邱潤(rùn)輝，關(guān)飛虎，陶婷婷，李 佳，趙天藝，鄧興梅，史 超，孫志華,2,3，張 輝,2,3

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832000；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)動(dòng)物疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832000；3.動(dòng)物健康養(yǎng)殖國(guó)家國(guó)際聯(lián)合研究中心，石河子 832000）

Ⅳ分泌系統(tǒng)（T4SS）是布魯氏菌重要的毒力因子，在布魯氏菌感染期間，Ⅳ分泌系統(tǒng)可通過分泌效應(yīng)蛋白干擾宿主細(xì)胞免疫信號(hào)通路，降低宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)，抵御宿主細(xì)胞的殺菌功能，以促進(jìn)布魯氏菌在胞內(nèi)的持續(xù)性感染[1-2]。目前有許多關(guān)于布魯氏菌Ⅳ分泌系統(tǒng)的效應(yīng)蛋白被相繼報(bào)道，如BtpA可以抑制樹突狀細(xì)胞的成熟，破壞Toll樣受體（Toll-like receptor,TLR）的信號(hào)傳遞，降低NF-κB信號(hào)通路活性[3]；效應(yīng)蛋白R(shí)icA可以促進(jìn)含有布魯氏菌的胞內(nèi)體與晚期溶酶體相結(jié)合，提高胞內(nèi)體的酸性環(huán)境，誘導(dǎo)布魯氏菌表達(dá)、組裝分泌蛋白[4-5]；BspB定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和血漿膜，它可以改變宿主細(xì)胞蛋白囊泡運(yùn)輸途徑，為布魯氏菌的胞內(nèi)寄生提供更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，增強(qiáng)布魯氏菌的胞內(nèi)復(fù)制能力[6]。由此可見，分泌蛋白對(duì)于布魯氏菌的免疫逃逸和胞內(nèi)寄生具有重要意義。近年來，已通過CyaA報(bào)告系統(tǒng)鑒定獲得布魯氏菌分泌蛋白BPE005，但關(guān)于BPE005的相關(guān)生物學(xué)功能研究鮮見報(bào)道[7]。

酵母雙雜交系統(tǒng)（yeast two-hybrid system）巧妙地利用了真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的組件式特性，一個(gè)完整的酵母轉(zhuǎn)錄因子包括DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain，DNA-BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain，AD）2個(gè)部分，如果把這2個(gè)結(jié)構(gòu)域強(qiáng)制分開，任何一部分都不具備一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄因子的功能，則不能啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。利用這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，分別將BD結(jié)構(gòu)域與蛋白X融合，構(gòu)建出BD-X質(zhì)粒載體；AD結(jié)構(gòu)域與cDNA文庫(kù)融合，構(gòu)建出AD-Y質(zhì)粒載體；將2個(gè)穿梭質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)化至酵母體內(nèi)表達(dá)。酵母菌本身無報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性，但是如果蛋白X和Y可以產(chǎn)生相互作用就會(huì)導(dǎo)致BD-X與AD-Y在空間上的接近，從而激活下游報(bào)告基因的表達(dá)。表達(dá)了相應(yīng)報(bào)告基因的酵母菌不僅能夠在特定營(yíng)養(yǎng)缺陷型的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而且能對(duì)酵母細(xì)胞毒素金擔(dān)子素（AbA）表現(xiàn)出良好的抗性[8-10]。

