邱潤輝,關(guān)飛虎,陶婷婷,李 佳,趙天藝,鄧興梅,史 超,孫志華,2,3,張 輝,2,3
(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,石河子 832000;2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)動(dòng)物疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子 832000;3.動(dòng)物健康養(yǎng)殖國家國際聯(lián)合研究中心,石河子 832000)
Ⅳ分泌系統(tǒng)(T4SS)是布魯氏菌重要的毒力因子,在布魯氏菌感染期間,Ⅳ分泌系統(tǒng)可通過分泌效應(yīng)蛋白干擾宿主細(xì)胞免疫信號(hào)通路,降低宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng),抵御宿主細(xì)胞的殺菌功能,以促進(jìn)布魯氏菌在胞內(nèi)的持續(xù)性感染[1-2]。目前有許多關(guān)于布魯氏菌Ⅳ分泌系統(tǒng)的效應(yīng)蛋白被相繼報(bào)道,如BtpA可以抑制樹突狀細(xì)胞的成熟,破壞Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)的信號(hào)傳遞,降低NF-κB信號(hào)通路活性[3];效應(yīng)蛋白R(shí)icA可以促進(jìn)含有布魯氏菌的胞內(nèi)體與晚期溶酶體相結(jié)合,提高胞內(nèi)體的酸性環(huán)境,誘導(dǎo)布魯氏菌表達(dá)、組裝分泌蛋白[4-5];BspB定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和血漿膜,它可以改變宿主細(xì)胞蛋白囊泡運(yùn)輸途徑,為布魯氏菌的胞內(nèi)寄生提供更多的營養(yǎng)物質(zhì),增強(qiáng)布魯氏菌的胞內(nèi)復(fù)制能力[6]。由此可見,分泌蛋白對(duì)于布魯氏菌的免疫逃逸和胞內(nèi)寄生具有重要意義。近年來,已通過CyaA報(bào)告系統(tǒng)鑒定獲得布魯氏菌分泌蛋白BPE005,但關(guān)于BPE005的相關(guān)生物學(xué)功能研究鮮見報(bào)道[7]。
酵母雙雜交系統(tǒng)(yeast two-hybrid system)巧妙地利用了真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的組件式特性,一個(gè)完整的酵母轉(zhuǎn)錄因子包括DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain,DNA-BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain,AD)2個(gè)部分,如果把這2個(gè)結(jié)構(gòu)域強(qiáng)制分開,任何一部分都不具備一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄因子的功能,則不能啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。利用這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn),分別將BD結(jié)構(gòu)域與蛋白X融合,構(gòu)建出BD-X質(zhì)粒載體;AD結(jié)構(gòu)域與cDNA文庫融合,構(gòu)建出AD-Y質(zhì)粒載體;將2個(gè)穿梭質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)化至酵母體內(nèi)表達(dá)。酵母菌本身無報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性,但是如果蛋白X和Y可以產(chǎn)生相互作用就會(huì)導(dǎo)致BD-X與AD-Y在空間上的接近,從而激活下游報(bào)告基因的表達(dá)。表達(dá)了相應(yīng)報(bào)告基因的酵母菌不僅能夠在特定營養(yǎng)缺陷型的培養(yǎng)基上生長,而且能對(duì)酵母細(xì)胞毒素金擔(dān)子素(AbA)表現(xiàn)出良好的抗性[8-10]。
本研究擬分析布魯氏菌分泌蛋白BPE005的亞細(xì)胞定位,利用小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 mRNA的cDNA文庫,通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選宿主細(xì)胞內(nèi)與BPE005存在相互作用的蛋白,以期為進(jìn)一步研究布魯氏菌分泌蛋白BPE005的生物學(xué)功能和布魯氏菌的致病機(jī)制提供參考。
1.1.1 菌株、細(xì)胞及質(zhì)粒 牛種布魯氏菌S2308、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞及人胚腎細(xì)胞株293T均由新疆石河子大學(xué)動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存;Y2HGold、Y187Yeast酵母菌株及PGBKT7、PGADT7質(zhì)粒均購自上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司。
