陰雅潔，梁瑞英，崔 歡，孟利佳，倪維玲，喬思娜，郭康康，張 博，李松勵，侯紹華，董世山

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，保定 071000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

鴨坦布蘇病毒病是由鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）引起的一種以患病鴨采食量和產(chǎn)蛋量大幅下降、出現(xiàn)嚴重的神經(jīng)功能障礙為特征，以出血性卵巢炎為主要臨床癥狀的鴨傳染性疾病。自2010年以來，該病毒已在中國主要養(yǎng)鴨區(qū)傳播，廣東、廣西、福建、江西、上海等很多地區(qū)都有DTMUV感染的報道，從鵝、雞、麻雀和蚊子中也分離得到DTMUV[1-5]。鴨群感染后幾乎全部發(fā)病，死亡率為5%～15%不等，并且DTMUV感染會導(dǎo)致鴨群抵抗力下降，使其更易混合感染一些細菌性疾病，嚴重危害了中國養(yǎng)鴨業(yè)[6-7]。 DTMUV歸屬于黃病毒科（Flaviviridae）、黃病毒屬（Flavivirus）。 病毒為單股正鏈RNA、大小為10.9 kb，粒子的直徑大小為30～60 nm[8-9]。DTMUV囊膜蛋白E蛋白由3個結(jié)構(gòu)域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）組成，是最主要的抗原結(jié)構(gòu)，是使病毒與受體結(jié)合進入細胞的重要蛋白[10]。結(jié)構(gòu)域Ⅰ為中心結(jié)構(gòu)域，具有影響血清學(xué)或生物活性的表位,結(jié)構(gòu)域Ⅱ包含中和作用和血凝活性的表位,結(jié)構(gòu)域Ⅲ參與受體結(jié)合作用[11-13]。1955—2017年間分離的DTMUVE基因發(fā)生了較大的突變，表明DTMUV正在快速進化，可能導(dǎo)致病毒變異體出現(xiàn)[11]。

目前，中國已經(jīng)研制出商品滅活疫苗和弱毒活疫苗，但由于疫苗未完全普及或免疫失敗，近年來在一些養(yǎng)鴨場仍然有鴨坦布蘇病毒病的發(fā)生[14]?，F(xiàn)有的DTMUV商品疫苗已減輕了疾病的流行，但RNA病毒遺傳變異幾率較大，可導(dǎo)致病毒毒力升高，使現(xiàn)有疫苗保護效力降低引發(fā)更嚴重的損失[15-16]。黃病毒屬的其他病毒，如西尼羅河病毒、登革病毒、日本腦炎病毒和黃熱病病毒等都是人畜共患病病原體，雖然目前沒有DTMUV病原感染人類的病例，但有研究報導(dǎo)鴨場工作人員檢出DTMUV陽性抗體[17]；DTMUV不僅能感染小鼠，而且在BHK-21、Vero、293T等哺乳動物細胞系中增殖能力很強，人神經(jīng)細胞系和肝細胞系均具有高度易感性，說明DTMUV是一種潛在的人畜共患病原體，可能對公眾安全構(gòu)成潛在威脅[18-21]。因此，掌握DTMUV病原特性、流行規(guī)律和遺傳進化規(guī)律等對該病的監(jiān)測、防控以及公共安全十分重要[21-22]。為了掌握鴨坦布蘇病毒病的流行規(guī)律和病原特征，本研究通過分離河北某鴨場發(fā)病鴨病料的病原，通過RT-PCR、透射電鏡、Western blotting及間接免疫熒光試驗（IFA）進行鑒定，并對分離毒株進行囊膜蛋白測序和遺傳進化分析，以便確定病毒來源及其進化規(guī)律，為進一步開展針對DTMUV變異毒株的疫苗研發(fā)及其防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

20只30日齡北京鴨購自北京南口北京鴨育種中心，DTMUV抗原、抗體檢測均為陰性；病料來自河北省某鴨場疑似DTMUV感染的鴨，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所保存；SPF雞胚購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司；雞胚成纖維細胞（DF-1）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)公共衛(wèi)生實驗室保存。