本研究擬分析布魯氏菌分泌蛋白BPE005的亞細(xì)胞定位，利用小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 mRNA的cDNA文庫(kù)，通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選宿主細(xì)胞內(nèi)與BPE005存在相互作用的蛋白，以期為進(jìn)一步研究布魯氏菌分泌蛋白BPE005的生物學(xué)功能和布魯氏菌的致病機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細(xì)胞及質(zhì)粒 牛種布魯氏菌S2308、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞及人胚腎細(xì)胞株293T均由新疆石河子大學(xué)動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存;Y2HGold、Y187Yeast酵母菌株及PGBKT7、PGADT7質(zhì)粒均購(gòu)自上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 mRNA酵母雙雜交AD文庫(kù)菌液由新疆石河子大學(xué)動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清均購(gòu)自Gibco公司；轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Zeta Life公司；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、T4 DNA連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司；Super DNA Marker購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；酵母試驗(yàn)相關(guān)試劑（如各種缺陷型培養(yǎng)基、金擔(dān)子素A等）購(gòu)自陜西普因特生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 布魯氏菌分泌蛋白BPE005的生物信息學(xué)分析 根據(jù)GenBank中牛種布魯氏菌S2308的BPE005基因序列（登錄號(hào)：CP046720.1），利用ProtParam在線軟件（https:∥web.expasy.org/protparam）進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析；利用ProtScale在線軟件（https:∥web.expasy.org/protscale）進(jìn)行蛋白親/疏水性預(yù)測(cè)；利用SignalP-4.1在線軟件（http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1）進(jìn)行蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)；利用PSORTⅡ在線軟件（https:∥www.genscript.com/psort.html）進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位；利用SOPMA在線軟件（https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat）進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用SWISS-MODEL在線軟件（https:∥swissmodel.expasy.org）進(jìn)行蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.2.2 酵母誘餌質(zhì)粒PGBKT7-BPE005和熒光定位質(zhì)粒PDSRED2-C1-BPE005的構(gòu)建 以流產(chǎn)型布魯氏菌S2308為模板，用BPE005的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為：F：5′-GGAATTCC-ATGGCGCTGACGA-3′；R：5′-CGGATCCGTCA-GTCGCGGTT-3′，劃線部分為EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系20 μL：模板2 μL，上、下游引物各0.4 μL，2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 9.7 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與PGBKT7、BPRESRED-C1連接，構(gòu)建PGBKT7-BPE005誘餌重組質(zhì)粒和PDSRED2-C1-BPE005熒光定位質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定后由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.3 BPE005的亞細(xì)胞定位 293T細(xì)胞接種于預(yù)先放置好干凈無菌蓋玻片的6孔板內(nèi)，接種密度為50%。細(xì)胞完全貼壁時(shí)，將轉(zhuǎn)染試劑與重組質(zhì)粒PDSRED2-C1-BPE005按照1∶1混合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，移液器反復(fù)吹打轉(zhuǎn)染復(fù)合物10～15次后移至6孔板中，輕輕混勻，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h后取出蓋玻片使用4%多聚甲醛進(jìn)行固定。PBS清洗3遍，加入含有抗熒光淬滅劑的DAPI進(jìn)行核染色后將蓋玻片扣在載玻片上，使用掃描激光共聚焦顯微鏡觀察BPE005在細(xì)胞中的位置。

1.2.4 誘餌基因的轉(zhuǎn)化、自激活和毒性檢測(cè) 活化Y2HGold酵母菌株，挑取1個(gè)大小為2～3 mm的單克隆于3 mL的YPDA中，培養(yǎng)8 h后吸取5 μL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至50 mL YPDA培養(yǎng)基中，30 ℃、240 r/min培養(yǎng)至D600 nm值為0.3；2 000 r/min離心5 min收集菌體，1.1×TE/LiAC溶液重懸菌體；加入預(yù)變性的Carrier DNA、1×PEG/LiAC和目的質(zhì)粒緩慢混勻；30 ℃水浴30 min，加入DMSO混勻，42 ℃水浴熱擊15 min，2 000 r/min離心5 min收集菌體；用1 mL YPD Plus液體培養(yǎng)基重新懸浮，30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)1 h，高速離心，棄上清用0.9% NaCl溶液重新懸浮細(xì)胞；100倍稀釋后涂布于含SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal的100 mm平板。