1.1.2 主要試劑 小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 mRNA酵母雙雜交AD文庫菌液由新疆石河子大學(xué)動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存;DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清均購自Gibco公司;轉(zhuǎn)染試劑購自Zeta Life公司;質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司;EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司;Super DNA Marker購自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司;酵母試驗(yàn)相關(guān)試劑(如各種缺陷型培養(yǎng)基、金擔(dān)子素A等)購自陜西普因特生物工程有限公司。
1.2.1 布魯氏菌分泌蛋白BPE005的生物信息學(xué)分析 根據(jù)GenBank中牛種布魯氏菌S2308的BPE005基因序列(登錄號(hào):CP046720.1),利用ProtParam在線軟件(https:∥web.expasy.org/protparam)進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析;利用ProtScale在線軟件(https:∥web.expasy.org/protscale)進(jìn)行蛋白親/疏水性預(yù)測;利用SignalP-4.1在線軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1)進(jìn)行蛋白信號(hào)肽預(yù)測;利用PSORTⅡ在線軟件(https:∥www.genscript.com/psort.html)進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位;利用SOPMA在線軟件(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat)進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測;利用SWISS-MODEL在線軟件(https:∥swissmodel.expasy.org)進(jìn)行蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測。
1.2.2 酵母誘餌質(zhì)粒PGBKT7-BPE005和熒光定位質(zhì)粒PDSRED2-C1-BPE005的構(gòu)建 以流產(chǎn)型布魯氏菌S2308為模板,用BPE005的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物序列為:F:5′-GGAATTCC-ATGGCGCTGACGA-3′;R:5′-CGGATCCGTCA-GTCGCGGTT-3′,劃線部分為EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
PCR反應(yīng)體系20 μL:模板2 μL,上、下游引物各0.4 μL,2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL,ddH2O 9.7 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性40 s,57 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與PGBKT7、BPRESRED-C1連接,構(gòu)建PGBKT7-BPE005誘餌重組質(zhì)粒和PDSRED2-C1-BPE005熒光定位質(zhì)粒,重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定后由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序鑒定。
1.2.3 BPE005的亞細(xì)胞定位 293T細(xì)胞接種于預(yù)先放置好干凈無菌蓋玻片的6孔板內(nèi),接種密度為50%。細(xì)胞完全貼壁時(shí),將轉(zhuǎn)染試劑與重組質(zhì)粒PDSRED2-C1-BPE005按照1∶1混合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物,移液器反復(fù)吹打轉(zhuǎn)染復(fù)合物10~15次后移至6孔板中,輕輕混勻,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱,培養(yǎng)24 h后取出蓋玻片使用4%多聚甲醛進(jìn)行固定。PBS清洗3遍,加入含有抗熒光淬滅劑的DAPI進(jìn)行核染色后將蓋玻片扣在載玻片上,使用掃描激光共聚焦顯微鏡觀察BPE005在細(xì)胞中的位置。
1.2.4 誘餌基因的轉(zhuǎn)化、自激活和毒性檢測 活化Y2HGold酵母菌株,挑取1個(gè)大小為2~3 mm的單克隆于3 mL的YPDA中,培養(yǎng)8 h后吸取5 μL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至50 mL YPDA培養(yǎng)基中,30 ℃、240 r/min培養(yǎng)至D600 nm值為0.3;2 000 r/min離心5 min收集菌體,1.1×TE/LiAC溶液重懸菌體;加入預(yù)變性的Carrier DNA、1×PEG/LiAC和目的質(zhì)粒緩慢混勻;30 ℃水浴30 min,加入DMSO混勻,42 ℃水浴熱擊15 min,2 000 r/min離心5 min收集菌體;用1 mL YPD Plus液體培養(yǎng)基重新懸浮,30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)1 h,高速離心,棄上清用0.9% NaCl溶液重新懸浮細(xì)胞;100倍稀釋后涂布于含SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal的100 mm平板。
