何宏韜 鄭 爽 陳國(guó)強(qiáng),2*

1(清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100084)

2(清華大學(xué)化工系 北京 100084)

1 引 言

中國(guó)擁有世界上最大規(guī)模的工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)業(yè)，是應(yīng)用工業(yè)生物技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)的大國(guó)[1]。傳統(tǒng)發(fā)酵工藝中，微生物生長(zhǎng)緩慢、轉(zhuǎn)化率低、滅菌過(guò)程能耗高、工藝操作復(fù)雜，這些特點(diǎn)都使得其難以實(shí)現(xiàn)成本低廉、高產(chǎn)高效的工業(yè)生產(chǎn)[2]。

在經(jīng)濟(jì)全球化進(jìn)程持續(xù)加快的背景下，世界人口迅速爆炸；根據(jù)我國(guó)第七次人口普查數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)人口也已經(jīng)達(dá)到了 14.1 億。在中國(guó)，由于人口向東部等較發(fā)達(dá)地區(qū)集聚，導(dǎo)致了人口與耕地、水資源的分布不相匹配，這是制約社會(huì)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的重要因素[3]。如果能發(fā)展新的工業(yè)技術(shù)解決人口爆炸帶來(lái)的資源緊缺問(wèn)題，那么將對(duì)實(shí)現(xiàn)“碳中和”的目標(biāo)有巨大的推動(dòng)作用，也對(duì)實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展有重要的促進(jìn)作用。

隨著現(xiàn)代生物學(xué)的不斷發(fā)展，其與工程學(xué)、系統(tǒng)科學(xué)、合成科學(xué)的相互碰撞、相互融合，逐步形成了以生物學(xué)零件標(biāo)準(zhǔn)化為基礎(chǔ)的理性設(shè)計(jì)和改造方式，即“合成生物學(xué)”[4]。通過(guò)對(duì)耐高鹽、高 pH 的嗜鹽單胞菌系統(tǒng)進(jìn)行研究，設(shè)計(jì)相應(yīng)分子操作工具對(duì)其進(jìn)行合成生物學(xué)改造，然后以嗜鹽單胞菌為底盤(pán)細(xì)胞，發(fā)展出了“下一代工業(yè)生物技術(shù)”(Next Generation Industrial Biotechnology，NGIB)。該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)無(wú)需滅菌、節(jié)能節(jié)水、開(kāi)放式的連續(xù)發(fā)酵，生物制造生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHA)、四氫嘧啶等多種化合物[5]。

2 下一代工業(yè)生物技術(shù)的微生物底盤(pán)細(xì)胞

下一代工業(yè)生物技術(shù)最突出的特點(diǎn)是使用極端微生物作為底盤(pán)細(xì)胞。極端微生物是指適宜生活在極端環(huán)境中的微生物。這些具備“特殊本領(lǐng)”的極端微生物，為人類(lèi)提供了珍貴的生物資源和科研素材，使人類(lèi)克服傳統(tǒng)工業(yè)的技術(shù)瓶頸成為可能。極端微生物種類(lèi)多樣，包括嗜熱微生物、嗜冷微生物、嗜堿微生物、嗜酸微生物、嗜鹽微生物等。其中，目前應(yīng)用開(kāi)發(fā)比較成熟的是嗜鹽微生物(Halophiles)。嗜鹽微生物是一種在高鹽、高 pH 環(huán)境下能夠正常生長(zhǎng)的極端微生物。

嗜鹽微生物普遍存在于古菌、細(xì)菌、真核生物 3 大領(lǐng)域。嗜鹽微生物可以在高于海洋鹽濃度幾倍的環(huán)境中迅速生長(zhǎng)，根據(jù)其對(duì)鹽濃度的耐受程度，可將嗜鹽微生物分為輕度嗜鹽微生物、中度嗜鹽微生物和極端嗜鹽微生物[6]。輕度嗜鹽微生物的適宜鹽濃度為 0.3～0.8 mol/L(1.7%～4.8%)，中度嗜鹽微生物的適宜鹽濃度為 0.8～3.4 mol/L(4.8%～20%)，極端嗜鹽微生物適應(yīng)鹽濃度為3.4～5.1 mol/L(20%～30%)[7]。

