陳 艷，薛 強(qiáng)，金 涌，鄒明強(qiáng)，齊小花，李博逸，殷 宏

（中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100123）

頭孢氨芐（cephalexin）是一種β-內(nèi)酰胺類抗生素，對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均有抗菌作用，廣泛用于治療奶牛的乳腺炎等疾病[1]。但由于使用方法不當(dāng)或不遵守休藥期等原因，易導(dǎo)致其在乳品中殘留，從而危害人體健康，且長(zhǎng)時(shí)間超劑量使用會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性[2]。針對(duì)該藥物在食品中的殘留，歐盟及中國(guó)均設(shè)定其在牛奶中的最高殘留限量為100 ng/mL[3-4]。

目前，用于檢測(cè)頭孢氨芐的方法主要有高效液相色譜法[5-6]或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法[7]、熒光免疫層析法[8]、膠體金免疫層析法[9-10]等。 色譜法或色譜-質(zhì)譜等聯(lián)用技術(shù)樣品前處理操作繁瑣、費(fèi)用高，只有專業(yè)人員才能進(jìn)行檢測(cè)，不適用于大量樣品的快速檢測(cè)。免疫分析法主要有膠體金層析法、熒光免疫層析法、ELISA方法等，此類方法檢測(cè)時(shí)間短，成本較低，適于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大規(guī)模樣品篩選，但在靈敏度、廣譜特異性或檢測(cè)范圍上會(huì)存在不足，檢測(cè)靈敏度亟需提高。 由于表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)（SERS）可檢測(cè)低至單分子水平的目標(biāo)物，是目前最靈敏的分析方法之一[11-12]，將免疫層析和表面增強(qiáng)拉曼光譜相結(jié)合的技術(shù)，近幾年發(fā)展很快[13-14]?；诖耍狙芯恐苽淞艘环N金銀復(fù)合核殼結(jié)構(gòu)的納米貴金屬，通過(guò)連接頭孢氨芐抗體和拉曼信號(hào)分子，結(jié)合共聚焦拉曼光譜儀，開(kāi)發(fā)快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便的牛奶中頭孢氨芐免疫層析表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)方法，以期解決當(dāng)前頭孢氨芐免疫檢測(cè)靈敏度低的瓶頸性技術(shù)難題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品（cephalexin，CEX）、頭孢噻吩鈉標(biāo)準(zhǔn)品、頭孢曲松鈉標(biāo)準(zhǔn)品、頭孢克洛標(biāo)準(zhǔn)品、頭孢夫辛酯標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自Dr.E公司；頭孢氨芐抗體（CEX-Ab）和頭孢氨芐包被原（CEX-BSA）均由本實(shí)驗(yàn)室自制；NC膜（stedim UniSart CN140）購(gòu)自Sartorius公司；樣品墊（GFCP20300）和吸水紙（CFSP223000）均購(gòu)自Millpore公司；PVC底板購(gòu)自上海金標(biāo)生物科技有限公司；高氯酸（HAuCl4,99%）、檸檬酸三鈉（99.8%）、牛血清白蛋白（BSA,98%）和羊抗鼠IgG均購(gòu)自Sigma公司；Tween-20購(gòu)自北京化學(xué)試劑廠；5,5’-二硫代雙2-硝基苯甲酸 （5,5’-dithiobis-2-nitrob enzoic acid，DTNB）、Polyvinylpyrrolidone （PVP-K30，99%）、抗壞血酸（AA,99%）和硝酸銀（AgNO3,99%）均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；超純水（18.2 MΩ）購(gòu)自Millpore公司。

1.1.2 主要儀器 共聚焦拉曼光譜儀（Renishaw invia）購(gòu)自Renishaw公司；噴膜儀（Biodot XYZ 3050）和切條機(jī)（Biodot CM4000）均購(gòu)自Biodot公司；微波合成萃取儀（XH-100A）購(gòu)自北京祥鵠科技有限公司；透射電子顯微鏡（JEM-2100）購(gòu)自JEOL公司；雙光束紫外分光光度計(jì)（U-3310）購(gòu)自Hitachi Limited公司。

1.2 方法

1.2.1 納米金的制備 采用改良的檸檬酸三鈉還原法制備膠體金（AuNPs）[15]。將1%的氯金酸溶液1 mL加入99 mL去離子水中在微波合成萃取儀中加熱攪拌。溫度上升至98 ℃時(shí)，迅速加入1%檸檬酸三鈉溶液1.4 mL，繼續(xù)加熱攪拌，顏色呈酒紅色后取出，冷卻至室溫。

