張 然 張雪琴 張曉艷 郭 鴻 郭阿霞 孫 茹 牛春蘭

慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD)是各種原因引起的腎臟結(jié)構(gòu)和功能障礙≥3個(gè)月，包括腎小球?yàn)V過率(Glomerular filtration rate，GRF)正常和不正常的病理?yè)p傷、血液或尿液成分異常，及影像學(xué)檢查異常；或不明原因的GRF下降(<60 ml/min)超過3個(gè)月[1]。有學(xué)者對(duì)中國(guó)CKD的流行病學(xué)進(jìn)行了一個(gè)橫斷面研究，發(fā)現(xiàn)中國(guó)成年人群CKD的患病率為10.8%，由此推測(cè)中國(guó)CKD的人數(shù)為1.195億[2]。中藥序貫式結(jié)腸透析是近年發(fā)展起來治療CKD的方法之一，其配合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)常規(guī)治療，可減輕早中期慢性腎功能衰竭患者的臨床癥狀[3]。因其價(jià)廉、方便易操作、適用范圍廣、安全等優(yōu)勢(shì)，越來越被重視[4]，并開始在中醫(yī)院推廣應(yīng)用。近年來，越來越多的證據(jù)顯示，腸道菌群失調(diào)(Intestinal microbes dysbiosis)是CKD患者進(jìn)展至尿毒癥的高危因素之一[5]。2011年，Meijers等[6]首次提出了腎臟與腸道相互作用的“腸-腎軸(Gut-kidney axis)”學(xué)說。在此基礎(chǔ)上，2015年，Pahl等[7]提出“慢性腎臟病-結(jié)腸軸(Chronic kidney disease-colonicaxis)”概念。本研究主要探討中藥序貫式結(jié)腸透析對(duì)CKD大鼠腸道菌群的影響，進(jìn)一步明確中藥序貫式結(jié)腸透析治療CKD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠40只，雄性，2個(gè)月齡，體質(zhì)量(180±20)g，合格證號(hào)：SCXK-(軍)2007-004，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。在山西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，保持室溫在 18～25 ℃、相對(duì)濕度為(50%～60%)，采用人工12 h 晝/夜循環(huán)照明環(huán)境中用全價(jià)營(yíng)養(yǎng)、分籠飼養(yǎng)。每日按時(shí)清洗籠舍，保證大鼠能自由攝食及飲水。

1.2 儀器 試劑和藥物恒溫培養(yǎng)箱：(36±1)℃，美國(guó)Themo公司，型號(hào)Model 311；超凈工作臺(tái)：蘇州蘇凈有限公司，型號(hào) SW-CJ-2FD；混勻儀：大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司，型號(hào) MX-S；冰箱：中科美菱，型號(hào) YCD-EL259A；天平：精度 0.01 g，梅特勒-托利多有限公司，型號(hào)ME1002；純水儀：Thermo 公司，MicroPure UV/UF；四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；高效液相色譜儀(Agilent1100，Agilent，日本)。

1.3 5/6腎切除腎纖維化大鼠模型的建立實(shí)驗(yàn)時(shí)大鼠10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔麻醉后，俯臥位固定于鼠臺(tái)上。大鼠備皮，75%乙醇消毒。從距左肋骨下緣、脊柱旁開 l.5 cm處皮膚做一縱向切口，長(zhǎng)約 1.5 cm，逐層分離筋膜、腹內(nèi)外斜肌筋膜、進(jìn)入后腹膜腔，分離脂肪層，暴露左側(cè)腎臟，鈍性分離脂肪囊，小心剝離腎包膜及腎上腺，注意避免損傷腎上腺，動(dòng)脈夾夾閉左側(cè)腎蒂，切掉左腎上、下極2/3 腎實(shí)質(zhì)，明膠海棉壓迫創(chuàng)面止血，去掉動(dòng)脈夾觀察30～50 s后無繼續(xù)出血，小心將殘腎還納入腹腔，逐層縫合肌層、皮下及皮膚，局部消毒。1周后切去右腎，麻醉及手術(shù)過程相同，即制備成5/6腎切除大鼠模型。

1.4 分組給藥將40只SD雄性大鼠按Excel生成的隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常組(10只)、模型組(10只)、中藥序貫式結(jié)腸透析組(10只)、陽(yáng)性對(duì)照組(10只)。正常組大鼠正常條件飼養(yǎng)，不造模；其余各組大鼠制備成5/6腎切除大鼠模型。造模8周檢測(cè)大鼠Scr、BUN 水平，檢測(cè)造模情況。

