孫佳平，張福順，邳 植，周 芹

（1黑龍江大學(xué)中俄聯(lián)合研究生院，哈爾濱 150080；2黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院黑龍江省寒地生態(tài)修復(fù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；3黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；4農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甜菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，哈爾濱 150080）

0 引言

甜菜(Beta vulgaris L.)屬莧科，甜菜屬，二年生草本植物，別名菾菜、紅菾菜[1]。甜菜具有耐寒、耐旱、耐鹽堿等特點(diǎn)，是一種適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)的作物[2]。甜菜是一種經(jīng)濟(jì)作物，在糖業(yè)生產(chǎn)中占有重要作用，是世界乃至中國(guó)重要的糖料作物之一，甜菜制糖的產(chǎn)量約占世界食用糖總產(chǎn)量的20%，約占中國(guó)食用糖總產(chǎn)量的10%～20%[3-4]。甜菜在國(guó)民經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)中占有重要的地位，除用于制糖外，甜菜制糖的副產(chǎn)品也具有較高的綜合利用價(jià)值。甜菜屬于北方冷涼作物，能夠生長(zhǎng)在氣溫較低的高緯度地區(qū)[5]。甜菜適宜生長(zhǎng)的溫度范圍大約是17～25℃，世界主要甜菜栽培區(qū)位于45°N附近的氣候溫和地區(qū)。在甜菜種植生產(chǎn)的過程中，不同類型以及不同程度的逆境脅迫，都會(huì)對(duì)甜菜的生長(zhǎng)發(fā)育帶來不利的影響。低溫脅迫對(duì)農(nóng)作物影響尤為嚴(yán)重，已成為世界各國(guó)農(nóng)作物栽培中普遍存在的問題[6-8]。尤其全球溫室效應(yīng)愈發(fā)嚴(yán)重，引起自然環(huán)境惡化，極冷天氣極易產(chǎn)生，對(duì)甜菜種子萌發(fā)期、幼苗期乃至生長(zhǎng)期都會(huì)產(chǎn)生不利的影響，受到的低溫傷害可能影響植物后續(xù)的生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而影響甜菜的產(chǎn)質(zhì)量[9]，限制中國(guó)甜菜產(chǎn)業(yè)穩(wěn)步發(fā)展[10-11]，因此，研究甜菜低溫冷害具有必要性和時(shí)效性。植物在非脅迫狀態(tài)下，體內(nèi)ROS的產(chǎn)生與釋放是屬于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，不會(huì)對(duì)植物體的新陳代謝產(chǎn)生影響。當(dāng)受到低溫脅迫時(shí)，植物體內(nèi)的這種平衡被打破，導(dǎo)致ROS的大量積累，ROS的特點(diǎn)是具有極強(qiáng)的氧化性，導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生膜脂過氧化反應(yīng)，從而使細(xì)胞受到破壞[12]。

丙二醛屬于細(xì)胞膜脂過氧化的分解產(chǎn)物，可表示植物受損害的程度，因此植物丙二醛含量是反映植物對(duì)低溫脅迫耐受能力的主要生理指標(biāo)[13]。低溫脅迫下，植株受到逆境影響，會(huì)啟動(dòng)一系列響應(yīng)機(jī)制來應(yīng)對(duì)低溫環(huán)境[14]。植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)分為酶促防御系統(tǒng)和非酶促防御系統(tǒng)，在酶促防御系統(tǒng)中，SOD、POD、APX、CAT是研究最多的幾種酶，這4種酶被稱為細(xì)胞保護(hù)酶系統(tǒng)[15]，其活性的強(qiáng)弱可反映植物的抗寒能力?？寡趸冈谥仓陸?yīng)答低溫脅迫中起著重要作用，植物通過增加抗氧化酶的活性來清除ROS的積累防止細(xì)胞膜脂過氧化，保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)，因此抗氧化酶的活性可以作為衡量植物抗逆性的重要指標(biāo)[16-17]。低溫脅迫下玉米、茶樹以及煙草的抗氧化系統(tǒng)的變化研究的較多，目前低溫脅迫對(duì)甜菜的研究雖有報(bào)道，但是國(guó)內(nèi)的科學(xué)研究者對(duì)低溫脅迫甜菜生理生化響應(yīng)的研究卻很少，有待進(jìn)一步研究[18-20]，因此，本文以甜菜品種‘KWS9147’為實(shí)驗(yàn)材料，測(cè)定低溫脅迫下(4℃)甜菜幼苗中MDA含量和抗氧化系統(tǒng)酶(T-AOC、SOD、POD、APX、CAT)活性的變化，探討甜菜抵在低溫脅迫下生理指標(biāo)的變化及響應(yīng)低溫脅迫的生理機(jī)制，完善甜菜抗寒生理機(jī)制，并為其他植物抗寒機(jī)制提供理論依據(jù)，對(duì)提高甜菜產(chǎn)質(zhì)量具有重要意義[21-23]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用甜菜品種為‘KWS9147’，購(gòu)自德國(guó)KWS種子股份有限公司。

