下，酸化MRS培養(yǎng)基上對德氏乳桿菌的選擇性較差。

樣品2和樣品3中M17和雙歧桿菌培養(yǎng)基對嗜熱鏈球菌和動物雙歧桿菌的選擇性良好。在兩種培養(yǎng)基上隨機挑選的5個菌落經(jīng)MALDI-TOF鑒定，結果均為目標菌種。但是酸化MRS培養(yǎng)基對德氏乳桿菌的選擇性在兩種樣品中具有一定的差異。樣品2的酸化MRS培養(yǎng)基上隨機挑選的5個菌落，經(jīng)鑒定均為動物雙歧桿菌，樣品3隨機挑選的菌落鑒定結果均為德氏乳桿菌。這種差異性可能與菌種的數(shù)量有關。

GB 4789.35中的培養(yǎng)基經(jīng)過MALDI-TOF快速鑒定，結果顯示MC培養(yǎng)基和改良MRS培養(yǎng)基對嗜熱鏈球菌和雙歧桿菌具有良好的選擇性。但在3個樣品中，MRS培養(yǎng)基均有嗜熱鏈球菌的生長。因此，GB 4789.35方法對乳桿菌和雙歧桿菌計數(shù)的結果均高于選擇性培養(yǎng)基，使得GB 4789.35檢測的乳酸菌總數(shù)較實際結果偏高。

2.2.2 復合菌發(fā)酵乳中分離株的多相鑒定

選取9個分離株進行多相鑒定，發(fā)酵乳中分離株的鑒定結果均與發(fā)酵乳的標識一致(表3)。動物雙歧桿菌乳亞種(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)曾用名為乳雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis)[12]；德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)的曾用名為保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)[13]。干酪乳桿菌(Lactobacillucasei)在2020年其分類學地位變更為干酪乳酪桿菌Lacticaseibacilluscasei[14]。德氏乳桿菌保加利亞亞種(L.delbrueckiisubsp.bulgaricus)通過多相鑒定只能鑒定到種水平，需進一步通過全基因組測序及平均核苷酸一致性等方法鑒定到亞種水平。

表3 發(fā)酵乳分離株鑒定結果Table 3 The identification results of isolates from the fermented milk

2.2.2.1 形態(tài)學特征觀察

對9個分離株進行掃描電鏡觀察，其掃描電鏡的形態(tài)特征如圖1所示。M17培養(yǎng)基上獲得的分離株的菌體形態(tài)特征為橢球形，單個、成對或呈鏈狀排列，符合嗜熱鏈球菌的典型形態(tài)特征；MRS(含50 μg/mL的萬古霉素)培養(yǎng)基上的分離株的菌體形態(tài)特征為短桿狀，單個或成對排列；雙歧桿菌培養(yǎng)基分離株的菌體形態(tài)特征為不規(guī)則桿狀，兩端稍膨大；酸化MRS培養(yǎng)基分離株的菌體形態(tài)特征包括兩種，在樣品2和樣品3中呈長桿狀，在樣品1中呈彎曲桿狀，單個或成對排列。

a-M-1；b-M-2；c-M-3；d-V-1；e-B-1；f-B-2；g-A-1；h-A-2；i-A-3圖1 分離株的掃描電鏡圖Fig.1 The scanning electron microscope of the isolated strains

2.2.2.2 生理生化特性

通過VITEK2 compact對9個分離株進行生理生化檢測，檢測結果如表4所示。

表4 分離株的生理生化特征Table 4 Physiological and biochemical characteristic of isolated strains

2.2.2.3 16S rRNA基因及功能基因序列鑒定

對9株分離株進行分子水平鑒定，擴增16S rDNA和相關持家基因的序列，并進行序列比對并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。分離株B-1和B-2，通過16S rDNA 和groEL基因序列的比對，和B.animalissubsp.lactis的相似性高達100%；分離株A-1、A-2、A-3，通過16S rDNA序列比對，和L.delbrueckiisubsp.bulgaricus、Lactobacillusdelbrueckiisubsp.sunkii的序列相似性均高于99%；分離株M-1、M-2、M-3，通過16S rDNA 和pheS基因進行序列比對，和S.thermophilus的同源性為99.4%；分離株V-1，通過16S rDNA和pheS基因序列比對，和L.casei的序列相似性為100%。

a、b-雙歧桿菌培養(yǎng)基分離株的16S rRNA基因和groEL基因；c-酸化MRS培養(yǎng)基分離株的16S rRNA基因；d、e-M17培養(yǎng)基分離株的16S rRNA 基因和PheS基因;f、g-MRS培養(yǎng)基(含50 μg/mL的萬古霉素)分離株16S rRNA基因和PheS基因圖2 分離株與相關種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic trees of isolated strain and other related species 注：采用MEGA5.0軟件，鄰位連接法顯示菌株與相關模式種系統(tǒng)發(fā)育樹，進行1 000次的相似度重復計算，圖中發(fā)育樹節(jié)點只顯示Bootstrap值 >50%數(shù)值，“T”表示模式菌株