1.2.2 金納米粒子表面修飾 DTNB 參考Ni等[16]方法，將AuNPs與拉曼信號(hào)分子DTNB連接。 取10 mL膠體金溶液加入0.01 mol/L的DTNB溶液20 μL，室溫下攪拌反應(yīng)2 h，12 000 r/min 離心10 min，去除上清液，沉淀用2 mL超純水混懸，即得AuNPs-DTNB溶液。

1.2.3 銀包裹AuNPs-DTNB核殼結(jié)構(gòu)的制備 取2 mL AuNPs-DTNB溶液和1 mL 1% PVP加入燒杯中室溫?cái)嚢? min，隨后加入2 mL 0.01 mol/L抗壞血酸并攪拌15 mim，在3種溶液混合的同時(shí)，逐滴加入0.01 mol/L AgNO3溶液0.6 mL，膠體顏色由酒紅變成橙黃，再攪拌反應(yīng)30 min，用超純水洗滌2次，8 000 r/min離心10 min，沉淀用等體積的超純水混懸，超聲分散，即得金銀核殼與拉曼信號(hào)分子DTNB偶聯(lián)物（Au-DTNB@Ag），用透射電子顯微鏡和雙光束紫外分光光度計(jì)對(duì)納米金和修飾拉曼信號(hào)分子的金銀復(fù)合核殼結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

1.2.4 拉曼免疫探針制備

1.2.4.1 K2CO3添加量?jī)?yōu)化 各取1 mL上述制備的Au-DTNB@Ag溶液，分別加入2、4、6、8和10 μL 0.05 mol/L的K2CO3溶液調(diào)pH，向溶液中加入4 μg CEX-Ab，攪拌反應(yīng)30 min后，加入10% BSA溶液至終濃度為1%， 攪拌反應(yīng)30 min。4 ℃、10 000 r/min離心10 min，沉淀用保存液（即0.02 mol/L硼酸鈉緩沖液,含2% BSA,0.25% Proclin-300，pH 7.4）混懸。通過(guò)免疫層析試紙條層析，觀察檢測(cè)線（T線）和質(zhì)控線（C線）的顏色，確定制備拉曼免疫探針加入最佳K2CO3的量。

1.2.4.2 抗體量?jī)?yōu)化 根據(jù)上述步驟確定的最佳K2CO3的量，各取1 mL Au-DTNB@Ag溶液，加入最佳K2CO3的量，調(diào)pH后，加入不同量的抗體（2、3、4和5 μg），攪拌反應(yīng)30 min后，加入10% BSA溶液至終濃度為1%，攪拌反應(yīng)30 min。4 ℃、10 000 r/min離心10 min，沉淀用保存液混懸。通過(guò)免疫層析試紙條層析，觀察T線和C線的顏色，確定制備拉曼免疫探針的最佳抗體加入量。

1.2.5 基于SERS增強(qiáng)的免疫層析試紙條組裝 用0.02 mol/L PB稀釋CEX-BSA和羊抗鼠IgG，通過(guò)Biodot XYZ 3050噴膜儀噴膜，將包被原和羊抗鼠IgG包被在NC膜上，形成間隔0.4 cm的T線和C線，37 ℃恒溫恒濕烘箱烘2 h，干燥保存?zhèn)溆?；樣品墊用0.01 mol/L Tris溶液（含0.5% Tween-20，pH 8.0）浸泡后于37 ℃烘干。將樣品墊、吸水墊分別粘貼在帶NC膜的PVC背襯上，用切條機(jī)切成4 mm寬的條狀，即制成試紙條，干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 SERS免疫層析試紙條檢測(cè)原理 樣品中的頭孢氨芐與T線上的包被抗原CEX-BSA競(jìng)爭(zhēng)與拉曼免疫探針Au-DTNB@Ag-CEX Ab相結(jié)合。當(dāng)樣品中有頭孢氨芐時(shí)，拉曼免疫探針上所連接的抗體與頭孢氨芐結(jié)合，CEX-BSA不能與拉曼免疫探針結(jié)合，因此，T線將不出現(xiàn)紅色條帶，結(jié)果為陽(yáng)性。當(dāng)樣品中沒(méi)有頭孢氨芐時(shí)，拉曼免疫探針在NC膜上層析后與T線上包被的CEX-BSA結(jié)合，T線出現(xiàn)紅色條帶，結(jié)果為陰性。通過(guò)共聚焦拉曼光譜儀測(cè)定T線上的探針信號(hào)，測(cè)定頭孢氨芐的含量（圖1）。

