郗珊珊，賈偉娟，何云江，孟慶磊，陳云嬌，王學(xué)理

（內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，通遼 028000）

新城疫（Newcastle disease,ND）又稱“亞洲雞瘟”或“偽雞瘟”，是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的一種嚴(yán)重制約養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的Ⅰ類傳染病[1-3]。NDV只有一種血清型，但其基因型上高度多樣，最新的分類系統(tǒng)將NDV分為Ⅰ類（class Ⅰ）和Ⅱ類（class Ⅱ），Ⅰ類毒株只包含1個(gè)基因型，且在該基因型內(nèi)的毒株幾乎都是無毒的，而Ⅱ類有多種基因型，其中基因Ⅵ型和Ⅶ型NDV強(qiáng)毒株在中國最為常見，并具有高度特異性[4-6]。

ND的防控最初使用的是滅活苗免疫，但由于滅活苗保護(hù)水平有限，不能提供有效的黏膜免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，因此國內(nèi)外科研人員大都致力于活疫苗的研發(fā)，目前使用的活疫苗主要有Ⅰ系（Mukteswar株）、Ⅱ系（B1株）、Ⅲ系（F株）、Ⅳ系（LaSota株）等[7-8]。近年來，很多研究證實(shí)了新城疫病毒樣顆粒（Newcastle disease virus-like particles,NDV-VLPs）能誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞（dendritic cells,DCs）的分化與成熟，可作為疫苗研發(fā)的理想載體，用以研制安全有效的疫苗進(jìn)而防控該病。目前，已上市的VLPs疫苗包括乙型肝炎病毒疫苗、戊型肝炎病毒疫苗、重組人乳頭瘤病毒疫苗等，在疾病的預(yù)防和治療上發(fā)揮著重要的作用[9]。筆者主要就NDV-VLPs的結(jié)構(gòu)、其對(duì)DCs細(xì)胞成熟的影響及NDV-VLPs疫苗等相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行闡述與討論，以期在疫苗開發(fā)和疫病防控方面做出貢獻(xiàn)。

1 NDV基因組

NDV屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）正禽腮腺炎病毒屬（Orthoavulavirus），是直徑長100～400 nm的單股負(fù)鏈RNA病毒，外有囊膜包裹（圖1）[10-12]。NDV基因組全長約15.2 kb，編碼8種蛋白，包括6種結(jié)構(gòu)蛋白（核衣殼蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白（HN）和大聚合酶蛋白（L））及P基因編碼的2種非結(jié)構(gòu)蛋白（V和W）[13-14]。其中HN、F和M蛋白與病毒的脂質(zhì)膜有關(guān)，NP、P和L蛋白與基因組RNA合成有關(guān)，非結(jié)構(gòu)蛋白V和W可參與病毒毒力形成，具體功能見表1。

圖1 NDV結(jié)構(gòu)示意圖[11]Fig.1 Schematic diagram of NDV structure[11]

表1 NDV蛋白功能Table 1 Function of NDV proteins

2 NDV-VLPs

VLPs是由病毒蛋白在感染過程中體外表達(dá)或自發(fā)組裝而形成的。其形態(tài)與病毒相似，但由于不含遺傳物質(zhì)（DNA或RNA）而不具有感染性，因此常用于疫苗的生產(chǎn)。VLPs由結(jié)構(gòu)蛋白和脂類組裝而成，具有極強(qiáng)的免疫原性[23]。VLPs包括有囊膜的VLPs和無囊膜的VLPs,無囊膜的VLPs通常由一種或多種病毒結(jié)構(gòu)蛋白組成，更易生產(chǎn)和純化[24]；而基于有囊膜病毒建立的VLPs系統(tǒng)能完美地展現(xiàn)病毒表面糖蛋白，可將不同病原體的抗原蛋白整合在其表面，構(gòu)建多價(jià)、多聯(lián)的VLPs，是目前新型疫苗研究的重點(diǎn)方向。VLPs表面結(jié)構(gòu)高度重復(fù)有序，使其無需在T細(xì)胞幫助下即可完成與B細(xì)胞抗原受體（B-cell receptor,BCR）的交聯(lián)，引起B(yǎng)CR膜相關(guān)免疫球蛋白的寡聚化[25]。在某些情況下，當(dāng)VLPs對(duì)B細(xì)胞的刺激足夠強(qiáng)時(shí)，可誘導(dǎo)非T細(xì)胞介導(dǎo)的IgM抗體。多種表達(dá)系統(tǒng)都可產(chǎn)生VLPs，包括大腸桿菌等原核表達(dá)系統(tǒng)、桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)等。

