包靜飄 李彬 吳江紅 吳增楷 沈杰 宋鵬麗 彭琪 胡國勇

上海市胰腺疾病重點實驗室，上海交通大學醫(yī)學院附屬第一人民醫(yī)院消化科，上海 200080

腺泡細胞死亡是AP的重要特征之一，其中壞死和凋亡是腺泡細胞死亡的兩種主要方式[1]。AP的嚴重程度與腺泡細胞的死亡方式密切相關，重癥急性胰腺炎時通常伴隨大量的腺泡細胞壞死，可引起強烈的胰腺局部炎癥反應，并導致全身炎癥反應綜合征和遠端臟器損傷，而誘導細胞凋亡則可減輕胰腺損傷[2-4]。本課題組前期研究證實胰腺腺泡細胞壞死和凋亡的比例決定了AP的嚴重程度[5]。因此，在AP發(fā)生的早期重塑腺泡細胞死亡方式可能是治療及預防AP重癥化演變的有效手段。為尋找有效調(diào)控AP時腺泡細胞死亡方式的藥物，本課題組利用Sigma-Aldrich藥理活性小分子化合物庫進行篩選，發(fā)現(xiàn)拓撲異構酶I抑制劑喜樹堿與腺泡細胞凋亡相關。喜樹堿是一種特異性拓撲異構酶I抑制劑，通過形成穩(wěn)定的喜樹堿-拓撲異構酶I-DNA復合物導致DNA損傷，使細胞周期停滯在S期，最終誘導細胞凋亡[6]。本研究通過建立小鼠AP模型，觀察喜樹堿對AP嚴重程度和腺泡細胞死亡方式的影響，旨在探討喜樹堿在AP及腺泡細胞死亡中的作用，為尋找新型有效的AP治療藥物提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、動物模型制備及分組

18只雄性8周齡Balb/C小鼠，體重20～25 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。將小鼠按數(shù)字表法隨機分為對照組、AP組和喜樹堿干預組(喜樹堿組)，每組6只。AP組采用腹腔注射雨蛙肽(100 μg/kg，10次，美國MCE公司)，每次間隔1 h，末次雨蛙肽注射后再注射脂多糖(5 mg/kg，美國Sigma公司)的方法制備AP模型；喜樹堿組于AP造模前0 h腹腔注射喜樹堿(美國Sigma公司)；對照組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水。為確定喜樹堿在AP時發(fā)揮作用的最佳濃度，先應用25 mg/kg和50 mg/kg的劑量對AP造模組小鼠進行干預。各組于首次注射雨蛙肽后12 h處死小鼠，眼眶取血，剖腹取胰腺和肺組織。

二、觀察指標

1.胰腺和肺組織病理學檢查：胰腺和肺組織置于4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅染色。胰腺組織根據(jù)水腫、炎癥和壞死程度進行病理評分[7]，肺組織根據(jù)肺泡壁水腫和炎癥細胞浸潤程度進行病理評分[8]。

2.血清淀粉酶和脂肪酶檢測：采用ELISA試劑盒測定血清淀粉酶和脂肪酶水平，按說明書操作。

3.胰腺組織IL-1β、IL-6 mRNA表達檢測：采用Trizol試劑(日本Takara公司)提取胰腺組織總RNA，并按PrimeScript RT Master Mix試劑盒(日本Takara公司)說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(日本Takara公司)進行RT-PCR。IL-1β上游引物序列為5′-ATGCCACCTTTTGACAGTGATG-3′，下游引物序列為5′-TGATGTGCTGCTGCGAGATT-3′；IL-6上游引物序列為5′-CCGGAGAGGAGACTTCACAG-3′，下游引物序列為5′-CATTTCCACGATTTCCCAGA-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，下游引物序列為5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′。PCR反應條件：95℃ 30 s、95℃ 5 s、60℃ 34 s，40個循環(huán)。采用公式2-△△CT計算IL-1β、IL-6 mRNA的相對表達量。