圖1 SERS免疫層析試紙條檢測(cè)原理Fig.1 Schematic principle of the SERS immunochromatographic strip

1.2.7 SERS免疫層析試紙條標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取空白牛奶樣品，用3%的三氯乙酸按1∶1（V/V）處理，10 000 r/min離心15 min除去蛋白和脂肪，取中間層清液用0.01 mol/L PBS（pH 7.4）5倍稀釋后，在稀釋液中添加不同濃度的頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品，終濃度分別為0、0.01、0.1、0.5和1 ng/mL。在96微孔板里滴加5 μL的Au-DTNB@Ag-CEX Ab，分別取100 μL上述溶液加入微孔板里混勻，插入頭孢氨芐SERS的免疫層析試紙條，頭孢氨芐奶樣溶液連同Au-DTNB@Ag-CEX Ab由于毛細(xì)管作用在NC膜表面層析，NC膜上的T線和C線即會(huì)顯色，通過(guò)共聚焦拉曼光譜儀檢測(cè)T線拉曼信號(hào)分子DTNB的特征峰。以相對(duì)拉曼光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制頭孢氨芐的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。該方法的最低檢測(cè)限為空白測(cè)定平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.9 牛奶添加回收 在空白牛奶樣品中添加頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品至終濃度分別為1、4和8 ng/mL。將牛奶和3%的三氯乙酸按1∶1（V/V）混合，4 ℃、10 000 r/min離心15 min后，除去蛋白和脂肪，中間層清液轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中，用0.01 mol/L PBS（pH 7.4） 5倍稀釋，取100 μL用頭孢氨芐SERS免疫層析試紙條層析，然后用共聚焦拉曼光譜儀測(cè)定DTNB信號(hào)分子的特征峰。

2 結(jié) 果

2.1 納米金和修飾DTNB的金銀復(fù)合核殼的表征

透射電子顯微鏡結(jié)果顯示，納米金粒子的尺寸為20 nm左右，金銀復(fù)合核殼尺寸約30 nm，且粒子中心為黑色；紫外分光光度計(jì)掃描納米金的最大吸收波長(zhǎng)在520 nm附近，而金銀復(fù)合核殼的最大吸收波長(zhǎng)出現(xiàn)在420 nm附近，發(fā)生了遷移，說(shuō)明銀成功包裹在金表面。用共聚焦拉曼光譜儀檢測(cè)納米金和修飾DTNB的金銀復(fù)合核殼，發(fā)現(xiàn)修飾DTNB的金銀復(fù)合核殼出現(xiàn)拉曼信號(hào)，而未修飾DTNB的納米金無(wú)拉曼信號(hào)（圖2）。

A,納米金透射電子顯微鏡觀察（320 000×）；B,修飾DTNB的金銀復(fù)合核殼透射電子顯微鏡觀察（650 000×）；C,納米金和修飾DTNB的金銀復(fù)合核殼的紫外吸收光譜；D,納米金和修飾DTNB金銀復(fù)合核殼拉曼光譜A,TEM of AuNPs （320 000×）；B,TEM of Au-DTNB@Ag （650 000×）；C,Ultraviolet absorption spectra of AuNPs and Au-DTNB@Ag；D,Raman spectroscopy of AuNPs and Au-DTNB@Ag圖2 納米金和修飾DTNB的金銀復(fù)合核殼的表征Fig.2 Characterization of AuNPs and Au-DTNB@Ag

2.2 拉曼免疫探針最佳K2CO3和最佳抗體量的優(yōu)化

由圖3A可知，隨著K2CO3量的增加，層析試紙條上T、C線顯色逐漸變深，當(dāng)K2CO3加入量為6 μL時(shí)，層析試紙條上T、C線顯色最深，再繼續(xù)增加K2CO3的量，T、C線顯色變淺，因此，最適的K2CO3使用量為6 μL。由圖3B可知，隨著頭孢氨芐抗體量的增加，層析試紙條上T、C線顯色逐漸變深，再繼續(xù)增加抗體量，抗體結(jié)合逐漸飽和，T、C線顯色不變，因此最適的抗體使用量為3 μg。

A,K2CO3添加的優(yōu)化；B,抗體標(biāo)記量的優(yōu)化A,Optimization of K2CO3 addtion；B,Optimization of antibody labeling quantity圖3 拉曼免疫探針制備反應(yīng)條件的優(yōu)化Fig.3 Optimization of reaction conditions for preparation of Raman immunoprobe