病毒RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自Axygen公司；Prime STAR?Max DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司；DTMUV E蛋白單克隆抗體由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)公共衛(wèi)生實驗室保存；HRP標記山羊抗鼠Ig（H+L）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；山羊抗小鼠IgG H&L（FITC）購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自寶林科（北京）生物科技有限公司。透射電子顯微鏡（HT770）購自日立（中國）有限公司；激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)（TCS SP8）購自徠萊卡微系統(tǒng)股份公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中DTMUV全基因序列（登錄號：MN649262.1），選擇保守片段用Primer Premier 5軟件分別設(shè)計2對引物，引物P1用于臨床樣品的病原鑒定；引物P2用于擴增E基因全長，進行病毒的遺傳進化樹分析，引物序列見表1。引物均由金唯智生物科技（北京）有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.2 病毒PCR檢測 采集10只發(fā)病鴨的肝臟、脾臟和腦用于病毒分離。將肝臟、脾臟、腦組織1∶4加入生理鹽水研磨形成混懸液，-80 ℃反復(fù)凍融3次，8 000×g離心30 min取上清進行PCR鑒定。根據(jù)病毒RNA提取試劑盒說明書提取病料上清液RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。 PCR體系50 μL：PrimerSTAR Max DNA聚合酶25 μL，上、下游引物（10 mmol/L）各1 μL，cDNA模板3 μL,ddH2O補至50 μL。PCR擴增條件：98 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，53 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.2.3 病毒分離與E基因鑒定 分別采用DF-1細胞和9日齡SPF雞胚進行病毒分離。將過濾后的病毒液接種到單層DF-1細胞上，每12 h觀察細胞病變效應(yīng)（CPE），待CPE達80%時收獲病毒，反復(fù)凍融3次，連續(xù)盲傳5代，-80 ℃保存?zhèn)溆?；將過濾后的病毒液接種9日齡SPF雞胚尿囊腔（0.2 mL/枚），棄掉24 h內(nèi)死亡雞胚，收集24～120 h內(nèi)死亡雞胚尿囊液，并解剖觀察死亡雞胚。將病毒在SPF雞胚上連續(xù)傳至第5代，收集死亡雞胚尿囊液儲存至-80 ℃保存?zhèn)溆?。對收集的?代尿囊液進行血凝（HA）試驗，測定分離株對雞紅細胞的凝集特性，具體操作參照《中華人民共和國獸藥典》。為了進一步鑒定分離到的毒株，用RNA提取試劑盒提取第5代雞胚尿囊液RNA，用P2引物擴增E基因全長，PCR體系及程序同1.2.2。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.2.4 病毒純化及電鏡觀察 收集雞胚尿囊液，4 ℃、8 000×g離心30 min，上清用0.22 μm濾膜過濾除去雜質(zhì)后加入8% PEG6000磁力攪拌器攪拌過夜，9 000×g離心1 h，將沉淀用1 mL PBS重懸，20%蔗糖35 000×g離心2 h后再次重懸沉淀，25%、45%不連續(xù)蔗糖梯度35 000×g離心1.5 h，從灰色界面處取500 μL，3%磷鎢酸負染后在透射電鏡下觀察。

1.2.5 病毒W(wǎng)estern blotting鑒定 將純化后的病毒接種于生長狀態(tài)良好的DF-1細胞上，36 h后收取樣品全蛋白進行12% SDS-PAGE，轉(zhuǎn)印到NC膜上，用5% BSA 4 ℃封閉過夜，TBST清洗5遍，DTMUV一抗（1∶500） 4 ℃孵育過夜，TBST清洗5遍，HRP標記的羊抗鼠IgG（1∶1 000）室溫孵育1 h，TBST清洗5遍，通過ELC顯色觀察。

1.2.6 病毒IFA鑒定 將純化后的病毒接種于單層DF-1細胞上，待細胞出現(xiàn)明顯CPE，用4%多聚甲醛固定細胞30 min，PBS洗5遍，1% Triton X-100通透15 min，PBS洗5遍，加入DTMUV一抗（1∶2 000），4 ℃孵育過夜，PBS洗5遍，再加入FITC標記的羊抗鼠IgG（1∶1 000）室溫孵育1 h，PBS洗5遍，最后用抗熒光衰減封片劑（含DAPI）封片，用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察。未接種病毒的DF-1細胞作為陰性對照。