1.2.5 AD文庫的滴度測定 室溫水浴鍋中融化1 mL AD菌液,取10 μL稀釋10 000倍涂布于SD/-Leu固體培養(yǎng)基,觀察SD/-Leu板上是否有超過200個(gè)克隆。
1.2.6 mating法雙雜交文庫篩選 取50 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基,30 ℃、240 r/min過夜培養(yǎng)至D600 nm值為0.8,經(jīng)轉(zhuǎn)化后含有PGBKTT7-BPE00重組質(zhì)粒的Y2HGOLD 1 000 r/min離心5 min,倒掉上清液,用4~5 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,使細(xì)胞密度>1×108/mL;將1 mL AD細(xì)菌液和4~5 mL BD細(xì)菌液置于2 L無菌的錐形瓶中,加入45 mL 2×YPDA(含有50 μg/mL Kan+)的液體培養(yǎng)基,在30 ℃搖床上30~50 r/min低速振蕩培養(yǎng)24 h;20 h后,40×顯微鏡下觀察雜交液是否出現(xiàn)三葉草形狀的結(jié)合子,沒有則繼續(xù)培養(yǎng)4 h,有則離心收集細(xì)胞,并以0.9 % NaCl重懸;取40 μL重懸液稀釋1 000倍,取100 μL涂布于直徑90 mm的SD/-Trp/-Leu/-Ade和SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His固體培養(yǎng)基上(含有1 mmol/L 3AT),30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3~5 d。
1.2.7 陽性克隆酵母質(zhì)粒抽提與擴(kuò)增 挑取在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His固體培養(yǎng)基上生長的白色陽性克隆,通過SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至D600 nm值為0.8,使用酵母質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提;所提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂布在氨芐霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上,37 ℃過夜培養(yǎng);生長的菌落接種到含有氨芐霉素抗性的的LB液體培養(yǎng)基中,提取文庫質(zhì)粒,由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行基因測序,測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。
1.2.8 Prey質(zhì)粒與Bait質(zhì)粒一對(duì)一互作驗(yàn)證 誘餌質(zhì)粒與篩選得到的文庫質(zhì)粒進(jìn)行一對(duì)一共轉(zhuǎn)化,共轉(zhuǎn)化的酵母感受態(tài)涂布于SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His-AbA固體培養(yǎng)基上,30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3~5 d,驗(yàn)證誘餌蛋白和獵物蛋白的相互作用。
1.2.9 RNA聚合酶Ⅱ多肽G蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 根據(jù)GenBank中RNA聚合酶Ⅱ多肽G的蛋白序列(登錄號(hào):NP_002687.1),運(yùn)用STRING在線工具(https:∥cn.string-db.org/cgi)分析RNA聚合酶Ⅱ多肽G蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)。
布魯氏菌分泌蛋白BPE005共含有462個(gè)氨基酸殘基,主要由Gly(31.0%)、Cys(31.0%)、Thr(20.8%)、Ala(17.3%)構(gòu)成(圖1);幾乎不含有親水區(qū)域,屬于疏水蛋白(圖2);C、Y、S的最大值分別為0.148、0.304、0.795,屬于分泌型蛋白(圖3)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示,BPE005蛋白位于細(xì)胞外的可能性較高,為39.1%;位于細(xì)胞核的可能性為30.4%;位于線粒體的可能性為21.7%;位于過氧化物酶體和高爾基體的可能性均為4.3%(圖4)。二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測表明,BPE005蛋白內(nèi)含有大量的無規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈,β-轉(zhuǎn)角占比較少(圖5),預(yù)示BPE005可能有許多活性位點(diǎn)(圖6)。
圖1 BPE005蛋白的氨基酸組成Fig.1 Aamino acid composition of BPE005 protein