1.2.5 AD文庫(kù)的滴度測(cè)定 室溫水浴鍋中融化1 mL AD菌液，取10 μL稀釋10 000倍涂布于SD/-Leu固體培養(yǎng)基，觀察SD/-Leu板上是否有超過200個(gè)克隆。

1.2.6 mating法雙雜交文庫(kù)篩選 取50 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基，30 ℃、240 r/min過夜培養(yǎng)至D600 nm值為0.8，經(jīng)轉(zhuǎn)化后含有PGBKTT7-BPE00重組質(zhì)粒的Y2HGOLD 1 000 r/min離心5 min，倒掉上清液，用4～5 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度>1×108/mL；將1 mL AD細(xì)菌液和4～5 mL BD細(xì)菌液置于2 L無菌的錐形瓶中，加入45 mL 2×YPDA（含有50 μg/mL Kan+）的液體培養(yǎng)基，在30 ℃搖床上30～50 r/min低速振蕩培養(yǎng)24 h；20 h后，40×顯微鏡下觀察雜交液是否出現(xiàn)三葉草形狀的結(jié)合子，沒有則繼續(xù)培養(yǎng)4 h，有則離心收集細(xì)胞，并以0.9 % NaCl重懸；取40 μL重懸液稀釋1 000倍，取100 μL涂布于直徑90 mm的SD/-Trp/-Leu/-Ade和SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His固體培養(yǎng)基上（含有1 mmol/L 3AT），30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d。

1.2.7 陽性克隆酵母質(zhì)粒抽提與擴(kuò)增 挑取在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的白色陽性克隆，通過SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至D600 nm值為0.8，使用酵母質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提；所提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布在氨芐霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)；生長(zhǎng)的菌落接種到含有氨芐霉素抗性的的LB液體培養(yǎng)基中，提取文庫(kù)質(zhì)粒，由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

1.2.8 Prey質(zhì)粒與Bait質(zhì)粒一對(duì)一互作驗(yàn)證 誘餌質(zhì)粒與篩選得到的文庫(kù)質(zhì)粒進(jìn)行一對(duì)一共轉(zhuǎn)化，共轉(zhuǎn)化的酵母感受態(tài)涂布于SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His-AbA固體培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d，驗(yàn)證誘餌蛋白和獵物蛋白的相互作用。

1.2.9 RNA聚合酶Ⅱ多肽G蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 根據(jù)GenBank中RNA聚合酶Ⅱ多肽G的蛋白序列（登錄號(hào)：NP_002687.1），運(yùn)用STRING在線工具（https:∥cn.string-db.org/cgi）分析RNA聚合酶Ⅱ多肽G蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié) 果

2.1 布魯氏菌分泌蛋白BPE005的生物信息學(xué)分析

布魯氏菌分泌蛋白BPE005共含有462個(gè)氨基酸殘基，主要由Gly（31.0%）、Cys（31.0%）、Thr（20.8%）、Ala（17.3%）構(gòu)成（圖1）；幾乎不含有親水區(qū)域，屬于疏水蛋白（圖2）；C、Y、S的最大值分別為0.148、0.304、0.795，屬于分泌型蛋白（圖3）。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，BPE005蛋白位于細(xì)胞外的可能性較高，為39.1%；位于細(xì)胞核的可能性為30.4%；位于線粒體的可能性為21.7%；位于過氧化物酶體和高爾基體的可能性均為4.3%（圖4）。二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，BPE005蛋白內(nèi)含有大量的無規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈，β-轉(zhuǎn)角占比較少（圖5），預(yù)示BPE005可能有許多活性位點(diǎn)（圖6）。

圖1 BPE005蛋白的氨基酸組成Fig.1 Aamino acid composition of BPE005 protein

圖2 BPE005蛋白親/疏水性預(yù)測(cè)Fig.2 Hydrophilicity and hydrophobicity prediction of BPE005 protein

圖3 BPE005蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.3 Signal peptide prediction of BPE005 protein

圖4 BPE005蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Fig.4 Subcellular localization prediction of BPE005 protein

h，α-螺旋；c，無規(guī)則卷曲；t，β-轉(zhuǎn)角；e，延伸鏈h，Alpha helix;c,Random coil;t，Beta turn;e，Extended chain圖5 BPE005蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Secondary structure prediction of BPE005 protein

圖6 BPE005蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 Tertiary structure prediction of BPE005 protein

2.2 酵母誘餌質(zhì)粒PGBKT7-BPE005和熒光定位質(zhì)粒PDSRED2-C1-BPE005的構(gòu)建

以牛種布魯氏菌S2308作為模板，利用PCR反應(yīng)對(duì)BPE005進(jìn)行特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小約為462 bp（圖7A），與預(yù)期片段長(zhǎng)度相符，表明擴(kuò)增成功。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒PGBKT7、PDSRED2-C1經(jīng)EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ雙酶切后連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，目的片段大小約為462 bp（圖7B、7C），均與預(yù)期相符。陽性菌液經(jīng)測(cè)序比對(duì)分析，其相似性為100%，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。