實(shí)驗(yàn)在黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院甜菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心一樓光照培養(yǎng)室，于2021年3月—4月進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

該實(shí)驗(yàn)采用水培方式，甜菜種子從播種到可供實(shí)驗(yàn)處理共分為以下3個(gè)階段。

發(fā)芽：選取籽粒飽滿、均勻一致的甜菜種子播種于滅菌消毒的蛭石基質(zhì)的塑料盆中（規(guī)格為長(zhǎng)20 cm、寬14 cm、高7 cm），放入光照培養(yǎng)室培養(yǎng)一周，等待其長(zhǎng)出兩片子葉。

移苗：挑選出生長(zhǎng)均勻且無病害的甜菜幼苗用蒸餾水反復(fù)洗凈后移入帶有圓孔的泡沫板上（每板8孔，每孔兩株），在黑色避光玻璃槽（規(guī)格為長(zhǎng)36 cm、寬14.5 cm、高15 cm）用1倍的營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，通入空氣。

間苗：為保證幼苗有足夠的生長(zhǎng)空間與營(yíng)養(yǎng)面積，待其長(zhǎng)出兩片真葉后，拔除生長(zhǎng)柔弱、畸形的苗，留下大小一致、優(yōu)良的甜菜幼苗繼續(xù)水培，每孔僅保留一株，以促進(jìn)幼苗健壯生長(zhǎng)。

在水培第10天和第20天換一次營(yíng)養(yǎng)液，保證植物汲取到足夠的養(yǎng)分，期間進(jìn)行正常的苗期管理。從移苗開始將甜菜幼苗置于光照培養(yǎng)室培養(yǎng)21天后，選取大小一致、生長(zhǎng)正常健碩、無病蟲害的甜菜放入人工氣候培養(yǎng)箱中，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8株，進(jìn)行低溫脅迫處理。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置由風(fēng)冷低溫培養(yǎng)箱進(jìn)行4℃低溫脅迫處理(L)，以光照培養(yǎng)室中正常生長(zhǎng)的甜菜幼苗為對(duì)照(CK)。培養(yǎng)室溫度設(shè)置為晝25℃，夜20℃；光周期為晝14 h，夜10 h；光照強(qiáng)度為140 μmol/(m2·s)。在低溫脅迫1天后，室溫生長(zhǎng)幼苗和低溫脅迫幼苗同時(shí)取樣，采集生長(zhǎng)部位相同的成熟葉片剪碎，用電子天平精確稱取0.10 g，用錫紙包好樣品放入液氮中進(jìn)行速凍處理，后轉(zhuǎn)移入-80℃冰箱進(jìn)行超低溫保存，用于后續(xù)生理生化指標(biāo)的測(cè)定，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.3.1 MDA含量的測(cè)定 MDA用鮮樣測(cè)量，采用硫代巴比妥酸法，參考Heath的方法進(jìn)行測(cè)定[24]，結(jié)果以μmol/g FW來表示。

1.3.2 抗氧化能力指標(biāo)的測(cè)定 T-AOC[25]、SOD[26-27]、POD[28-29]、APX[30-31]、CAT[32-33]的測(cè)定，采用北京索萊寶科技有限公司測(cè)定試劑盒，用紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)量，所有指標(biāo)均3次重復(fù)，實(shí)際操作步驟可以參照試劑盒內(nèi)的說明書，各種酶活性均以U/g FW來表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用測(cè)定的平均值表示，借助Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的整理、統(tǒng)計(jì)與圖表制作，借助IBM SPSS Statistics 26軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，采用最小顯著差異法(LSD)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)低溫處理前后各生理指標(biāo)是否存在顯著差異，P＜0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)甜菜植株表型的影響