1.2.7 動物回歸試驗 將20只30日齡健康雛鴨分為2組，試驗組腿部肌內(nèi)注射純化后的病毒1 mL，對照組接種1 mL PBS，記錄10 d內(nèi)各組臨床癥狀及發(fā)病、死亡情況，接種后第10天處死，剖檢并觀察其心臟、肝臟和脾臟等的病理變化。

1.3 病毒囊膜蛋白序列分析

用膠回收試劑盒對從雞尿囊液中擴增出的E基因PCR產(chǎn)物進行回收，連接pESAY-Blunt克隆載體，并按說明書進行轉(zhuǎn)化擴增，將鑒定為陽性的質(zhì)粒送于北京擎科生物科技有限公司測序。 利用Mega 6.0對E基因序列與GenBank中已發(fā)表的其他DTMUVE基因序列進行遺傳進化分析和相似性比對。 同時比對分離株與商品滅活疫苗HB2010株（MN649262.1）、活疫苗FX2010（MH414568.1）和WFZ株（KC990545.1）的氨基酸序列并進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 病毒分離及鑒定

2.1.1 病毒PCR檢測 對病料上清液進行PCR鑒定，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0% 瓊脂糖凝膠電泳后，在約270 bp處可見單一條帶（圖1），與預(yù)期大小一致。

M，DL2000 DNA Marker;1，陽性對照；2，陰性對照；3，病料上清液M，DL2000 DNA Marker；1，Positive control;2，Negative control；3，Supernatant of diseased material圖1 病毒PCR檢測結(jié)果Fig.1 PCR detection results of virus

2.1.2 病毒分離和病變觀察 將過濾除菌后的DTMUV陽性組織上清液用DF-1細胞和9日齡SPF雞胚進行分離培養(yǎng)。 接種DF-1細胞后，在接種48 h即出現(xiàn)CPE，接種48 h后細胞變圓脫落，折光性增強（圖2）。病毒在DF1細胞上穩(wěn)定增殖，可連續(xù)傳至5代。雞胚接種病毒液72～96 h出現(xiàn)死亡，死亡雞胚胚體發(fā)育不良、有出血斑，剖檢可見肝臟發(fā)黃并有出血點（圖3）。

A，正常DF-1細胞；B，病毒感染的DF-1細胞A，Normal DF-1 cells；B，DF-1 cells infected by virus圖2 病毒感染后DF-1細胞的病變情況（100×）Fig.2 The pathological changes of DF-1 cells after virus infection （100×）

1、2，正常雞胚；3～7，病毒感染雞胚1 and 2，Normal chicken embryos；3-7，Chicken embryos infected by virus圖3 病毒感染后雞胚病變情況Fig.3 Pathological changes of chicken embryos after virus infection

2.1.3 病毒HA及E基因鑒定 HA檢測結(jié)果表明，病毒對雞紅細胞無血凝活性。對第5代雞胚尿囊液進行PCR鑒定，結(jié)果顯示，在約1 517 bp可見與預(yù)期大小一致的單一E基因條帶（圖4），提示成功分離病毒，并命名為AX2020株。

M，DL2000 DNA Marker；1，陽性對照；2，陰性對照；3，尿囊液M,DL2000 DNA Marker;1,Positive control;2,Negative control;3,Allantotic fluid圖4 病毒E基因PCR檢測結(jié)果Fig.4 PCR detection results of E gene of virus

2.2 病毒純化及電鏡觀察

經(jīng)超速離心后，在25%、45%不連續(xù)蔗糖梯度間可見灰色病毒帶，將其取出用3%磷鎢酸負染后，經(jīng)透射電鏡觀察可見球型的病毒粒子，直徑大小為30～60 nm，與DTMUV粒子形態(tài)一致（圖5）。

圖5 AX2020株電鏡觀察結(jié)果（98 000×）Fig.5 Electron microscopic observation of AX2020 strain （98 000×）