NDV-VLPs主要是以NDV-M蛋白為骨架，來裝配HN、F和NP蛋白，可表現(xiàn)出與活的NDV顆粒相似的外觀和免疫原性，但不具有自主復(fù)制和引起感染的能力，因此是疫苗研發(fā)的理想載體[26]。與其他VLPs相比，NDV-VLPs中蛋白的比例與野生型病毒非常相似,而NDV-VLPs的釋放率（84%）高于其他VLPs的釋放率（10%～50%）[27]。NDV的HN、F蛋白分別為Ⅰ和Ⅱ型糖蛋白，在不影響自身合成的情況下，其他外源蛋白可通過替換以上2種蛋白胞外域的方式插入到NDV-VLPs中，構(gòu)成嵌合型病毒樣顆粒；也可通過糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol,GPI）錨定的方式將外源蛋白展示于VLPs表面，以上構(gòu)建策略為構(gòu)建復(fù)雜多價(jià)、多聯(lián)的NDV-VLPs提供了可能。

3 NDV-VLPs對(duì)DCs成熟的影響

VLPs是DCs的強(qiáng)激活劑，DCs是機(jī)體內(nèi)最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞（antigen-presenting cells,APC），它們的激活促使B細(xì)胞和T細(xì)胞免疫介質(zhì)的啟動(dòng)。DCs活化的第一步是VLPs與DCs表面的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor,PRR）結(jié)合，然后VLPs內(nèi)化，之后再進(jìn)行抗原處理和遞呈，以及誘導(dǎo)啟動(dòng)獲得性免疫[28-29]。

VLPs疫苗的免疫原性增強(qiáng)歸因于它們能與DCs及DCs膜受體相互作用，來誘導(dǎo)更強(qiáng)大、特異性更高的免疫反應(yīng)。致力于設(shè)計(jì)具有增強(qiáng)與DCs表面PRR相互作用能力的VLPs，是目前VLPs疫苗開發(fā)的主要特點(diǎn)。隨著科研人員對(duì)DCs PRR和VLPs之間相互作用了解的日益加深，發(fā)現(xiàn)VLPs的攝取能力可通過對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造來實(shí)現(xiàn)，其中包含肽序列可增強(qiáng)其攝取能力，而促進(jìn)VLPs與DCs PRR相互作用不能達(dá)到這一效果[30]。成熟DCs（mature DCs,mDCs）被認(rèn)為是特異性免疫應(yīng)答的始動(dòng)者，是由于mDCs可遷移至次級(jí)淋巴組織使初始型T細(xì)胞活化和增殖。體外培育的不成熟DCs（imDCs）可高效攝取VLPs，通過上調(diào)膜表面主要組織相容性復(fù)合體（MHC） Ⅱ類分子和改變細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)其成為mDCs，并分泌炎性細(xì)胞因子和趨化因子，進(jìn)而增強(qiáng)抗原遞呈能力[31]。有研究證實(shí)，NDV-VLPs可通過TLR4/NF-κB途徑誘導(dǎo)DCs成熟，導(dǎo)致MHC Ⅱ、共刺激分子和促炎細(xì)胞因子（γ干擾素（IFN-γ）和白細(xì)胞介素-12（IL-12））上調(diào)，同時(shí)還會(huì)上調(diào)DCs表面CCR7的表達(dá)，導(dǎo)致DCs在體外和體外向CCL19/CCL21遷移（圖2）[32]。 這些結(jié)果為NDV-VLPs誘導(dǎo)DCs的成熟和遷移提供了新的見解，可更好地理解了VLPs誘發(fā)的先天免疫反應(yīng)。

圖2 NDV-VLPs激活DCs成熟和遷移的示意圖[32]Fig.2 Schematic diagram of NDV-VLPs activated DCs maturation and migration[32]