鹽單胞菌屬(Halomonas)是一類(lèi)中度嗜鹽微生物，可在 5%～25% 的鹽濃度范圍內(nèi)健康生長(zhǎng)。鹽單胞菌是革蘭氏陰性的桿狀細(xì)菌，一般寬度為 0.6～0.8 μm，長(zhǎng)度為 1.6～1.9 μm(圖 1)。鹽單胞菌能夠利用鞭毛進(jìn)行活動(dòng)，在有氧和無(wú)氧條件下均可以正常生長(zhǎng)。當(dāng)其在瓊脂平板上生長(zhǎng)時(shí)，一般呈現(xiàn)白色或淡黃色菌落，菌落顏色會(huì)隨時(shí)間的推移而逐漸變深，直至變成淺棕色[8]。

圖1 鹽單胞菌 Halomonas campaniensis LS21 透射電鏡圖Fig. 1 Transmission electron microscopy of Halomonas campaniensis LS21

3 底盤(pán)菌的合成生物學(xué)改造

始于 20 世紀(jì) 90 年代的人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成，有力地推動(dòng)了生命科學(xué)的研究邁入系統(tǒng)生物學(xué)時(shí)代和組學(xué)時(shí)代[9]。在系統(tǒng)生物學(xué)的基礎(chǔ)上，基因工程、計(jì)算科學(xué)、合成化學(xué)等多個(gè)學(xué)科的碰撞和交叉，促進(jìn)了合成生物學(xué)的出現(xiàn)和快速發(fā)展。合成生物學(xué)自出現(xiàn)以來(lái)，就具有非同尋常的影響力和創(chuàng)造力，并被寄予厚望能夠改變未來(lái)。通過(guò)合成生物學(xué)對(duì)底盤(pán)細(xì)胞的科學(xué)改造，可獲得能夠滿(mǎn)足生產(chǎn)生活需要的良好工程菌株。

3.1 開(kāi)發(fā)嗜鹽菌的改造工具和方法

目前，基因編輯方式百花齊放，各有所長(zhǎng)。與大腸桿菌等生物不同，早期嗜鹽單胞菌的遺傳背景不清晰、進(jìn)行基因編輯的難度大、適用的基因編輯方法非常有限，這給進(jìn)一步利用嗜鹽單胞菌進(jìn)行研究和生產(chǎn)造成了實(shí)際困難[10]。

經(jīng)過(guò)不斷嘗試和努力，研究人員相繼開(kāi)發(fā)出針對(duì)嗜鹽單胞菌的染色體重組法以及由規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)和 CRISPR 相關(guān)蛋白(CRISPR-associated protein，Cas)組成的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)、CRISPR/AID(CRISPR/Auxin-Inducible Degron)系統(tǒng)、CRISPRi(CRISPR interference)系統(tǒng)，這都使得該菌株的合成生物學(xué)研究和工業(yè)技術(shù)改造更加靈活和高效。在原核生物基因組中存在一段規(guī)律成簇的短回文序列，被稱(chēng)作 CRISPR。古菌中存在由 CRISPR 和 Cas 蛋白組成的 CRISPR/Cas系統(tǒng)，這是一種能夠抵御外源核酸入侵古菌基因組的天然保護(hù)機(jī)制[11]。近年來(lái)，基于 CRISPR/Cas 的多種應(yīng)用相繼被科學(xué)家們研發(fā)出來(lái)，該系統(tǒng)既可以通過(guò)靶向 DNA 序列引導(dǎo) Cas 蛋白形成空間位阻，抑制目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄；又可以通過(guò)靶向 DNA 序列與 Cas 蛋白配合對(duì)基因組進(jìn)行編輯。在嗜鹽菌中，利用由表達(dá)負(fù)責(zé)引導(dǎo)的向?qū)NA 的質(zhì)粒和表達(dá)負(fù)責(zé)切割的釀膿鏈球菌 Cas9蛋白的質(zhì)粒組成的 CRISPR/Cas 系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)位置的敲除、插入或替換。Cas9 蛋白表達(dá)后，在 gRNA 的引導(dǎo)下抵達(dá)靶位點(diǎn)，精確切割DNA 雙鏈。此時(shí)，設(shè)計(jì)在質(zhì)粒上的同源序列與切割位點(diǎn)附近的同源臂發(fā)生同源重組，左右同源臂之間的基因序列將被刪去，即基因敲除(圖 2(a))。前期實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，如果將外源基因加入到兩段同源臂之間，那么最終將會(huì)實(shí)現(xiàn)外源基因插入或替換基因組上的 DNA 片段(圖 2(b))[12]。