2.3 病毒W(wǎng)estern blotting及IFA鑒定結(jié)果

用DTMUV E蛋白單克隆抗體孵育后，經(jīng)Western blotting鑒定，發(fā)現(xiàn)60 ku處有特異性條帶（圖6），與E蛋白大小一致，說明DTMUV分離株AX2020感染DF-1細胞后，能夠正常合成E蛋白。IFA鑒定結(jié)果表明，接種了病毒的DF-1細胞其胞質(zhì)中可見明亮的特異性熒光（綠色熒光信號），而未接種病毒的DF-1細胞無特異熒光（圖7），說明病毒感染DF-1細胞后能夠表達相關(guān)蛋白。

圖6 AX2020株Western blotting結(jié)果Fig.6 Western blotting results of AX2020 strain

圖7 AX2020株IFA鑒定（200×）Fig.7 Identification of AX2020 strain by IFA （200×）

2.4 動物回歸試驗結(jié)果

將第5代純化后的病毒肌內(nèi)注射30日齡健康的北京鴨，接種后3 d眼角出現(xiàn)淚痕，精神不振，食欲下降，6 d排褐色稀便，出現(xiàn)站立不穩(wěn)、癱瘓、共濟失調(diào)等神經(jīng)癥狀，第8天死亡1只。剖檢死亡鴨可見腦膜有出血，心臟腫大淤血,心包積液，肝臟腫大淤血、表面有彌散性大小不一的出血點，脾臟腫大呈大理石樣，肺臟出血，胰腺出血，對照組無明顯變化（圖8）。試驗組發(fā)病率為100%，死亡率為10%。

圖8 組織病理結(jié)果Fig.8 Histopathological results

2.5 囊膜蛋白序列分析結(jié)果

利用Mega 6.0將本研究分離的AX2020株與GenBank中其他已發(fā)表的黃病毒屬的毒株進行囊膜蛋白的遺傳進化分析，結(jié)果表明，DTMUVE基因核苷酸系統(tǒng)進化樹分為2支，AX2020株與GA株（MK907880.1）相似性達99.1%，親緣關(guān)系最近，并與HB2010株（MN649262.1）在同一進化分支上（圖9）。序列比對發(fā)現(xiàn)，AX2020株與納米比亞的巴格扎病毒（MW672101.1）核苷酸相似性最近，為72.6%，與印度尼西亞的登革病毒（AY858036.2）核苷酸相似性為58.1%;AX2020分離株與商品滅活疫苗HB2010株和活疫苗FX2010相比，與商品滅活疫苗HB2010株核苷酸相似性為97.4%，而與活疫苗FX2010株相比核苷酸相似性略低，為97.3%（表2）。E蛋白氨基酸相似性比對結(jié)果顯示，AX2020株與其他DTMUV參考株相似性為95.0%～99.8%（表2）。與HB2010和FX2010株相比，AX2020株第93位氨基酸由K變?yōu)镽，第277位由S變?yōu)镹,第487位由A變?yōu)閂，此外與活疫苗FX2010株相比，第38位由K變?yōu)镽；與WFZ_2012株（KC990545.1）相比，AX2020株E蛋白的156位為由P變?yōu)镾（表3）。

圖9 DTMUV E基因核苷酸進化樹Fig.9 Phylogenetic tree of DTMUV E gene nucleotide

表2 E基因核苷酸和氨基酸相似性比對Table 2 Similarity comparison of nucleotides and amino acids of E gene