4.胰腺和肺組織CD45+細胞和程序性壞死標志蛋白混合譜系激酶結構域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein, MLKL)磷酸化表達水平檢測：采用免疫組織化學法檢測胰腺及肺組織CD45+細胞數(shù)量及胰腺組織磷酸化MLKL蛋白表達量，按照試劑盒說明書操作。CD45單克隆抗體(美國CST公司)和磷酸化MLKL單克隆抗體(美國Abcam公司)工作濃度均為1∶100。CD45陽性表現(xiàn)為胰腺間質(zhì)、肺間質(zhì)或肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)紫紅色顆粒，光鏡下每個樣本隨機選取5個高倍鏡視野(200倍)，計數(shù)每個視野中CD45陽性細胞數(shù)量。磷酸化MLKL蛋白表達陽性為腺泡細胞胞質(zhì)呈棕色，每個樣本隨機選取5個高倍鏡視野，根據(jù)腺泡細胞棕色染色強度及陽性細胞率進行評分。無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞率0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76～100%為4分。兩評分相乘為總評分。

5.胰腺組織凋亡細胞檢測：采用TUNEL法檢測胰腺組織細胞凋亡。凋亡試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，按照說明書操作。凋亡指數(shù)=(凋亡細胞總數(shù)/總細胞數(shù))×100%。

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、喜樹堿減輕AP小鼠胰腺和肺組織損傷

對照組小鼠胰腺和肺組織均無明顯病理改變。AP組小鼠胰腺組織呈現(xiàn)明顯的間質(zhì)水腫、炎癥細胞浸潤和腺泡細胞壞死，肺組織見肺泡壁明顯水腫、增厚，炎癥細胞浸潤增加。腹腔注射50 mg/kg喜樹堿干預的AP小鼠胰腺和肺組織的上述病理變化較AP組和25 mg/kg喜樹堿干預組均有明顯改善(圖1)。因此，后續(xù)實驗均采用50 mg/kg劑量進行干預。

AP組胰腺、肺組織病理評分均明顯高于對照組，而喜樹堿組顯著低于AP組，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05，表1)。AP組小鼠血清淀粉酶和脂肪酶水平較對照組均顯著升高，喜樹堿組淀粉酶和脂肪酶水平較AP組均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05，表1)。提示喜樹堿能有效減輕AP小鼠胰腺和肺組織損傷。

表1 3組小鼠胰腺和肺組織病理評分及血清淀粉酶和脂肪酶水平的比較

二、喜樹堿緩解AP小鼠胰腺和肺組織的炎癥反應

對照組、AP組、喜樹堿組小鼠胰腺組織中IL-1 mRNA表達量分別為1.39±1.12、212.35±80.61、95.79±48.11，IL-6 mRNA表達量分別為1.11±0.55、1006.80±509.06、255.50±213.32，AP組均較對照組顯著升高，喜樹堿組較AP組顯著降低，差異有統(tǒng)計學差異(P值均<0.05)。

對照組、AP組、喜樹堿組小鼠胰腺組織CD45+細胞浸潤的數(shù)量分別為(0.33±0.58)、(59.83±13.67)、(14.25±5.32)個/高倍視野，肺組織CD45+細胞浸潤的數(shù)量分別為(45.00±4.24)、(58.24±5.91)、(29.20±4.44)個/高倍視野，AP組均顯著高于對照組，而喜樹堿組顯著低于AP組(圖2)，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。提示喜樹堿能顯著減輕AP小鼠胰腺和肺組織的炎癥反應。

圖2 對照組、急性胰腺炎組、喜樹堿組小鼠胰腺組織(2A～2C)和肺組織(2D～2F)CD45+細胞浸潤(免疫組織化學染色 ×200)