圖2 BPE005蛋白親/疏水性預(yù)測Fig.2 Hydrophilicity and hydrophobicity prediction of BPE005 protein
圖3 BPE005蛋白信號(hào)肽預(yù)測Fig.3 Signal peptide prediction of BPE005 protein
圖4 BPE005蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測Fig.4 Subcellular localization prediction of BPE005 protein
h,α-螺旋;c,無規(guī)則卷曲;t,β-轉(zhuǎn)角;e,延伸鏈h,Alpha helix;c,Random coil;t,Beta turn;e,Extended chain圖5 BPE005蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Secondary structure prediction of BPE005 protein
圖6 BPE005蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Tertiary structure prediction of BPE005 protein
以牛種布魯氏菌S2308作為模板,利用PCR反應(yīng)對(duì)BPE005進(jìn)行特異性擴(kuò)增,擴(kuò)增片段大小約為462 bp(圖7A),與預(yù)期片段長度相符,表明擴(kuò)增成功。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒PGBKT7、PDSRED2-C1經(jīng)EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ雙酶切后連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,目的片段大小約為462 bp(圖7B、7C),均與預(yù)期相符。陽性菌液經(jīng)測序比對(duì)分析,其相似性為100%,表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。
A,BPE005基因PCR擴(kuò)增電泳圖;B,PGBKTE-BPE005載體雙酶切電泳圖;C,PDSRED2-C1-BPE005載體雙酶切電泳圖A,Gene electrophoregram of BPE005 gene amplified by PCR;B,Electrophoregram of PGBKTE-BPE005 vector digested by double endonuclease;C,Electrophoregram of PDSRED2-C1-BPE005 vector digested by double endonuclease圖7 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定Fig.7 Construction and identification of recombinant plasmid
將PDSRED2-C1-BPE005轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,24 h后經(jīng)4%多聚甲醛固定、PBS清洗、DAPI核染色后封片,10 μm掃描激光共聚焦顯微鏡下觀察BPE005的細(xì)胞定位情況,可以看到紅光(BPE005)均位于藍(lán)光(細(xì)胞核)之上(圖8),表明BPE005是一種定位于細(xì)胞核的布魯氏菌分泌蛋白。
圖8 BPE005蛋白亞細(xì)胞定位(400×)Fig.8 Subcellular localization of BPE005 protein (400×)
分別將誘餌質(zhì)粒PGBKT7-BPE005和空載質(zhì)粒PGBKT7轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞Y2HGold中,涂布于SD/-Trp/X-α-Gal固體培養(yǎng)基上,2個(gè)平板上均有形態(tài)、大小相似的白色菌落(圖9A),數(shù)量差異可能來源于轉(zhuǎn)化效率,表明誘餌質(zhì)粒對(duì)酵母無毒性影響。將含有PGBKT7-BPE005的Y2HGold分別涂布于SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal,前者生長出白色菌落(圖9B),后者并未有菌落生長(圖9C),表明誘餌質(zhì)粒無自激活現(xiàn)象。
A,含有PGBKT7的Y2HGold菌株涂布于SD/-Trp/X-α-Gal固體培養(yǎng)基;B,含有PGBKT7-BPE005的Y2HGold菌株涂布于SD/-Trp/X-α-Gal固體培養(yǎng)基;C,含有PGBKT7-BPE005的Y2HGold菌株涂布SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal固體培養(yǎng)基A,Strain Y2HGold containing PGBKT7 was coated on SD/-Trp/X-α-Gal solid medium;B,Strain Y2HGold containing PGBKT7-BPE005 was coated on SD/-Trp/X-α-Gal solid medium;C,Strain Y2HGold containing PGBKT7-BPE005 was coated on SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal solid medium圖9 誘餌蛋白毒性和自激活檢測Fig.9 Detection of toxicity and self-activation of bait protein