A，BPE005基因PCR擴(kuò)增電泳圖；B，PGBKTE-BPE005載體雙酶切電泳圖；C，PDSRED2-C1-BPE005載體雙酶切電泳圖A，Gene electrophoregram of BPE005 gene amplified by PCR；B，Electrophoregram of PGBKTE-BPE005 vector digested by double endonuclease；C，Electrophoregram of PDSRED2-C1-BPE005 vector digested by double endonuclease圖7 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定Fig.7 Construction and identification of recombinant plasmid

2.3 BPE005蛋白的亞細(xì)胞定位

將PDSRED2-C1-BPE005轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，24 h后經(jīng)4%多聚甲醛固定、PBS清洗、DAPI核染色后封片，10 μm掃描激光共聚焦顯微鏡下觀察BPE005的細(xì)胞定位情況，可以看到紅光（BPE005）均位于藍(lán)光（細(xì)胞核）之上（圖8），表明BPE005是一種定位于細(xì)胞核的布魯氏菌分泌蛋白。

圖8 BPE005蛋白亞細(xì)胞定位（400×）Fig.8 Subcellular localization of BPE005 protein （400×）

2.4 誘餌基因的轉(zhuǎn)化、自激活和毒性檢測(cè)

分別將誘餌質(zhì)粒PGBKT7-BPE005和空載質(zhì)粒PGBKT7轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞Y2HGold中，涂布于SD/-Trp/X-α-Gal固體培養(yǎng)基上，2個(gè)平板上均有形態(tài)、大小相似的白色菌落（圖9A），數(shù)量差異可能來源于轉(zhuǎn)化效率，表明誘餌質(zhì)粒對(duì)酵母無毒性影響。將含有PGBKT7-BPE005的Y2HGold分別涂布于SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal，前者生長(zhǎng)出白色菌落（圖9B），后者并未有菌落生長(zhǎng)（圖9C），表明誘餌質(zhì)粒無自激活現(xiàn)象。

A，含有PGBKT7的Y2HGold菌株涂布于SD/-Trp/X-α-Gal固體培養(yǎng)基；B，含有PGBKT7-BPE005的Y2HGold菌株涂布于SD/-Trp/X-α-Gal固體培養(yǎng)基；C，含有PGBKT7-BPE005的Y2HGold菌株涂布SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal固體培養(yǎng)基A，Strain Y2HGold containing PGBKT7 was coated on SD/-Trp/X-α-Gal solid medium；B，Strain Y2HGold containing PGBKT7-BPE005 was coated on SD/-Trp/X-α-Gal solid medium；C，Strain Y2HGold containing PGBKT7-BPE005 was coated on SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal solid medium圖9 誘餌蛋白毒性和自激活檢測(cè)Fig.9 Detection of toxicity and self-activation of bait protein

2.5 AD文庫(kù)的滴度測(cè)定

涂布于SD/-Leu固體培養(yǎng)基的稀釋10 000倍的酵母AD文庫(kù)菌液生長(zhǎng)出超過200個(gè)陽性克隆（圖10），表明AD文庫(kù)菌液符合所需滴度，可以進(jìn)行后續(xù)的酵母雙雜交。

圖10 文庫(kù)滴度測(cè)定Fig.10 Titer determination of library

2.6 mating法雙雜交文庫(kù)篩選

將含有重組誘餌載體的酵母菌株與含有AD文庫(kù)的酵母菌株振蕩培養(yǎng)進(jìn)行雜交，可以在40×的光學(xué)顯微鏡下觀察到雜交細(xì)胞類似于米老鼠頭像，之后將雜交菌液稀釋后分別涂布于SD/-Trp/-Leu/-Ade和SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His平板上進(jìn)行第一步篩選，在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His平板上篩選得到11個(gè)陽性菌落（圖11）。挑選陽性克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性文庫(kù)質(zhì)粒并測(cè)序，基于測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了BLAST比對(duì)分析，初步獲得與布魯氏菌分泌蛋白BPE005存在相互作用的4個(gè)蛋白：RNA聚合酶Ⅱ多肽G、補(bǔ)體因子H、鳥苷酸環(huán)化酶2G及顆粒蛋白（表1）。