2.3 選擇性培養(yǎng)基對目標菌種的選擇性

本研究中，嗜熱鏈球菌的選擇性計數(shù)培養(yǎng)基M17和MC對嗜熱鏈球菌都具有良好的選擇性。但計數(shù)結果顯示，3個樣品中M17培養(yǎng)基的計數(shù)結果均高于MC培養(yǎng)基。M17培養(yǎng)基的營養(yǎng)豐富，有利于發(fā)酵乳中嗜熱鏈球菌的復蘇，其中高濃度的甘油磷酸鈉不僅具有良好的緩沖作用，還能抑制發(fā)酵乳中其他乳酸菌如保加利亞乳桿菌的生長[15-16]，MC培養(yǎng)基以碳酸鈣作為緩沖劑，緩沖能力較弱，粉末容易沉淀或結塊，會影響菌落生長[17]。國際標準和相關文獻多數(shù)推薦采用M17培養(yǎng)基對嗜熱鏈球菌計數(shù)[18]。

含有萬古霉素的MRS培養(yǎng)基對干酪乳桿菌具有良好的選擇性。干酪乳桿菌的選擇性計數(shù)主要根據(jù)其理化特性設計選擇性培養(yǎng)基，如劉愛萍等[6]研究表明以D-核糖為唯一碳源的培養(yǎng)基對干酪乳桿菌具有良好的選擇性。本文依據(jù)干酪乳桿菌的萬古霉素固有耐藥實現(xiàn)對干酪乳桿菌選擇性的計數(shù)。該選擇性培養(yǎng)基的應用前提為發(fā)酵乳中含有嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌和干酪乳桿菌。當發(fā)酵乳中含有其他萬古霉素固有耐藥的乳桿菌，如發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌[19]，該方法則不適用。

酸化MRS培養(yǎng)基對不同發(fā)酵乳中德氏乳桿菌的計數(shù)結果準確性存在差異，該培養(yǎng)基ISO 7889中規(guī)定對德氏乳桿菌保加利亞亞種的分離計數(shù)，該方法適用于發(fā)酵乳中只含有嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種，不具有普遍性。嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和部分雙歧桿菌等乳酸菌在酸化MRS培養(yǎng)基上也可以較好的生長嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和部分雙歧桿菌等在酸化MRS培養(yǎng)基上也可以較好的生長[20]。為更好的選擇性分離德氏乳桿菌保加利亞亞種，在后續(xù)實驗中可通過提高乙酸鈉的含量、采用改良RCM培養(yǎng)基等方法提高計數(shù)的準確性[21-22]。

GB 4789.35—2016中規(guī)定，MRS培養(yǎng)基用于測定雙歧桿菌屬和乳桿菌屬的總數(shù)，嗜熱鏈球菌的總數(shù)采用MC培養(yǎng)基。3個樣品的MRS培養(yǎng)基上均檢測到嗜熱鏈球菌，MRS培養(yǎng)基中的蛋白胨、牛肉粉、酵母粉和葡萄糖，可以為嗜熱鏈球菌的生長提供碳源、氮源等相關營養(yǎng)物質(zhì)，不能選擇性的計數(shù)乳桿菌和雙歧桿菌。俞漪等[5]提出可通過形態(tài)特征進行乳桿菌和厭氧菌的區(qū)分，提出在厭氧培養(yǎng)下，乳桿菌呈乳白色，較大，嗜熱鏈球菌呈半透明狀，較小，在乳酸菌計數(shù)的過程中可通過菌落形態(tài)特征實現(xiàn)乳桿菌計數(shù)。

3 結論

本研究以3種復合發(fā)酵乳為研究對象，采用不同的選擇性培養(yǎng)基，結合MALDI-TOF MS快速鑒定和細菌多相鑒定技術，實現(xiàn)了發(fā)酵乳中不同乳酸菌的選擇性計數(shù)及種水平的精準鑒定。研究表明M17培養(yǎng)基和雙歧桿菌培養(yǎng)基對嗜熱鏈球菌和雙歧桿菌具有良好的選擇性，可以對實現(xiàn)復合發(fā)酵乳產(chǎn)品中乳酸菌的精準計數(shù)。德氏乳桿菌的選擇性計數(shù)較難，需進一步優(yōu)化培養(yǎng)基或采用分子生物學方法等進行準確計數(shù)。本研究中選擇性培養(yǎng)基應用前提為發(fā)酵乳產(chǎn)品的菌種種類標識范圍。若乳酸菌種類組合變化，需對培養(yǎng)基的選擇性進行重新評估。本文所研究的選擇性計數(shù)培養(yǎng)基以及培養(yǎng)基選擇性的評估方法，為完善復合發(fā)酵乳產(chǎn)品的質(zhì)量控制和國家標準的修訂提供技術支撐，助力提升發(fā)酵乳產(chǎn)品微生物質(zhì)量控制及市場監(jiān)管水平。