涂布于SD/-Leu固體培養(yǎng)基的稀釋10 000倍的酵母AD文庫菌液生長出超過200個(gè)陽性克隆(圖10),表明AD文庫菌液符合所需滴度,可以進(jìn)行后續(xù)的酵母雙雜交。
圖10 文庫滴度測定Fig.10 Titer determination of library
將含有重組誘餌載體的酵母菌株與含有AD文庫的酵母菌株振蕩培養(yǎng)進(jìn)行雜交,可以在40×的光學(xué)顯微鏡下觀察到雜交細(xì)胞類似于米老鼠頭像,之后將雜交菌液稀釋后分別涂布于SD/-Trp/-Leu/-Ade和SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His平板上進(jìn)行第一步篩選,在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His平板上篩選得到11個(gè)陽性菌落(圖11)。挑選陽性克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,提取陽性文庫質(zhì)粒并測序,基于測序結(jié)果進(jìn)行了BLAST比對(duì)分析,初步獲得與布魯氏菌分泌蛋白BPE005存在相互作用的4個(gè)蛋白:RNA聚合酶Ⅱ多肽G、補(bǔ)體因子H、鳥苷酸環(huán)化酶2G及顆粒蛋白(表1)。
A,光學(xué)顯微鏡下觀察雜交細(xì)胞(40×);B,雜交后的酵母菌液涂布于SD/-Trp/-Leu/-Ade固體培養(yǎng)基;C,雜交后的酵母菌液涂布于SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His固體培養(yǎng)基A,The hybrid cells were observed under light microscope (40×);B,The hybrid yeast liquid was coated on SD/-Trp/-Leu/-Ade solid medium;C,The hybrid yeast liquid was coated on SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His solid medium圖11 酵母雙雜交篩選Fig.11 Yeast two-hybrid screening
表1 BPE005的相互作用蛋白Table 1 Interacting protein of BPE005
將誘餌質(zhì)粒分別與篩選到的4個(gè)文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化于酵母Y2HGold中,培養(yǎng)后的4株Y2HGold分別100倍稀釋涂布于SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His-AbA培養(yǎng)基,結(jié)果顯示,僅同時(shí)含有RNA聚合酶Ⅱ的文庫質(zhì)粒和BPE005誘餌質(zhì)粒的Y2HGold能在該培養(yǎng)基上生長(圖12),說明RNA聚合酶Ⅱ和BPE005具有較強(qiáng)的相互作用。
圖12 酵母共轉(zhuǎn)驗(yàn)證Fig.12 Verification of yeast co-transformation
通過STRING在線軟件分析RNA聚合酶Ⅱ的蛋白互作網(wǎng)絡(luò),結(jié)果顯示,RNA聚合酶Ⅱ多肽G主要與RNA聚合酶Ⅱ多肽A(Polr2a)、RNA聚合酶Ⅱ多肽B(Polr2b)、RNA聚合酶Ⅱ多肽C(Polr2c)等11個(gè)蛋白發(fā)生相互作用(圖13),它們的聚合共同組成了完整的RNA聚合酶Ⅱ。
圖13 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析Fig.13 Protein-protein interaction network analysis
布魯氏菌作為成熟的胞內(nèi)寄生菌,廣泛的傳播途徑和成功的免疫逃逸機(jī)制使其被列為中國法律規(guī)定必須報(bào)告的二類動(dòng)物疫病[11]。研究表明,布魯氏菌不產(chǎn)生外毒素,沒有莢膜、菌毛、質(zhì)粒,缺乏內(nèi)毒素特性的脂多糖,但是布魯氏菌仍然具有較強(qiáng)的侵襲能力,能抵抗外界低氧、低pH、高活性氧的惡劣環(huán)境,因此研究布魯氏菌的毒力因子和侵襲手段,是了解布魯氏菌逃避宿主免疫應(yīng)答機(jī)制所必需的[12-14]。
目前已經(jīng)報(bào)道的布魯氏菌的毒力基因有脂多糖、T4SS、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、環(huán)狀β-1-2-葡聚糖、脲酶、細(xì)胞色素氧化酶、一氧化氮還原酶、雙組分調(diào)控系統(tǒng)等,這些毒力基因在協(xié)助布魯氏菌入侵和胞內(nèi)生存,以及逃避宿主免疫應(yīng)答方面都發(fā)揮著重要作用[15-16]。有報(bào)道稱,Ⅳ型分泌系統(tǒng)缺失的布魯氏菌對(duì)于體外刺激更加敏感,且無法使其喪失在胞內(nèi)持續(xù)存活的能力,因此研究布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)的功能成為當(dāng)前的熱點(diǎn)問題[17-18]。本試驗(yàn)對(duì)布魯氏菌T4SS效應(yīng)蛋白BPE005蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步分析,發(fā)現(xiàn)BPE005具有多個(gè)活性結(jié)合位點(diǎn),預(yù)示著BPE005可能極易與宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白發(fā)生相互作用,繼而影響宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答途徑。