丁佳欣等[33]通過NDV-VLPs（M+HN）刺激小鼠DCs來評(píng)價(jià)其成熟表征，結(jié)果顯示，該顆?？杀籇Cs有效吞噬并遞呈給初始型T細(xì)胞，來誘導(dǎo)DCs表面MHC Ⅱ和共刺激分子顯著上調(diào)及促進(jìn)DCs分泌促炎性細(xì)胞因子。Qian等[34]也對(duì)NDV-VLPs（M+HN）進(jìn)行了研究并對(duì)其免疫原性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，來自不成熟骨髓的DCs對(duì)NDV-VLPs的刺激是通過上調(diào)MHC Ⅱ、CD40、CD80和CD86分子的表達(dá)及增加細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IFN-γ、IL-6和IL-12 p70的分泌來實(shí)現(xiàn)的。此外，NDV-VLPs不僅能增強(qiáng)DCs的免疫刺激能力及自身T細(xì)胞增殖，還能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，并能將成熟的DCs聚集到脾臟，表現(xiàn)為脾臟CD11c+、CD86+細(xì)胞的雙陽性增殖明顯增加。綜上所述，NDV-VLPs可誘導(dǎo)DCs成熟，這為VLPs激活天然免疫應(yīng)答提供了依據(jù)，且為NDV-VLPs成為疫苗候選載體打下基礎(chǔ)。

4 NDV-VLPs疫苗

由于VLPs疫苗具有高制備率和引起強(qiáng)免疫應(yīng)答的特點(diǎn)，因此可將其作為構(gòu)建包括人類病毒在內(nèi)的其他病毒疫苗的研發(fā)平臺(tái)[35]。就NDV而言，VLPs是由病毒的多種結(jié)構(gòu)蛋白組裝而成的納米級(jí)顆粒，表面有重復(fù)高密度的抗原表位，可誘導(dǎo)良好的黏膜免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答;不含有病毒核酸有利于徹底清除ND，VLPs的種種優(yōu)勢(shì)恰好彌補(bǔ)了ND傳統(tǒng)疫苗的不足[36]。目前，NDV-VLPs技術(shù)已成為NDV疫苗研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)，并獲得了顯著成果，這也為其他病毒組裝成VLPs提供了技術(shù)平臺(tái)[37]。然而，該疫苗的研發(fā)還面臨一些問題，如基于VLPs疫苗的研發(fā)一般都較為復(fù)雜，且在每種新的VLPs使用之前必須評(píng)估佐劑效果和炎癥反應(yīng)，同時(shí)VLPs的純化過程需使用密度梯度甚至層析，因此該疫苗的制備不僅難度大、耗時(shí)長且價(jià)格昂貴[38]。

4.1 基因Ⅶ型NDV-VLPs疫苗

4.1.1 基因Ⅶ型NDV-VLPs疫苗的制備 NDV基因型眾多，不匹配的基因型導(dǎo)致疫苗的應(yīng)用不能對(duì)禽群提供全面的保護(hù)，會(huì)使禽群中持續(xù)存在NDV和具有不典型的臨床癥狀的病禽，不但給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失，還會(huì)使野生菌株向毒力更強(qiáng)的菌株進(jìn)化。Li等[39]用NA-1株攻毒后，F(xiàn)48E9株（基因Ⅸ型）和NA-1株疫苗（基因Ⅶ型）對(duì)雞的免疫保護(hù)率分別為60%和90%，對(duì)鵝的保護(hù)率分別為70%和100%，且當(dāng)疫苗株與流行毒株基因型不一致時(shí)會(huì)降低保護(hù)率，可見選擇與當(dāng)前流行毒株相匹配的基因型可降低傳統(tǒng)疫苗存在的免疫偏差。對(duì)國內(nèi)ND的流行情況進(jìn)行調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，基因Ⅶ型NDV廣泛流行于不同種類宿主之間，因此基于基因Ⅶ型的NDV-VLPs候選疫苗株的研制勢(shì)在必行，且在NDV的防控領(lǐng)域具有較好的發(fā)展前景[40]。

Xu等[41]利用Ⅶ型NDV（NA-1株），采用桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)研制了一種基因型匹配的新型NDV-VLPs候選疫苗株。研究發(fā)現(xiàn)，該疫苗單獨(dú)或與明礬佐劑聯(lián)合使用足以保護(hù)商業(yè)雞免受致死攻擊，且與商品化的LaSota滅活疫苗相比，NDV-VLPs在肺臟組織中的脫落和病毒載量均顯著減少，表明NDV-VLPs是一種很有前景的候選疫苗株，可用于現(xiàn)場(chǎng)控制Ⅶ型NDV。袁乾亮等[42]同樣利用昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)，將已構(gòu)建編碼NDV的M、F和HN基因的3種單順反子重組桿狀病毒粒子共同感染SF9昆蟲細(xì)胞，制備了基因Ⅶ型NDV-VLPs疫苗，將其以含25 μg蛋白的劑量免疫蛋雞后，發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生較高水平的HI抗體，且減少了攻毒雞的排毒時(shí)間，從而減少NDV在健康雞群中的傳播機(jī)會(huì)。Xu等[43]將BCSP31基因融合到GPI錨定序列中，利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)GPI-BCSP31蛋白，并與一種表達(dá)NDVM基因的重組桿狀病毒（rBV-M）和rBV-GPI-BCSP31共感染NDV-VLPs。由此產(chǎn)生的嵌合病毒樣顆粒在體外和體內(nèi)均能有效地誘導(dǎo)DCs成熟，同時(shí)增加細(xì)胞內(nèi)IFN-γ和IL-4水平，從而產(chǎn)生良好的免疫原性。