2.3 頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過(guò)共聚焦拉曼光譜儀測(cè)定SERS免疫層析試紙條T線上的拉曼探針DTNB的拉曼光譜，DTNB的特征峰為1 062、1 154、1 334和1 558 cm-1，在1 334 cm-1處特征峰信號(hào)最強(qiáng)，選取此處峰高進(jìn)行定量測(cè)定頭孢氨芐的含量。以相對(duì)拉曼光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制頭孢氨芐的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線（圖4）。由圖4A可知，隨著牛奶樣品中頭孢氨芐含量的增加，檢測(cè)線T線顏色逐漸變淺，肉眼觀察頭孢氨芐免疫層析試紙條的檢測(cè)限為1 ng/mL，頭孢氨芐的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線回歸方程為y=-11 177.86 lg（x）+6 208.29，相關(guān)系數(shù)R2=0.98。根據(jù)空白測(cè)定平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，求得最低檢測(cè)限為0.001 ng/mL,線性范圍為0～1 ng/mL，50%抑制的質(zhì)量濃度為0.05 ng/mL。

A,頭孢氨芐SERS免疫層析試紙條；B,頭孢氨芐SERS增強(qiáng)拉曼光譜圖；C,頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)曲線A,Cephalexin SERS immunochromatographic strip；B,SERS enhanced Raman spectrogram of cephalexin；C,Standard curve of cephalexin圖4 頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立Fig.4 Establishment of standard curve of cephalexin

2.4 交叉反應(yīng)率

采用SERS的免疫層析試紙條對(duì)結(jié)構(gòu)類似的頭孢菌素類藥物進(jìn)行交叉反應(yīng)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，該試紙條與頭孢克洛有交叉反應(yīng)性，頭孢克洛50%抑制濃度為0.045 ng/mL， 交叉反應(yīng)率為111.1%；與其他頭孢菌素類藥物無(wú)交叉反應(yīng)性，交叉反應(yīng)率均低于0.1%（表1）。表明本試驗(yàn)所建立的頭孢氨芐SERS免疫層析檢測(cè)方法對(duì)頭孢氨芐和頭孢克洛具有較高的特異性。

表1 頭孢氨芐SERS免疫層析試紙條交叉反應(yīng)性Table 1 Cross reactivity of cephalexin SERS immunochromatographic strips

2.5 牛奶添加回收

由表2可知，頭孢氨芐的加標(biāo)回收率范圍為94.4%～103.3%，變異系數(shù)為2.5%～7.4%。這表明本試驗(yàn)建立的方法對(duì)于牛奶樣品中頭孢氨芐殘留的檢測(cè)有很好的適用性和準(zhǔn)確度。

表2 SERS免疫層析試紙條測(cè)定牛奶加標(biāo)回收率（n=4）Table 2 Determination of spiked milk recovery by SERS immunochromatographic strip （n=4）

3 討 論

早在1989年，Rohr等[17]研究發(fā)現(xiàn)，將固相抗體和拉曼增強(qiáng)試劑標(biāo)記過(guò)的抗體通過(guò)目標(biāo)物相連，形成“三明治”夾心復(fù)合物，通過(guò)測(cè)定標(biāo)記抗體的SERS信號(hào)進(jìn)行目標(biāo)物的檢測(cè)。隨著研究的不斷深入，表面增強(qiáng)拉曼光譜結(jié)合免疫分析技術(shù)進(jìn)入了快速發(fā)展時(shí)期，近幾年發(fā)展成為分析化學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