圖2 嗜鹽細(xì)菌的 CRISPR/Cas9 基因編輯工具Fig. 2 The CRISPR/Cas9 gene editing tool for halophilic bacteria

3.2 嗜鹽菌的調(diào)控策略

運(yùn)用合成生物學(xué)中的代謝工程可以實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物底盤(pán)細(xì)胞的代謝流修飾。動(dòng)態(tài)調(diào)控和靜態(tài)調(diào)控是代謝工程中被廣泛運(yùn)用的兩種調(diào)控方式。其中，靜態(tài)調(diào)控易于實(shí)現(xiàn)且高效，動(dòng)態(tài)調(diào)控則以其可控性、精細(xì)化著稱(chēng)，有助于后期實(shí)現(xiàn)復(fù)雜多樣的控制邏輯[13-14]。

代謝工程靜態(tài)調(diào)控包括基因刪除和插入[15-16]、基因表達(dá)水平調(diào)節(jié)[17]、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(Ribosome Binding Site，RBS)改造[18]、代謝流平衡分析[19]等內(nèi)容。通過(guò)刪除代謝通路中影響目標(biāo)產(chǎn)物積累的基因，可以達(dá)到積累目標(biāo)產(chǎn)物的目的，這是最常見(jiàn)的構(gòu)建工程菌的方式[20]。隨著計(jì)算機(jī)模擬和代謝流模型迅速發(fā)展，可以通過(guò)模型預(yù)測(cè)基因敲除后基因表達(dá)水平及代謝流的變化情況，全局性地預(yù)估基因敲除或替換對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和合成目標(biāo)產(chǎn)物的影響[21-24]。靜態(tài)調(diào)控中也經(jīng)常使用啟動(dòng)子工程和核糖體結(jié)合位點(diǎn)改造的調(diào)控手段。如果將外源基因?qū)胧塞}菌，必將需要合適強(qiáng)度的組成型啟動(dòng)子對(duì)其進(jìn)行表達(dá)，但不同物種之間同種啟動(dòng)子表達(dá)存在差異，所以需要通過(guò)構(gòu)建啟動(dòng)子庫(kù)來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。在嗜鹽單胞菌中表達(dá)強(qiáng)度最高的蛋白是孔蛋白 Porin[25]，通過(guò)開(kāi)發(fā) Porin 的啟動(dòng)子得到了啟動(dòng)子庫(kù) PporinLib(圖 3(a))，該庫(kù)含有 95個(gè)不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子，高低表達(dá)差超 3 500 倍，完全滿(mǎn)足科研及生產(chǎn)中對(duì)啟動(dòng)子的多樣化需求。

輸入信號(hào)、信號(hào)感應(yīng)原件(生物傳感器)和信號(hào)輸出的有機(jī)結(jié)合形成了動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)[26-28]。動(dòng)態(tài)調(diào)控是一個(gè)以調(diào)控目標(biāo)產(chǎn)物為最終結(jié)果，通過(guò)生物傳感器感應(yīng)信號(hào)分子來(lái)觸發(fā)的代謝調(diào)控過(guò)程。在嗜鹽單胞菌中，已建立與 T7 啟動(dòng)子受異丙基-β-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside，IPTG)調(diào)控的誘導(dǎo)系統(tǒng)類(lèi)似的誘導(dǎo)系統(tǒng)(圖 3(b))，可以利用 IPTG 誘導(dǎo)T7 RNA 聚合酶進(jìn)行表達(dá)。在一定范圍內(nèi)，基因表達(dá)強(qiáng)度與 IPTG 的濃度幾乎成正線性相關(guān)[29]。