4.1.2 基因Ⅶ型NDV-VLPs的免疫效力 為評(píng)估基因Ⅶ型NDV-VLPs的免疫效力，袁乾亮等[44]將80只1日齡商品蛋雞隨機(jī)分為NDV-VLPs、NDV-VLPs聯(lián)合鋁佐劑（NDV-VLPs+Alum），LaSota滅活油乳商品疫苗（inactivated LaSota/commercial vaccine）、空白對(duì)照（PBS 0.01 mol/L,pH 7.4）4組。且每周定時(shí)進(jìn)行HI抗體水平監(jiān)測(cè)，免疫7周后以同樣劑量二次免疫。二次免疫3周后以NA-1（1×106ELD50/0.1 mL）毒株進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。結(jié)果顯示，NDV-VLPs+Alum免疫組于免疫后3周HI抗體達(dá)到峰值（7.5 log2），高于其他3組。各免疫組HI抗體達(dá)到峰值后均有降低，但NDV-VLPs免疫組降低得更快。 總體來說ND-VLPs產(chǎn)生HI抗體周期較短，而NDV-VLPs+Alum產(chǎn)生HI抗體維持時(shí)間較長。還有研究發(fā)現(xiàn)，與接種LaSota滅活苗的雞相比，接種NDV-VLPs疫苗的雞肺臟組織中具有較低的組織病毒載量和較短的病毒脫落期，這表明該疫苗在控制和消除ND方面作用顯著[45-46]。

4.2 NDV和高致病性禽流感病毒雙價(jià)VLPs疫苗

ND和高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza,HPAI）是禽類的兩種主要致死性疾病，感染后均會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)癥狀，死亡率高達(dá)100%，OIE將其列為A類疫病。ND和HPAI疫苗早已在禽類養(yǎng)殖業(yè)廣泛使用，為了方便免疫和區(qū)分感染方式，科研人員對(duì)NDV和高致病性禽流感病毒（High pathogenic avian influenza virus,HPAIV）雙價(jià)VLPs疫苗進(jìn)行了探索[47]。目前在表達(dá)HPAIV-HA、M1和F/HA蛋白的昆蟲細(xì)胞系中構(gòu)建嵌合VLPs二聯(lián)苗是一種廣泛應(yīng)用的方式，其中F/HA蛋白是一種含有NDV-F蛋白外區(qū)的嵌合蛋白，可與HPAIV-HA蛋白的跨膜區(qū)和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域（TM/CT）融合。秦嶺松[48]將H9N2型AIVHA基因與NDVHN基因融合并引入DCpep多肽制備二聯(lián)嵌合型病毒樣顆粒,能夠誘導(dǎo)針對(duì)NDV和H9N2亞型AIV的雙重免疫保護(hù)，且黏膜免疫應(yīng)答增強(qiáng)。Shen等[49]以禽流感病毒M1蛋白為骨架，構(gòu)建了含有禽流感病毒HA基因和NDVHN基因胞外片段的病毒樣顆粒，該嵌合VLPs疫苗可完全抵抗高致病性NDV（F48E9株）的攻擊，且在單次免疫雛雞（10 μg/只）后就可誘導(dǎo)高水平的HPAIV和NDV抗體，還可通過NP-CELISA和HI試驗(yàn)對(duì)疫苗接種和自然感染動(dòng)物進(jìn)行區(qū)分。總之，使用昆蟲病毒桿狀表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生嵌合VLPs為家禽抵御HPAIV和NDV提供了一種實(shí)用的解決方案，這些方法也將在開發(fā)其他病原體的雙價(jià)疫苗方面發(fā)揮作用[50]。

4.3 NDV-VLPs在呼吸道合胞病毒中的應(yīng)用

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus,RSV）是導(dǎo)致嬰幼兒細(xì)支氣管炎的最主要原因，調(diào)查顯示，全球5歲以下兒童因RSV造成的相關(guān)性急性下呼吸道感染每年約3 300萬例，死亡率為1%～3%[51-52]。該病的發(fā)生不斷威脅著兒童的健康，其中IgM的檢測(cè)對(duì)該病的診斷具有指導(dǎo)意義，與此同時(shí)科研人員也正致力于疫苗的研發(fā)[53]。