續(xù)表

表3 DTMUV分離株氨基酸突變位點Table 3 Amino acid mutation sites of DTMUV isolate

3 討 論

鴨坦布蘇病毒病嚴重威脅著中國養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展，在中國東南沿海主要鴨養(yǎng)殖地區(qū)均有該病的發(fā)生與流行，感染鴨的體重和產(chǎn)蛋量大幅下降，卵巢萎縮出血，發(fā)病率極高[22]。因此了解DTMUV的病原學(xué)和流行病學(xué)對控制該病發(fā)生非常重要。通過RT-PCR、透射電鏡、Western blotting及IFA進行鑒定，并對分離毒株進行了囊膜蛋白測序和遺傳進化分析，以了解其病原學(xué)特性及其進化規(guī)律。在病毒的分離試驗中，最先采用Vero細胞進行分離培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，該毒株在Vero細胞上適應(yīng)3代以上才能產(chǎn)生CPE，這可能會導(dǎo)致病毒毒力減弱或基因組的突變。鑒于此，嘗試采用DF-1細胞進行分離培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種后48 h即可觀察到明顯CPE，建立了DTMUV低代次分離培養(yǎng)的方法，為其病原學(xué)特性評價和遺傳進化分析奠定了基礎(chǔ)。電鏡下觀察到DTMUV粒子直徑與早期報道之間略有不同，Su等[6]和Yan等[7]從受感染的DEF細胞的超薄切片中測得病毒粒子直徑為30～45 nm。本試驗觀察到的病毒粒子直徑為30～60 nm，且大小不均一,可能是由于標本處理方法不同，通過3%磷鎢酸負染觀察到的病毒呈真實大小，而超薄切片尤其是在包埋時會導(dǎo)致細胞收縮，使觀察到的病毒粒子變?。稽S病毒成熟病毒粒子與未成熟病毒粒子相比直徑較小，本試驗采用雞胚培養(yǎng)病毒時凍融尿囊液會把細胞中不成熟病毒粒子釋放出來，導(dǎo)致病毒粒子大小不均一[23]。動物回歸試驗顯示，攻毒鴨全部感染，死亡率達到10%，感染鴨出現(xiàn)的癥狀與DTMUV典型癥狀基本一致[24]，說明AX2020株為高致病性毒株。遺傳進化分析結(jié)果顯示，分離株E蛋白核苷酸序列與其他鴨源毒株相似性較高（89.2%～99.1%），與鵝源、雞源TMUV相似性分別為96.4%、97.3%，說明該病毒與鵝源、雞源TMUV在病毒起源和進化上存在緊密關(guān)聯(lián)。AX2020分離株與泰國DKTHCU-1株（KR061333.1）在同一進化分支上，表明分離株可能與泰國病毒的傳播緊密相關(guān)。 這表明DTMUV在遺傳上具有一定的差異性,引起差異性的原因可能是由于不同地區(qū)的DTMUV在進化過程中逐漸變異。

DTMUV囊膜蛋白E蛋白是最主要的抗原結(jié)構(gòu)，含有多種抗原表位來識別受體，在病毒入侵時誘發(fā)機體產(chǎn)生中和性抗體，是研制疫苗時的靶蛋白[25]，黃病毒屬的乙型腦炎病毒E蛋白氨基酸的突變可影響病毒的毒力及神經(jīng)侵襲力[26]。 對DTMUVE基因序列分析顯示，AX2020分離株與商品滅活疫苗HB2010株和活疫苗FX2010相比，結(jié)構(gòu)域Ⅱ的第93位氨基酸由K變?yōu)镽，第277位由S變?yōu)镹，這2個位點的突變可能會導(dǎo)致分離株中和作用和血凝活性的改變，結(jié)構(gòu)域外第487位由A變?yōu)閂。此外，與活疫苗FX2010株相比，結(jié)構(gòu)域Ⅰ的第38位由K變?yōu)镽，可能會影響分離株的血清學(xué)和生物活性。與WFZ_2012株相比，DTMUV分離株E蛋白的156位由P變?yōu)镾，可使病毒更加高效地復(fù)制和傳播[13]。這些氨基酸的突變可能影響DTMUV的抗原性，導(dǎo)致現(xiàn)有疫苗的免疫保護不完全并引起新的流行。因此，應(yīng)持續(xù)加強DTMUV在生產(chǎn)中的流行病學(xué)監(jiān)測和遺傳變異情況分析，同時采取加強生物安全管理、研發(fā)新型疫苗等措施，控制該病的傳播和流行，保障中國鴨養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。

4 結(jié) 論

本研究成功分離得到1株具有DTMUV分子特征的毒株AX2020株，可在DF-1細胞上穩(wěn)定增殖產(chǎn)生典型CPE并致死雞胚，感染雛鴨后產(chǎn)生典型的DTMUV感染癥狀。AX2020株囊膜蛋白與國內(nèi)現(xiàn)有疫苗株相比第93、277、487位氨基酸發(fā)生了突變，本研究結(jié)果為進一步開展針對DTMUV變異毒株的疫苗及其防控研究奠定了基礎(chǔ)。