A，光學(xué)顯微鏡下觀察雜交細(xì)胞（40×）；B，雜交后的酵母菌液涂布于SD/-Trp/-Leu/-Ade固體培養(yǎng)基；C，雜交后的酵母菌液涂布于SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His固體培養(yǎng)基A，The hybrid cells were observed under light microscope （40×）；B，The hybrid yeast liquid was coated on SD/-Trp/-Leu/-Ade solid medium；C，The hybrid yeast liquid was coated on SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His solid medium圖11 酵母雙雜交篩選Fig.11 Yeast two-hybrid screening

表1 BPE005的相互作用蛋白Table 1 Interacting protein of BPE005

2.7 Prey質(zhì)粒與Bait質(zhì)粒一對(duì)一互作驗(yàn)證

將誘餌質(zhì)粒分別與篩選到的4個(gè)文庫(kù)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化于酵母Y2HGold中，培養(yǎng)后的4株Y2HGold分別100倍稀釋涂布于SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His-AbA培養(yǎng)基，結(jié)果顯示，僅同時(shí)含有RNA聚合酶Ⅱ的文庫(kù)質(zhì)粒和BPE005誘餌質(zhì)粒的Y2HGold能在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)（圖12），說明RNA聚合酶Ⅱ和BPE005具有較強(qiáng)的相互作用。

圖12 酵母共轉(zhuǎn)驗(yàn)證Fig.12 Verification of yeast co-transformation

2.8 RNA聚合酶Ⅱ多肽G蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

通過STRING在線軟件分析RNA聚合酶Ⅱ的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，RNA聚合酶Ⅱ多肽G主要與RNA聚合酶Ⅱ多肽A（Polr2a）、RNA聚合酶Ⅱ多肽B（Polr2b）、RNA聚合酶Ⅱ多肽C（Polr2c）等11個(gè)蛋白發(fā)生相互作用（圖13），它們的聚合共同組成了完整的RNA聚合酶Ⅱ。

圖13 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析Fig.13 Protein-protein interaction network analysis

3 討 論

布魯氏菌作為成熟的胞內(nèi)寄生菌，廣泛的傳播途徑和成功的免疫逃逸機(jī)制使其被列為中國(guó)法律規(guī)定必須報(bào)告的二類動(dòng)物疫病[11]。研究表明，布魯氏菌不產(chǎn)生外毒素，沒有莢膜、菌毛、質(zhì)粒，缺乏內(nèi)毒素特性的脂多糖，但是布魯氏菌仍然具有較強(qiáng)的侵襲能力，能抵抗外界低氧、低pH、高活性氧的惡劣環(huán)境，因此研究布魯氏菌的毒力因子和侵襲手段，是了解布魯氏菌逃避宿主免疫應(yīng)答機(jī)制所必需的[12-14]。

目前已經(jīng)報(bào)道的布魯氏菌的毒力基因有脂多糖、T4SS、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、環(huán)狀β-1-2-葡聚糖、脲酶、細(xì)胞色素氧化酶、一氧化氮還原酶、雙組分調(diào)控系統(tǒng)等，這些毒力基因在協(xié)助布魯氏菌入侵和胞內(nèi)生存，以及逃避宿主免疫應(yīng)答方面都發(fā)揮著重要作用[15-16]。有報(bào)道稱，Ⅳ型分泌系統(tǒng)缺失的布魯氏菌對(duì)于體外刺激更加敏感，且無法使其喪失在胞內(nèi)持續(xù)存活的能力，因此研究布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)的功能成為當(dāng)前的熱點(diǎn)問題[17-18]。本試驗(yàn)對(duì)布魯氏菌T4SS效應(yīng)蛋白BPE005蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步分析，發(fā)現(xiàn)BPE005具有多個(gè)活性結(jié)合位點(diǎn)，預(yù)示著BPE005可能極易與宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白發(fā)生相互作用，繼而影響宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答途徑。亞細(xì)胞定位結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BPE005定位于宿主細(xì)胞的細(xì)胞核。細(xì)胞核是存在于真核細(xì)胞中的封閉式膜狀胞器，內(nèi)部含有細(xì)胞中大多數(shù)的遺傳物質(zhì)，是細(xì)胞遺傳與代謝的調(diào)控中心，生命活動(dòng)必需的基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物的加工過程均在此進(jìn)行[19-20]。BPE005定位于細(xì)胞核，預(yù)示著其可能對(duì)于影響宿主細(xì)胞周期調(diào)控及遺傳密碼翻譯具有十分重要的作用。