低溫脅迫會(huì)引起植物形態(tài)發(fā)生一定的變化，不同的低溫脅迫條件引起的變化有一定差異，低溫脅迫的溫度條件和時(shí)間條件都是引起這種差異的主要原因[34]。低溫往往導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，受過低溫脅迫的植株生長(zhǎng)矮小，地上部位的變化研究較多，其中植物莖的高度、葉片的形狀特征、葉片的顏色變化很為明顯，地下部位（根系）的變化研究較少。葉柄是植物進(jìn)行光合作用、輸導(dǎo)和貯存營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要器官，在低溫脅迫下，葉柄的生長(zhǎng)發(fā)育受到影響，通常表現(xiàn)為株高降低，這也是植物為了應(yīng)對(duì)低溫條件預(yù)防葉柄結(jié)冰的一種應(yīng)對(duì)策略[35-37]。葉片是甜菜直接暴露在空氣中的器官，對(duì)溫度的變化最為敏感，也是直接能體現(xiàn)溫度對(duì)甜菜帶來的影響，主要體現(xiàn)在葉片的形狀上，低溫使甜菜葉片中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到破壞，細(xì)胞受損，不能進(jìn)行正常的新陳代謝，細(xì)胞缺水，表現(xiàn)為葉片萎蔫，卷曲，葉寬及葉長(zhǎng)縮短[38]。同時(shí)，低溫脅迫會(huì)抑制植物的光合作用，抑制葉綠素的形成，加快葉綠素的降解，從而使植物葉片變黃，具體見圖1。4℃低溫脅迫下，葉片輕度受害，葉柄由直立變成輕斜，葉片出現(xiàn)了由于缺水而導(dǎo)致輕微程度的萎蔫、卷曲，葉片大小無明顯變化。

圖1 低溫脅迫對(duì)甜菜形態(tài)特征的影響

2.2 低溫脅迫對(duì)甜菜葉片MDA含量的影響

MDA是細(xì)胞膜脂過氧化的最終產(chǎn)物[39]，MDA的大量積累會(huì)損害細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜的通透性增加，功能喪失。MDA作為細(xì)胞膜氧化受損的指標(biāo)之一，在一定程度上可以反映植物在逆境脅迫下受損害的程度，其含量高低與植物抗寒性強(qiáng)弱呈負(fù)相關(guān)[40]。低溫脅迫會(huì)使細(xì)胞膜脂發(fā)生過氧化反應(yīng)，低溫脅迫對(duì)甜菜葉片MDA含量的影響見圖2，低溫脅迫會(huì)使甜菜葉片中的MDA含量上升，L組與CK組相比，差異顯著(P＜0.05)，低溫脅迫1天后，MDA含量升高幅度達(dá)到31.32%。

圖2 低溫脅迫對(duì)甜菜葉片MDA含量的影響

2.3 低溫脅迫對(duì)甜菜葉片T-AOC的影響

T-AOC是衡量抗氧化系統(tǒng)功能的綜合指標(biāo)。其大小可以代表抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)的性能，一般反映防御系統(tǒng)的抗氧化能力高低。測(cè)定T-AOC反映植物防御系統(tǒng)受低溫的影響狀況[41]。低溫脅迫對(duì)甜菜葉片T-AOC的影響見圖3，圖3表明，低溫脅迫會(huì)使甜菜葉片中的T-AOC上升，L組與CK組相比，差異顯著(P＜0.05)，低溫脅迫1天后，T-AOC升高幅度達(dá)到10.74%。

圖3 低溫脅迫對(duì)甜菜葉片T-AOC的影響

2.4 低溫脅迫對(duì)甜菜葉片抗氧化酶活性的影響

在低溫脅迫下，植物甜菜體內(nèi)的抗氧化酶活性發(fā)生改變，這有助于植物清除ROS。SOD是一種在植物體內(nèi)廣泛分布的金屬酶，是在逆境下，植物體內(nèi)ROS的重要清除劑，可使ROS發(fā)生歧化作用，分解為H2O2和O2，對(duì)生物的抗氧化性起著重要的作用。低溫脅迫對(duì)甜菜葉片中SOD的影響見圖4B，低溫脅迫使甜菜葉片中的SOD上升，L組與CK組相比，差異非常顯著(P＜0.05)，低溫脅迫1天后，SOD升高幅度達(dá)到4倍之多，在一定程度上可以消除或減少低溫脅迫引起的活性氧自由基的積累，從而有效緩解甜菜的低溫?fù)p傷。