RSV表面暴露的F和G糖蛋白是中和抗體的關(guān)鍵靶點(diǎn)，其中，F(xiàn)蛋白是膜融合和感染所必需的，可在病毒組裝、融合和感染過程中發(fā)揮重要作用[37,54-55]。棉鼠是公認(rèn)的RSV標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型，比小鼠更易受到RSV感染，Blanco等[56]利用棉鼠的母體免疫模型，對(duì)含RSV F和G蛋白穩(wěn)定融合后的NDV-VLPs疫苗有效性進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果顯示，在孕期對(duì)棉鼠進(jìn)行接種，僅通過1次免疫就可有效地增強(qiáng)母體內(nèi)已存的RSV抗體，加強(qiáng)對(duì)后代的保護(hù)并減少RSV感染相關(guān)的幼鼠肺部炎癥，同時(shí)，對(duì)融合前后的2種疫苗進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，VLPs疫苗顯示出一定的優(yōu)越性[57]。McGinnes等[58]將RSV的F和G蛋白同時(shí)整合到NDV-VLPs骨架中，經(jīng)小鼠免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)證實(shí)，以NDV-VLPs為骨架的RSV疫苗與其他非復(fù)制型RSV候選疫苗相比，具有較好的免疫保護(hù)效果。

綜上所述，含RSV F和G蛋白的NDV-VLPs能誘使動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體，含有穩(wěn)定的前融合蛋白的VLPs在誘導(dǎo)中和抗體方面比主要含有融合后的VLPs更有效，將F蛋白的融合形式包含在VLPs-RSV候選疫苗株中，可激發(fā)與保護(hù)性反應(yīng)相關(guān)的所有位點(diǎn)的抗體，具有很好的免疫保護(hù)作用，該類NDV-VLPs在疫苗的研究領(lǐng)域?qū)⒕哂兄匾饔?，也有望?yīng)用在人輪狀病毒治療方面。

5 展 望

近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)和高通量全基因組測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，科研人員對(duì)NDV生物學(xué)特性的了解正在逐步加深，對(duì)NDV-VLPs的研究也不斷深入，其在疫苗研究方面的應(yīng)用，不僅對(duì)ND的防控提供幫助，還對(duì)其他疫苗的研制提供了新的思路。因?yàn)閂LPs不可復(fù)制，不具有傳染性病毒載體感染的風(fēng)險(xiǎn)，以NDV-VLPs為基礎(chǔ)研制的疫苗安全性可得到保證。

VLPs的正確設(shè)計(jì)不應(yīng)僅基于病毒結(jié)構(gòu)蛋白的過度表達(dá)，還必須考慮病原體感染的分子機(jī)制、VLPs內(nèi)化所附著的靶PRR及所需的免疫反應(yīng)類型。VLPs也可設(shè)計(jì)用于治療過敏性疾病，因?yàn)閂LPs免疫可將免疫反應(yīng)從輔助型T細(xì)胞2（T helper 2 cell,Th2）切換到輔助型T細(xì)胞1（T helper 1 cell,Th1）。由于VLPs可恢復(fù)免疫反應(yīng)、交叉呈現(xiàn)和誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，也可用于未來的癌癥治療。

準(zhǔn)確設(shè)計(jì)的VLPs使其成為非常有吸引力的候選載體，該載體旨在生產(chǎn)針對(duì)傳染病的病原體，以及用于過敏性疾病的治療、惡性腫瘤的個(gè)性化治療和良性腫瘤轉(zhuǎn)化治療的疫苗研制，為今后VLPs疫苗的研發(fā)搭建了一個(gè)堅(jiān)固橋梁。盡管VLPs疫苗具有較高的安全性和免疫原性，以及可刺激細(xì)胞免疫、不依賴雞胚等諸多優(yōu)點(diǎn)，但目前VLPs疫苗主要是通過基因工程手段從酵母或感染重組桿狀病毒的昆蟲細(xì)胞中制備，人工VLPs主要通過化學(xué)合成手段獲得，兩者在技術(shù)上仍存在一定的難度，并且對(duì)操作者及操作條件均有較高的要求。另外，VLPs在存儲(chǔ)、運(yùn)輸和使用等方面也存在著不便，如果能進(jìn)一步降低成本和生產(chǎn)技術(shù)難度，將會(huì)得到廣泛的實(shí)際應(yīng)用。