正常組、模型組均予每天灌胃1次生理鹽水；陽(yáng)性對(duì)照組給予鹽酸貝那普利5 mg/kg·d藥液灌胃，每天1次；中藥序貫式結(jié)腸透析組予以陽(yáng)性對(duì)照組基礎(chǔ)治療上加中藥序貫式結(jié)腸透析。結(jié)腸透析液方藥為自擬腎衰腸療方:生大黃30 g，大黃炭15 g，煅龍骨30 g，煅牡蠣30 g，土茯苓30 g，蒲公英30 g，附片6 g，丹參15 g，五倍子10 g，芒硝10 g。每周3次，12次為一個(gè)療程。

藥物給藥共干預(yù)15 d，中藥序貫式結(jié)腸透析組在停止西藥后，繼續(xù)透析至療程結(jié)束，處死大鼠。腹主動(dòng)脈采血后摘除左腎，回腸內(nèi)容物、肝、腎、脾、淋巴結(jié)放入液氮保存以檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 一般情況觀察小鼠進(jìn)食、飲水量、精神狀況、皮毛變化及活動(dòng)情況，每周測(cè)量小鼠體質(zhì)量與24 h尿量、飲水量。

1.5.2 血液中代謝毒素水平相關(guān)指標(biāo)檢查收集血液，檢測(cè)血清中血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、血尿酸(UA)、內(nèi)生肌酐清除率(Ccr)、尿肌酐(Ucr)水平。

1.5.3 IS與PCS檢測(cè)大鼠于受試前后空腹采取靜脈血，分離血清，-80 ℃低溫冰箱凍存待用，高效液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-ESI-MS/MS)法測(cè)定血清 PCS、IS。IS標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.2%，Sigma-Aldrich公司，美國(guó))，PCS標(biāo)準(zhǔn)品(純度 99.8%，Sigma-Aldrich公司，美國(guó))。

2 結(jié)果

2.1 一般情況給藥結(jié)束后，與正常組比較，模型組大鼠精神狀態(tài)較差，體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)，24 h尿量、飲水量顯著增加(P<0.05)，出現(xiàn)多飲、多尿情況；與模型組比較，各治療組大鼠的精神狀況均有一定改善，陽(yáng)性對(duì)照組和結(jié)腸透析組大鼠體質(zhì)量顯著升高(P<0.05)、24 h飲水量、尿量顯著減少(P<0.05)；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，中藥序貫式結(jié)腸組大鼠24 h飲水量、尿量顯著減少(P<0.05)，提示中藥序貫式結(jié)腸透析可以改善CKD大鼠多尿癥狀。見表1。

表1 各組大鼠一般情況測(cè)定結(jié)果比較 (只，

2.2 代謝毒素水平變化與正常組比較，模型組大鼠24 h血清中SCr、BUN、UA水平均顯著升高(P<0.05)，Ucr、Ccr水平顯著降低，這與CKD患者后期代謝毒素水平變化相一致；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中SCr、BUN、UA水平均顯著降低(P<0.05)，Ucr、Ccr水平顯著增高(P<0.05)，這提示貝那普利與中藥序貫式結(jié)腸均可以下調(diào)CKD大鼠體內(nèi)代謝毒素的水平；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，中藥序貫式結(jié)腸組大鼠血清中BUN、UA水平均顯著升高(P<0.05)，Ucr、Ccr水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠代謝毒素水平測(cè)定結(jié)果比較 (只，

2.3 血清中IS與PCS變化與正常組比較，模型組大鼠血清中PCS、IS 含量均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，中藥序貫式結(jié)腸透析組大鼠血清中PCS、IS 含量均顯著降低(P<0.05)；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，結(jié)腸透析組大鼠血清中PCS、IS含量均顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清中IS與PCS測(cè)定結(jié)果比較