圖3 嗜鹽細(xì)菌的蛋白表達(dá)工具Fig. 3 Protein expression tools for halophilic bacteria

3.3 嗜鹽菌的形態(tài)學(xué)工程改造

形態(tài)學(xué)工程，即通過(guò)改造細(xì)胞形態(tài)以實(shí)現(xiàn)增加產(chǎn)量和降低成本的目標(biāo)。PHA 在細(xì)胞中以包涵體的形式存在。對(duì)于 PHA 含量超過(guò) 50wt%的，尤其是應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中的含量超過(guò)80wt% 的 PHA 生產(chǎn)菌株，其細(xì)胞的體積大小是影響 PHA 產(chǎn)量的重要因素，是 PHA 含量上限的決定性因素。因此，增大細(xì)胞體積以容納更多的PHA，有助于 PHA 含量的提高。此外，增大細(xì)胞體積有助于減小發(fā)酵結(jié)束后的細(xì)胞收集難度，降低產(chǎn)物分離成本。

增大細(xì)胞體積可以從增大細(xì)胞寬度和長(zhǎng)度兩方面著手。關(guān)于增大細(xì)胞寬度，大多數(shù)桿狀細(xì)胞所擁有的 MreB 細(xì)胞骨架蛋白具有維持細(xì)胞硬度和寬度的作用，為細(xì)胞正常生長(zhǎng)和繁殖所必需，mreB的敲除或突變會(huì)改變桿狀細(xì)胞的極性狀態(tài)[30]。蔣等[31]在嗜鹽單胞菌Halomonas campaniensisLS21 中首先敲除mreB，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞圓形化且體積增大，部分細(xì)胞直徑可達(dá) 5 μm，然后通過(guò)條件性回補(bǔ)表達(dá) MreB，使細(xì)胞在發(fā)酵后期圓形化和體積增大，實(shí)現(xiàn)了聚-3-羥丁酸(Poly 3-hydroxybutyric acid，PHB)產(chǎn)量的顯著提升。關(guān)于增大細(xì)胞長(zhǎng)度，F(xiàn)tsZ 微管樣蛋白是細(xì)胞分裂過(guò)程中的必需蛋白，在細(xì)胞分裂時(shí)于分裂位點(diǎn)形成分裂環(huán)；抑制分裂環(huán)的形成可以使細(xì)胞不能正常分裂，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞長(zhǎng)度的增加[32]。蔣等在嗜鹽單胞菌Halomonas campaniensisLS21 中，通過(guò)融合表達(dá) FtsZ-GFP 替代 FtsZ，使得分裂環(huán)不能正常產(chǎn)生，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的纖長(zhǎng)化，使 PHB 含量由56wt% 提升至 78wt%。MinC 蛋白可以抑制 FtsZ分裂環(huán)的組裝，MinD 可以激活 MinC 蛋白對(duì) FtsZ分裂環(huán)形成的抑制活性[33]。譚等在Halomonassp. TD08 中過(guò)表達(dá)minCD，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞纖長(zhǎng)化，使PHA 含量由 69wt% 提升至 82wt%[34]。

4 下一代工業(yè)生物技術(shù)的技術(shù)特點(diǎn)

目前的生物工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程具有高成本、高能耗、低轉(zhuǎn)化率的特點(diǎn)，使得其綠色環(huán)保、節(jié)能節(jié)水等優(yōu)勢(shì)都黯然失色。

NGIB 的出現(xiàn)，將有助于扭轉(zhuǎn)這一局面，該技術(shù)以高鹽、高 pH 的極端微生物嗜鹽菌為底盤(pán)細(xì)胞，利用無(wú)需滅菌的連續(xù)發(fā)酵體系進(jìn)行生產(chǎn)(圖 4)，具有低能耗、高效率、節(jié)約水資源等眾多優(yōu)點(diǎn)。

圖4 基于嗜鹽菌的下一代工業(yè)生物技術(shù)的開(kāi)放式無(wú)滅菌連續(xù)發(fā)酵體系[1]Fig. 4 Open non-sterilizing continuous fermentation system of the next generation of industrial biotechnology processes based on halophilic bacteria[1]

4.1 海水資源的高效利用

嗜鹽單胞菌長(zhǎng)期生活在鹽湖、深海等高鹽高壓的極端環(huán)境中，在天然環(huán)境中就能合成并積累一些高附加值的工業(yè)產(chǎn)品，如 PHA 和四氫嘧啶等。前期，本實(shí)驗(yàn)室從新疆艾丁湖分離得到了嗜鹽單胞菌Halomonas campaniensisLS21和Halomonas bluephagenesisTD。其中，嗜鹽單胞菌Halomonas bluephagenesisTD 的耐鹽能力超強(qiáng)，能夠在開(kāi)放的、未滅菌的條件下生長(zhǎng)數(shù)月且不被其他微生物污染[35]，而嗜鹽單胞菌Halomonas campaniensisLS21 能夠利用海水進(jìn)行連續(xù)開(kāi)放發(fā)酵，在海水培養(yǎng)基中迅速生長(zhǎng)并積累工業(yè)產(chǎn)物[36]。