亞細(xì)胞定位結(jié)果發(fā)現(xiàn),BPE005定位于宿主細(xì)胞的細(xì)胞核。細(xì)胞核是存在于真核細(xì)胞中的封閉式膜狀胞器,內(nèi)部含有細(xì)胞中大多數(shù)的遺傳物質(zhì),是細(xì)胞遺傳與代謝的調(diào)控中心,生命活動(dòng)必需的基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物的加工過程均在此進(jìn)行[19-20]。BPE005定位于細(xì)胞核,預(yù)示著其可能對(duì)于影響宿主細(xì)胞周期調(diào)控及遺傳密碼翻譯具有十分重要的作用。
分泌蛋白在行使功能時(shí)往往是通過與宿主特定靶蛋白相互結(jié)合而發(fā)揮功能,本試驗(yàn)通過酵母雙雜交系統(tǒng)首次鑒定出4個(gè)宿主細(xì)胞內(nèi)與布魯氏菌分泌蛋白BPE005存在相互作用的靶蛋白,分別是補(bǔ)體因子H、鳥苷酸環(huán)化酶、顆粒體蛋白和RNA聚合酶Ⅱ多肽G。補(bǔ)體因子H可通過結(jié)合補(bǔ)體因子C3b,抑制膜攻擊復(fù)合物的形成,從而阻止細(xì)胞裂解,對(duì)補(bǔ)體激活中的旁路途徑起到負(fù)反饋的作用[21-22]。鳥苷酸環(huán)化酶(cGMP)屬于環(huán)化核苷酸的一種,可被G蛋白偶聯(lián)受體激活的蛋白激酶活化,進(jìn)而將胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核[23]。顆粒體蛋白是近年來發(fā)現(xiàn)的一個(gè)獨(dú)立的生長因子家族,由GRN基因編碼。它的前體蛋白又稱畸胎瘤細(xì)胞源性生長因子,能降低腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達(dá),抑制中性粒細(xì)胞的活性[24]。RNA聚合酶Ⅱ多肽G是“轉(zhuǎn)錄機(jī)器”的主要成分,不僅直接參與生物體RNA的合成,而且可以作為核酶催化一些重要的生化反應(yīng),在細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控及生物體的生長發(fā)育中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[25]。這些互作蛋白的鑒定,對(duì)后續(xù)研究BPE005的生物學(xué)功能具有十分重要的指導(dǎo)意義。
酵母雙雜交系統(tǒng)在1989年由Fields在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中首次建立,目前已成為鑒定及分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的最常用且最有效的工具之一[8]。但是雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi),而許多蛋白間的相互作用依賴于核外的翻譯后加工修飾,如糖基化、二硫鍵形成等,依賴于其他分子伴侶的輔助,這些反應(yīng)在核內(nèi)是無法進(jìn)行的,酵母雙雜交系統(tǒng)不能有效地篩選出這些蛋白,因此仍然有許多與BPE005存在相互作用的蛋白沒有被篩選到。另外,某些蛋白自身具有激活轉(zhuǎn)錄功能,或表面含有對(duì)多種蛋白質(zhì)的低親和力區(qū)域,能與其他蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的復(fù)合物,這些都會(huì)引發(fā)報(bào)告基因的表達(dá),產(chǎn)生“假陽性結(jié)果”?!凹訇栃浴眴栴}是影響酵母雙雜交試驗(yàn)成功與否的重要因素,本試驗(yàn)采取酵母一對(duì)一共轉(zhuǎn)驗(yàn)證法,以更加嚴(yán)格的篩選條件證明了BPE005與RNA聚合酶Ⅱ多肽G具有更強(qiáng)的相互作用,由于RNA聚合酶Ⅱ也定位于細(xì)胞核,推測BPE005可能是在細(xì)胞核上通過與RNA聚合酶Ⅱ相互作用從而發(fā)揮其生物作用。STRING相互作用網(wǎng)絡(luò)分析表明,RNA聚合酶Ⅱ多肽G主要催化DNA的轉(zhuǎn)錄,合成mRNA和大多數(shù)snRNA、微RNA的前體,對(duì)于控制轉(zhuǎn)錄過程影響基因表達(dá)的模式、維持細(xì)胞生存所需的代謝過程、幫助細(xì)胞適應(yīng)不同的環(huán)境具有重要意義[26]。布魯氏菌T4SS效應(yīng)蛋白BPE005是否會(huì)通過與RNA聚合酶Ⅱ多肽G的結(jié)合繼而影響宿主細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控,以抑制布魯氏菌感染期間宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答仍不清楚,研究其相互作用的生物學(xué)意義將是今后的重點(diǎn)方向。
布魯氏菌T4SS效應(yīng)蛋白BPE005定位于宿主細(xì)胞核,在宿主細(xì)胞內(nèi)BPE005與RNA聚合酶Ⅱ多肽G具有較強(qiáng)相互作用,提示布魯氏菌分泌蛋白BPE005將通過影響宿主細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控以抵抗宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答。