將表面增強(qiáng)拉曼光譜與免疫分析技術(shù)進(jìn)行結(jié)合建立的SERS免疫層析檢測(cè)技術(shù)，不僅具有SERS的高靈敏性和光譜可區(qū)分性，還具有免疫分析的高特異性和便捷性[18-20]。表面增強(qiáng)拉曼光譜免疫分析技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)是拉曼免疫探針的制備，這就需要進(jìn)行探針材料和拉曼信號(hào)分子的選擇。Wang等[21]利用銀包裹金核殼作為拉曼探針材料，修飾拉曼信號(hào)分子4-巰基苯甲酸（4-mercaptobenzoic acid，MBA）和雙酚A抗體，合成拉曼免疫探針，開(kāi)發(fā)了水中雙酚A的檢測(cè)方法。Shi等[22]利用金納米粒子作為探針材料，選用同一種拉曼信號(hào)分子4-氨基苯硫酚（4-aminothiophenol，PATP），分別與新霉素抗體和喹諾酮類抗體結(jié)合，合成新霉素拉曼免疫探針和喹諾酮類拉曼免疫探針，開(kāi)發(fā)了牛奶種同時(shí)檢測(cè)2種抗菌藥的方法。Wang等[23]利用銀包裹金作為探針材料，修飾拉曼信號(hào)分子4-硝基苯硫酚（4-nitrothiophenol，4-NTP）和葡萄球菌腸毒素B抗體，合成拉曼免疫探針，開(kāi)發(fā)了牛奶中檢測(cè)葡萄球菌腸毒素B的方法。Wang等[24]利用二氧化硅包裹金核殼作為探針材料，修飾拉曼信號(hào)分子DTNB和白細(xì)胞介素6（IL-6）抗體，合成拉曼免疫探針，開(kāi)發(fā)了檢測(cè)全血中的IL-6的高靈敏檢測(cè)方法。 綜上所述，拉曼探針材料和拉曼信號(hào)分子的選擇具有多樣性，若同時(shí)進(jìn)行多個(gè)目標(biāo)物的檢測(cè)可選擇多種拉曼信號(hào)分子合成多種拉曼免疫探針，也可通過(guò)試紙條包被多個(gè)目標(biāo)物來(lái)實(shí)現(xiàn)多殘留檢測(cè)。這種表面增強(qiáng)拉曼光譜與免疫分析技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)極大地提高了待測(cè)目標(biāo)物的靈敏度，且具有較強(qiáng)的特異性，多目標(biāo)物同時(shí)檢測(cè)不但節(jié)省了時(shí)間，還降低了檢測(cè)的成本。

本研究選擇制作簡(jiǎn)便、成本低的金、銀2種貴金屬作為拉曼探針材料，拉曼信號(hào)分子選擇DTNB。利用銀包裹金核殼結(jié)構(gòu)作為SERS探針材料，既具有金納米粒子的穩(wěn)定性，又具有銀納米粒子的拉曼增強(qiáng)效果。 在金銀核殼表面修飾拉曼信號(hào)分子DTNB和頭孢氨芐抗體，將表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)與免疫層析技術(shù)相結(jié)合，開(kāi)發(fā)了一種超靈敏的頭孢氨芐表面增強(qiáng)拉曼光譜免疫層析檢測(cè)技術(shù)，這種方法的線性檢測(cè)范圍為0～1 ng/mL，檢測(cè)限為0.001 ng/mL。胡佳麗等[25]建立熒光免疫層析法快速測(cè)定牛奶中頭孢氨芐殘留量，檢測(cè)限為0.16 ng/mL。 Bian等[26]制備了頭孢氨芐單克隆抗體，建立了牛奶等樣品中頭孢氨芐免疫熒光檢測(cè)方法的檢測(cè)限為0.1 ng/mL。Li等[27]結(jié)合免疫磁珠分離技術(shù)建立的頭孢氨芐熒光檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)限為0.34 ng/mL。本研究獲得頭孢氨芐的檢測(cè)限為0.001 ng/mL，具有更高的靈敏度。

樣品基質(zhì)里含有的蛋白質(zhì)和脂肪會(huì)影響免疫分析試驗(yàn)中抗原-抗體的結(jié)合，會(huì)降低免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的敏感性和可靠性。因此，可通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋或適當(dāng)?shù)膬艋襟E消除基質(zhì)干擾。本試驗(yàn)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線是將藥物加入牛奶中，再用3%的三氯乙酸處理，離心去除蛋白和脂肪，最后用PBS稀釋5倍，基本消除基質(zhì)的干擾，樣品測(cè)定也以相同的反應(yīng)介質(zhì)，這樣能減少基質(zhì)干擾帶來(lái)的試驗(yàn)誤差，對(duì)于牛奶樣品僅需簡(jiǎn)單的前處理去除蛋白和脂肪即可用于檢測(cè)。

4 結(jié) 論

本研究制備了一種金銀復(fù)合核殼結(jié)構(gòu)的納米貴金屬拉曼探針，開(kāi)發(fā)了一種快速高靈敏檢測(cè)牛奶中頭孢氨芐殘留的SERS免疫層析檢測(cè)方法，檢測(cè)限為0.01 ng/mL,具有快速、便攜、操作方便等膠體金試紙條的優(yōu)點(diǎn)，并且利用表面拉曼增強(qiáng)技術(shù)提高了其檢測(cè)靈敏度。