4.2 節(jié)能環(huán)保的新型發(fā)酵方式

嗜鹽單胞菌適宜于在高鹽、高 pH 的環(huán)境中生長(zhǎng)，而在同樣的環(huán)境里，其他微生物無(wú)法正常生長(zhǎng)，因此可以省去蒸汽滅菌步驟，實(shí)行開(kāi)放發(fā)酵[37]。

在傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)中，生物耗氧量較大，溶氧量的大小直接影響最終產(chǎn)物的多少，因此需要空壓機(jī)持續(xù)通入無(wú)菌空氣以增加溶氧量?？諌簷C(jī)的持續(xù)工作是整個(gè)生物工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中能耗最高的部分[38]。而基于合成生物學(xué)改造的微生物能夠在低氧條件下正常生長(zhǎng)并達(dá)到較高的生產(chǎn)效率，這種方式可以有效降低能耗，達(dá)到節(jié)能環(huán)保的目的[39-41]。通過(guò)在鹽單胞菌中導(dǎo)入血紅蛋白基因(vgb)，同時(shí)通過(guò)雙精氨酸轉(zhuǎn)位酶途徑(Tat)將其轉(zhuǎn)運(yùn)，能充分促進(jìn)氧氣接觸和轉(zhuǎn)運(yùn)，該方法可以將低氧條件下的細(xì)胞干重提高一倍[42]。后期研究將側(cè)重于通過(guò)新興的定向進(jìn)化技術(shù)改造出低氧環(huán)境中的高活性酶，并將其應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中。通過(guò)將上述技術(shù)進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，可以有效地降低微生物生產(chǎn)發(fā)酵中的高能耗。

4.3 低成本的連續(xù)發(fā)酵過(guò)程

以恒定速度向生物反應(yīng)器中添加新鮮培養(yǎng)基并流出等量發(fā)酵液，維持反應(yīng)器內(nèi)液體量恒定的發(fā)酵方式稱(chēng)為連續(xù)發(fā)酵[43]。與傳統(tǒng)的分批發(fā)酵相比，連續(xù)發(fā)酵的工藝具備得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)：第一，避免了生物反應(yīng)器清洗處理和滅菌帶來(lái)的人力、時(shí)間和能量的消耗；第二，這種連續(xù)分離收獲的發(fā)酵方式可以實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基的重復(fù)利用，在節(jié)水的同時(shí)減少?gòu)U水排放和處理[44]。普通微生物容易被其他菌種污染，不適合進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵，但嗜鹽單胞菌可以在高鹽、高 pH 的極端環(huán)境中快速生長(zhǎng)，當(dāng)之無(wú)愧地成為連續(xù)發(fā)酵工藝完美的細(xì)胞工廠。

4.4 加速分離提取的形態(tài)學(xué)工程手段

目前，嗜鹽單胞菌生產(chǎn) PHA 所使用的形態(tài)改造策略主要是通過(guò)增大細(xì)胞寬度和長(zhǎng)度的方法來(lái)增大細(xì)胞體積。體積增大的菌體不僅有助于 PHA 含量的提高，還有助于自沉降。此外，PHA 含量的提高不僅可以減少副產(chǎn)物的生成，而且當(dāng)含量超過(guò) 90wt% 時(shí)，可以顯著簡(jiǎn)化分離得到菌體后 PHA 的提取過(guò)程和純化過(guò)程。更容易自沉降的菌體，將會(huì)降低高速離心獲取菌體的難度，甚至依靠菌體自身足夠的自沉降能力可以省去離心步驟。譚等在Halomonassp. TD08 中過(guò)表達(dá)minCD，使細(xì)胞長(zhǎng)度呈幾倍到百倍的增加，部分菌絲長(zhǎng)度超 100 μm，長(zhǎng)菌絲相互纏繞成網(wǎng)發(fā)生沉降時(shí)，裹挾著其他長(zhǎng)度較短的小菌體共同沉降，此過(guò)程可在靜置 12 h 內(nèi)完成，省去高速離心的步驟[34]。當(dāng)前，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)的改造仍處于起步階段，仍需繼續(xù)研究，以實(shí)現(xiàn)在工業(yè)中簡(jiǎn)化產(chǎn)物的分離及提純步驟，縮短分離時(shí)間，降低生產(chǎn)成本和時(shí)間成本，切實(shí)提高與石油基塑料的競(jìng)爭(zhēng)力。