3 討論

中藥保留灌腸是由張仲景“蜜煎導(dǎo)法”逐漸完善和發(fā)展而來，對(duì)延緩腎衰進(jìn)程具有顯著優(yōu)勢(shì)，已有報(bào)道稱中藥灌腸可以對(duì)腸道菌群起到調(diào)節(jié)作用，羅學(xué)文[8]發(fā)現(xiàn)中藥腎衰方灌腸組大鼠的大腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳桿菌均有改變; 鄒川等[9]發(fā)現(xiàn)予中藥大黃復(fù)方灌腸治療慢性腎衰2周后，患者糞便培養(yǎng)可見大腸桿菌菌落計(jì)數(shù)較治療前明顯減少，總厭氧菌菌落計(jì)數(shù)、雙歧桿菌、乳桿菌菌落計(jì)數(shù)較治療前均明顯增加。由于中藥序貫式結(jié)腸透析由中藥灌腸發(fā)展而來，其彌補(bǔ)了傳統(tǒng)中藥保留灌腸的不足，將中醫(yī)與現(xiàn)代技術(shù)相結(jié)合，仿腹膜透析原理，經(jīng)彌散和滲透，清除血中毒素，有效保護(hù)殘余腎功能、延緩腎衰進(jìn)程。

有研究顯示，中藥序貫式結(jié)腸透析技術(shù)中所選的中藥眾多，有大黃，當(dāng)歸，黃芪、蒲公英、牡蠣等；生大黃、六月雪、槐角等[9-11]。本實(shí)驗(yàn)選擇山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腎病科科室多年臨床總結(jié)的有效經(jīng)驗(yàn)協(xié)定方劑腎衰灌腸方，來驗(yàn)證該技術(shù)對(duì)腸道菌群的影響。

蛋白結(jié)合類毒素與尿毒癥患者多器官損害密切相關(guān)，其中IS、PCS是蛋白結(jié)合類毒素的典型代表。此類毒素在CKD患者體內(nèi)的蓄積能加重腎臟病，并可導(dǎo)致多系統(tǒng)疾病，如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、腎性骨病等，嚴(yán)重影響患者生存率及其生活質(zhì)量[12]。據(jù)報(bào)道，在CKD 3～5期，血清IS、PCS 濃度與CKD呈明顯負(fù)相關(guān)，腎功能下降可導(dǎo)致以上毒素的明顯升高[13]。IS、PCS可通過激活RAS系統(tǒng)、誘導(dǎo)細(xì)胞因子、增強(qiáng)氧化應(yīng)激等機(jī)制加速腎功能惡化[14]。PCS主要由腸道厭氧菌產(chǎn)生，將食物中的苯丙氨酸、酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥基苯乙酸，再脫羧為對(duì)甲酚，大量對(duì)甲酚經(jīng)由腸道黏膜吸收，在腸道上皮細(xì)胞經(jīng)磺基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化為PCS。PCS主要通過腎小管基底膜側(cè)的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)至腎小管管腔，經(jīng)尿液排出。IS主要在腸道中產(chǎn)生，食物中的色氨酸經(jīng)大腸桿菌分解產(chǎn)生吲哚，后者經(jīng)門靜脈吸收入肝臟，再經(jīng)過羥化、硫酸化而產(chǎn)生IS。血液中IS也是主要通過腎小管有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體分泌、排泄[15]。由于 IS、PCS主要由腸道產(chǎn)生，理論上可以通過改變腸道菌群降低IS、PCS濃度。本研究發(fā)現(xiàn)中藥序貫式結(jié)腸透析可以降低血清IS、PCS 濃度，考慮與其延緩腎衰竭作用與增加IS、PCS分泌排泄有關(guān),需要進(jìn)一步研究。

近年來，對(duì)于中藥灌腸對(duì)腸道菌群的影響研究逐漸增多，鄒川等[9]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)大黃復(fù)方制劑灌腸治療后，腸道菌群明顯改善，表現(xiàn)為大腸桿菌菌落計(jì)數(shù)明顯減少，雙歧桿菌、乳桿菌菌落計(jì)數(shù)明顯增加; 腸道屏障功能的改善，D-乳酸和內(nèi)毒素水平明顯降低。姬衛(wèi)國(guó)等[16]對(duì)慢性腸炎腸道菌群與中藥聯(lián)合抗生素灌腸療效研究顯示，中藥辨證施治聯(lián)合抗生素灌腸可顯著改善不同證型腸道菌群失調(diào)及大便常規(guī)指標(biāo)，提高中醫(yī)證候療效，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腸道菌群有關(guān)，本研究結(jié)果表明，應(yīng)用中藥序貫式結(jié)腸透析技術(shù)能有效下調(diào)CKD大鼠的代謝毒素水平，尤其可減少腸源性尿毒素BUN、UA 的吸收或增加其排出，從而改善腎功能，延緩腎衰竭的進(jìn)展。