三、喜樹堿誘導AP小鼠胰腺細胞凋亡并抑制細胞壞死

對照組、AP組、喜樹堿組小鼠胰腺腺泡細胞凋亡指數(shù)分別為(0.58±0.43)%、(1.92±0.29)%、(3.64±1.16)%，喜樹堿組較AP組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示喜樹堿能顯著誘導AP小鼠胰腺腺泡細胞凋亡。

對照組、AP組、喜樹堿組小鼠胰腺磷酸化MLKL蛋白的免疫組織化學評分分別為(0.56±0.19)、(4.53±1.28)、(1.75±0.20)分，喜樹堿組顯著低于AP組(圖3)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示喜樹堿能顯著抑制AP小鼠胰腺腺泡細胞壞死。

注：MLKL為混合譜系激酶結構域樣蛋白

討 論

本課題組前期研究證實[5]，AP的嚴重程度與腺泡細胞壞死呈正相關，與凋亡呈負相關。為進一步探究調(diào)控腺泡細胞死亡方式的分子機制，本課題組通過藥理活性小分子化學庫篩選影響腺泡細胞存活的潛在靶點。篩選結果提示拓撲異構酶I抑制劑喜樹堿可能參與調(diào)控AP時腺泡細胞凋亡。喜樹堿是拓撲異構酶I的特異性抑制劑，多項研究表明喜樹堿能夠誘導細胞的凋亡[9-14]。早期研究發(fā)現(xiàn)，喜樹堿在活化的人外周血淋巴細胞中可以促進細胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)變，誘導細胞凋亡[11]。Liu等[15]在人角質(zhì)形成細胞中的研究提示，喜樹堿能夠抑制端粒酶活性，從而促進細胞凋亡。另外，研究表明喜樹堿能通過增加胞質(zhì)內(nèi)Ca2+和降低線粒體膜電位影響線粒體功能，進而調(diào)控細胞凋亡[16-17]。Zeng等[18]在腫瘤細胞中證實喜樹堿促進Bak1和Mcl1蛋白的表達，通過線粒體途徑誘導細胞凋亡。喜樹堿還可以引起細胞內(nèi)活性氧水平和DNA損傷顯著增加，促進氧化應激，從而調(diào)控細胞死亡[19]。此外，Kobayashi等[20]研究結果顯示，喜樹堿誘導人中性粒細胞凋亡的同時，能顯著下調(diào)IL-18和Toll樣受體-6等炎癥相關分子的表達，抑制其促炎作用。然而，拓撲異構酶I抑制劑對AP及腺泡細胞死亡的影響，尚無文獻報道。

本研究結果顯示，喜樹堿能有效減輕AP小鼠胰腺病理損傷，減少胰腺組織CD45+細胞浸潤數(shù)量和降低炎癥細胞因子表達量；同時，經(jīng)喜樹堿干預后，AP小鼠胰腺炎相關肺損傷顯著減輕，肺組織CD45+細胞浸潤數(shù)量也明顯減少。提示喜樹堿能有效減輕AP小鼠胰腺損傷及相關肺損傷，減輕局部和全身炎癥反應。此外，為研究拓撲異構酶I抑制劑對AP腺泡細胞死亡的影響，本研究進一步檢測了小鼠胰腺腺泡細胞凋亡指數(shù)和程序性壞死標志蛋白MLKL的磷酸化水平，結果顯示喜樹堿干預組小鼠胰腺細胞凋亡指數(shù)明顯升高，而MLKL磷酸化水平明顯降低。

綜上所述，拓撲異構酶I抑制劑喜樹堿可能通過重塑AP小鼠腺泡細胞死亡方式減輕胰腺局部損傷及相關肺損傷，從而為AP的臨床治療提供新的思路和靶點。鑒于拓撲異構酶I抑制劑能通過多種途徑調(diào)控細胞死亡，未來的研究將聚焦于其在AP時腺泡細胞死亡中的具體機制。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明包靜飄、吳江紅、李彬：實驗操作、論文撰寫；吳增楷、沈杰、宋鵬麗、彭琪：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計學分析；胡國勇：研究指導、論文修改、經(jīng)費支持