4.5 高密度的自動(dòng)化生產(chǎn)

在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，高密度培養(yǎng)可以提高單位體積設(shè)備的生產(chǎn)能力，降低生物量的分離費(fèi)用，便于下游分離純化工藝，從而提高生產(chǎn)效率并降低生產(chǎn)成本，但一直并未實(shí)現(xiàn)。在高密度發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵液成分復(fù)雜，反應(yīng)過(guò)程中的代謝調(diào)控更加復(fù)雜。由于嗜鹽菌具備實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵的基本條件，所以本實(shí)驗(yàn)室前期以Halomonas bluephagenesisTD01 為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)行開(kāi)放式無(wú)滅菌連續(xù)發(fā)酵，陸續(xù)進(jìn)行了 7 L 小試、1 000 L 和5 000 L 中試[35,45]、200 T 工業(yè)生物反應(yīng)器發(fā)酵，并獲得了理想的結(jié)果。

通過(guò)對(duì)不同發(fā)酵時(shí)期的生物樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和蛋白組的分析，得到了不同生長(zhǎng)時(shí)期 RNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，檢測(cè)到不同時(shí)期各個(gè)參數(shù)的變化[10]。利用這些數(shù)據(jù)嘗試構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組、蛋白組數(shù)據(jù)與關(guān)鍵時(shí)間和參數(shù)之間的代謝網(wǎng)絡(luò)，對(duì)理解嗜鹽菌在高密度培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)、代謝情況有非常大的幫助，為精確調(diào)控代謝流和優(yōu)化生物反應(yīng)器工藝都提供了可靠的理論數(shù)據(jù)支撐[46-47]。通過(guò)計(jì)算機(jī)技術(shù)、自動(dòng)化技術(shù)與生物反應(yīng)器的結(jié)合，在前期數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，未來(lái)有望設(shè)計(jì)出具有自主控制和自我學(xué)習(xí)功能的自動(dòng)化連續(xù)生產(chǎn)車(chē)間。

綜上所述，與現(xiàn)代工業(yè)生物技術(shù)(Modern Industrial Biotechnology，CIB)和化工過(guò)程(Chemical processes，CI)相比，NGIB 具有諸多優(yōu)點(diǎn)，為生物制造真正轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色制造提供了可能(表 1)。

表1 NGIB 與 CIB 以及 CI 的比較Table 1 Comparison of NGIB with CIB and CI

5 下一代工業(yè)生物技術(shù)的未來(lái)

在合成生物學(xué)研究思想的指導(dǎo)下，鹽單胞菌分子操作平臺(tái)日趨完善，生產(chǎn)菌的性能不斷優(yōu)化，形成了能夠生產(chǎn)多種高附加值產(chǎn)品的細(xì)胞工廠集群，基于嗜鹽單胞菌的 NGIB 將會(huì)在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步完善和升級(jí)。

5.1 多樣化的產(chǎn)品

與傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)技術(shù)相比，嗜鹽單胞菌除具有低能耗、節(jié)約水資源等優(yōu)勢(shì)外，還可以生產(chǎn)類(lèi)型多樣、性能各異的生物基優(yōu)質(zhì)材料——PHA。PHA 是可以代替石油基塑料產(chǎn)品的明星產(chǎn)品，它既能達(dá)到傳統(tǒng)石油基塑料的性能要求，又具備良好的可降解性能和生物相容性，具有美好的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景[48]。

目前，聚-3-羥基丁酸(PHB)[49]、聚(3-羥基丁酸-co-3-羥基戊酸酯)(PHBV)[34]、聚(3-羥基丁酸-co-4-羥基丁酸酯)(P3HB4HB)[50]等多種材料的工業(yè)化生產(chǎn)趨于成熟。單體種類(lèi)多樣、性能豐富的 PHA 材料在包裝、紡織、藥物緩釋、組織工程材料和生物能源等多個(gè)領(lǐng)域已經(jīng)得到了充分的推廣應(yīng)用(圖 5)[51-52]。