POD可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。低溫脅迫對(duì)甜菜葉片中POD的影響見圖4B，低溫脅迫會(huì)使甜菜葉片中的POD上升，L組與CK組相比，差異也非常明顯顯著(P＜0.05)，低溫脅迫1天后，POD升高幅度達(dá)到2.22倍。

APX催化H2O2氧化AsA，是植物AsA的主要消耗者。低溫脅迫對(duì)甜菜葉片中的APX的影響見圖4C，低溫脅迫會(huì)使甜菜葉片中的APX上升，L組與CK組相比，差異顯著(P＜0.05)，低溫脅迫1天后，APX上升高幅度達(dá)到32.85%。

CAT是最主要的H2O2清除酶，在活性氧清除系統(tǒng)中具有重要作用。低溫脅迫對(duì)甜菜葉片中CAT的影響見圖4D，低溫脅迫會(huì)使甜菜葉片中的CAT上升，L組與CK組相比，差異非常顯著(P＜0.05)，低溫脅迫1天后，CAT升高幅度達(dá)到2.56倍。

圖4 低溫脅迫對(duì)甜菜葉片4種抗氧化酶活性的影響

3 討論

低溫作為常見的非生物因素之一，能夠影響植物超微結(jié)構(gòu)、形態(tài)和生理，并且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)植物的損害程度持續(xù)加深嚴(yán)重時(shí)能導(dǎo)致植物死亡[42]。植物在逆境下會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜的生物化學(xué)和生理學(xué)上的響應(yīng)，從微觀到宏觀，從細(xì)胞、分子、組織、器官甚至表型都會(huì)發(fā)生改變[43]。最直觀的體現(xiàn)就是植物的表型變化，植物表型的變化有萎蔫、葉片發(fā)黃、葉面積減小，株高降低，這與付娟娟等[44]和胡倩等[45]在研究低溫脅迫下其他植物表型的變化的研究結(jié)果一致。張珍珠等[46]研究發(fā)現(xiàn)，低溫會(huì)干擾植物體內(nèi)正常的生理代謝，影響細(xì)胞間水分的運(yùn)輸，細(xì)胞吸水能力降低，但蒸騰作用依然存在，當(dāng)蒸騰大于吸水時(shí)，細(xì)胞失水，從而葉片出現(xiàn)萎蔫，卷曲的現(xiàn)象。舒必超等[47]研究發(fā)現(xiàn)，低溫來臨時(shí)，植物葉片中的氣孔關(guān)閉，導(dǎo)致CO2吸入受阻，流通不足，從而使光合作用降低，光合作用是植物產(chǎn)生葉綠素的主要途徑，葉綠素的合成受到抑制，從而導(dǎo)致葉片發(fā)黃。K?rner[48]和Falster等[49]研究發(fā)現(xiàn)植物在逆境條件下,會(huì)通過改變自身的生長(zhǎng)和形態(tài)特征如降低植株的高度、葉面積減少適應(yīng)這種逆境條件,通過調(diào)整自身生物量的分配來維持逆境條件下植株的存活。

植物在正常的生長(zhǎng)狀況下，ROS的產(chǎn)出與分解屬于動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，低溫脅迫下導(dǎo)致ROS的大爆發(fā)，從而損害細(xì)胞膜，細(xì)胞膜發(fā)生膜脂過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量有害物質(zhì)膜脂過氧化物分解產(chǎn)生MDA，作為一種過氧化產(chǎn)物，可表示植物細(xì)胞受損害的程度，MDA含量與植物抗逆性強(qiáng)弱呈負(fù)相關(guān)。

在低溫脅迫過程中，植物有自己的一套活性氧清除系統(tǒng)，其中酶促防御系統(tǒng)起著重要的作用，酶促防御系統(tǒng)里面的抗氧化酶作為活性氧清除系統(tǒng)，能夠清除植物體內(nèi)的活性氧，使植物細(xì)胞和組織免受傷害?？寡趸钢饕⊿OD、POD、APX及CAT，SOD負(fù)責(zé)把O-2歧化成H2O2，而POD、CAT和APX在第二步起到了關(guān)鍵的作用，進(jìn)一步將SOD歧化的H2O2分解為H2O和O2[50-51]，從而緩解活性氧對(duì)細(xì)胞膜造成的傷害，減輕低溫脅迫對(duì)植物的傷害。這4種酶的活性可反映其對(duì)ROS的清除能力。