圖5 PHA 的應(yīng)用領(lǐng)域[52]Fig. 5 Various applications of PHA[52]

PHA 與多種高附加值的化學(xué)品聯(lián)產(chǎn)，是目前熱門(mén)的研究方向之一。本實(shí)驗(yàn)室以嗜鹽菌Halomonas bluephagenesis為底盤(pán)細(xì)胞高效合成了四氫嘧啶，同時(shí)聯(lián)產(chǎn)了聚-3-羥基丁酸(PHB)[53]。此外，通過(guò)提升菌株對(duì)脂肪酸類(lèi)碳源的利用效率，既能大幅降低生產(chǎn)成本，還能聯(lián)產(chǎn)出更高附加值的中長(zhǎng)鏈聚羥基脂肪酸酯。

5.2 無(wú)人工廠

物聯(lián)網(wǎng)概念的興起與迅速發(fā)展，使得萬(wàn)物互聯(lián)成為可能，其甚至被稱(chēng)為信息產(chǎn)業(yè)的第三次革命。利用終端信息傳感設(shè)備，按照約定協(xié)議將任何物體(如生物反應(yīng)器)與網(wǎng)絡(luò)互聯(lián)進(jìn)行信息交換和通信，能夠?qū)崿F(xiàn)智能化的實(shí)時(shí)控制和監(jiān)管。

基于前期嗜鹽菌的基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組等生物發(fā)酵過(guò)程積累形成的數(shù)據(jù)庫(kù)，將革命性的信息化模式與人工智能(Artificial Intelligence)結(jié)合，推廣應(yīng)用到嗜鹽菌的菌種改造和發(fā)酵生產(chǎn)中，建立起基于云端數(shù)據(jù)庫(kù)的具備自我管理、自我調(diào)控、自我升級(jí)的無(wú)人智能工廠。

5.3 低成本、無(wú)污染的生產(chǎn)后處理

利用 NGIB 的嗜鹽單胞菌工業(yè)生產(chǎn)雖然具有低能耗、高效率、節(jié)約水資源等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)，但由于嗜鹽菌高鹽、高 pH 的生活環(huán)境會(huì)產(chǎn)生部分高鹽、離子成分復(fù)雜的生產(chǎn)廢水。這種生產(chǎn)廢水如果不經(jīng)過(guò)處理，就會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成非常大的傷害。目前，高鹽廢水的處理方法主要有物理化學(xué)法、生物法、人工濕地處理法[54]，根據(jù)鹽含量的不同，采用的處理方式不同，最終的處理效果也不同。利用人工濕地技術(shù)（由水、植物、土壤、微生物和陽(yáng)光組成的污水自然凈化系統(tǒng)）對(duì)嗜鹽單胞菌的生產(chǎn)廢水進(jìn)行處理，可實(shí)現(xiàn)低成本、低能耗、無(wú)再生污染的處理過(guò)程。

6 結(jié)束語(yǔ)

在合成生物學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、工程學(xué)等相關(guān)學(xué)科飛速發(fā)展的背景下，基于工程化嗜鹽菌的下一代工業(yè)生物技術(shù)體系正在興起并不斷完善。與傳統(tǒng)工業(yè)發(fā)酵相比，嗜鹽菌對(duì)海水、陳化糧、廚余垃圾的利用能力，進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵的抗菌能力，無(wú)需滅菌和低氧生長(zhǎng)造就的節(jié)能能力，都使得這一技術(shù)脫穎而出，大幅提升綠色生物制造的競(jìng)爭(zhēng)力，甚至顛覆現(xiàn)有的生物制造過(guò)程。

在未來(lái)，下一代工業(yè)生物技術(shù)一定會(huì)在生物工業(yè)生產(chǎn)中大放異彩，甚至引領(lǐng)生物工業(yè)革命性的潮流。當(dāng)生物制造技術(shù)變得足夠先進(jìn)，越來(lái)越多的化學(xué)品和材料可以用生物方法制造，環(huán)境就更加綠水青山了。