低溫脅迫下MDA和超氧陰離子的積累，對(duì)甜菜差生一定的毒害作用，從而啟動(dòng)了甜菜自身的抗氧化防御系統(tǒng)，T-AOC發(fā)生變化，SOD、POD、APX及CAT活性顯著上升，以便清除有害物質(zhì)，這與其美拉姆等[44]的研究結(jié)果一致。其中SOD的變化幅度最大，CAT和POD次之，APX變化幅度最小，不同的抗氧化酶的功能不同，其活性變化程度也不相同。我們可以推測(cè)出在抗氧化酶系統(tǒng)中，SOD發(fā)揮了主要的作用。

本研究對(duì)甜菜抗寒性生理機(jī)制變化進(jìn)一步進(jìn)行了補(bǔ)充。目前在低溫脅迫下甜菜非酶促抗氧化系統(tǒng)變化研究的較少。低溫脅迫下甜菜酶促抗氧化系統(tǒng)的變化的研究取得了一定的進(jìn)展，但是還存在一些不足，主要體現(xiàn)在：對(duì)低溫脅迫下甜菜酶促抗氧化系統(tǒng)的酶活性的變化僅僅停留在經(jīng)驗(yàn)性研究中，對(duì)甜菜在低溫脅迫下甜菜酶促抗氧化系統(tǒng)酶活性的變化機(jī)理性研究較少。以及抗氧化酶活性變化產(chǎn)生的具體原因尚不清楚。這都是我們應(yīng)該注意的問題。在下一步的工作中，將繼續(xù)研究非酶促抗氧化系統(tǒng)的變化，深入研究甜菜抗氧化酶系統(tǒng)各類酶變化產(chǎn)生的機(jī)制，投入到甜菜的具體生產(chǎn)實(shí)踐中，為社會(huì)帶來更高的經(jīng)濟(jì)效益。

甜菜是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，在在制糖產(chǎn)業(yè)中占有重要的地位，因此提高甜菜的產(chǎn)量和品質(zhì)具有十分重要的意義。北方作為甜菜的主要種植區(qū)域，由于氣候原因，低溫是限制植物生長(zhǎng)發(fā)育的最重要的環(huán)境因素，嚴(yán)重影響了甜菜的產(chǎn)量和品質(zhì)，深入研究植物低溫應(yīng)答分子調(diào)控與代謝機(jī)制的基礎(chǔ),也將為提高植物耐低溫特性和作物產(chǎn)量提供重要信息，以為植物抗逆性的研究提供參考。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了低溫脅迫(4℃)甜菜品種‘KWS9147’的表型、細(xì)胞膜受損情況及抗氧化系統(tǒng)酶活性的變化。低溫會(huì)影響作物表型的建成，表型變化主要體現(xiàn)在葉面積減小、葉片顏色變黃、株高降低及葉片出現(xiàn)輕微程度的萎蔫卷曲，植物通過表型的變化保護(hù)自身受到低溫侵害。低溫脅迫下，植物體內(nèi)的自由基的產(chǎn)生和代謝的平衡遭到破壞，ROS大量積累，導(dǎo)致植物細(xì)胞膜系統(tǒng)受到傷害，從而使過氧化程度加深。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在4℃低溫脅迫下甜菜葉片的氧自由基的產(chǎn)生速率迅速增強(qiáng)、過氧化氫的積累量大幅增加，MDA含量升高了31.32%，這說明在4℃低溫脅迫下甜菜葉片出現(xiàn)了輕微程度的氧化損傷。

甜菜的T-AOC顯著上升了10.74%，其中里面的酶促防御系統(tǒng)發(fā)揮了積極主要的作用，來提高自身的抗寒性。SOD、POD、APX及CAT的含量分別增加了4倍、2.22倍、32.85%和2.56倍，隨著有害物質(zhì)的積累，SOD、POD、抗APX及CAT通過提高自身的活性來清除有害物質(zhì)，保護(hù)細(xì)胞膜。