分泌蛋白在行使功能時(shí)往往是通過與宿主特定靶蛋白相互結(jié)合而發(fā)揮功能，本試驗(yàn)通過酵母雙雜交系統(tǒng)首次鑒定出4個(gè)宿主細(xì)胞內(nèi)與布魯氏菌分泌蛋白BPE005存在相互作用的靶蛋白，分別是補(bǔ)體因子H、鳥苷酸環(huán)化酶、顆粒體蛋白和RNA聚合酶Ⅱ多肽G。補(bǔ)體因子H可通過結(jié)合補(bǔ)體因子C3b，抑制膜攻擊復(fù)合物的形成，從而阻止細(xì)胞裂解，對(duì)補(bǔ)體激活中的旁路途徑起到負(fù)反饋的作用[21-22]。鳥苷酸環(huán)化酶（cGMP）屬于環(huán)化核苷酸的一種，可被G蛋白偶聯(lián)受體激活的蛋白激酶活化，進(jìn)而將胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核[23]。顆粒體蛋白是近年來發(fā)現(xiàn)的一個(gè)獨(dú)立的生長(zhǎng)因子家族，由GRN基因編碼。它的前體蛋白又稱畸胎瘤細(xì)胞源性生長(zhǎng)因子，能降低腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達(dá)，抑制中性粒細(xì)胞的活性[24]。RNA聚合酶Ⅱ多肽G是“轉(zhuǎn)錄機(jī)器”的主要成分，不僅直接參與生物體RNA的合成，而且可以作為核酶催化一些重要的生化反應(yīng)，在細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控及生物體的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[25]。這些互作蛋白的鑒定，對(duì)后續(xù)研究BPE005的生物學(xué)功能具有十分重要的指導(dǎo)意義。

酵母雙雜交系統(tǒng)在1989年由Fields在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中首次建立，目前已成為鑒定及分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的最常用且最有效的工具之一[8]。但是雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi)，而許多蛋白間的相互作用依賴于核外的翻譯后加工修飾，如糖基化、二硫鍵形成等，依賴于其他分子伴侶的輔助，這些反應(yīng)在核內(nèi)是無法進(jìn)行的，酵母雙雜交系統(tǒng)不能有效地篩選出這些蛋白，因此仍然有許多與BPE005存在相互作用的蛋白沒有被篩選到。另外，某些蛋白自身具有激活轉(zhuǎn)錄功能，或表面含有對(duì)多種蛋白質(zhì)的低親和力區(qū)域，能與其他蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的復(fù)合物，這些都會(huì)引發(fā)報(bào)告基因的表達(dá)，產(chǎn)生“假陽性結(jié)果”?！凹訇栃浴眴栴}是影響酵母雙雜交試驗(yàn)成功與否的重要因素，本試驗(yàn)采取酵母一對(duì)一共轉(zhuǎn)驗(yàn)證法，以更加嚴(yán)格的篩選條件證明了BPE005與RNA聚合酶Ⅱ多肽G具有更強(qiáng)的相互作用，由于RNA聚合酶Ⅱ也定位于細(xì)胞核，推測(cè)BPE005可能是在細(xì)胞核上通過與RNA聚合酶Ⅱ相互作用從而發(fā)揮其生物作用。STRING相互作用網(wǎng)絡(luò)分析表明，RNA聚合酶Ⅱ多肽G主要催化DNA的轉(zhuǎn)錄，合成mRNA和大多數(shù)snRNA、微RNA的前體，對(duì)于控制轉(zhuǎn)錄過程影響基因表達(dá)的模式、維持細(xì)胞生存所需的代謝過程、幫助細(xì)胞適應(yīng)不同的環(huán)境具有重要意義[26]。布魯氏菌T4SS效應(yīng)蛋白BPE005是否會(huì)通過與RNA聚合酶Ⅱ多肽G的結(jié)合繼而影響宿主細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控，以抑制布魯氏菌感染期間宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答仍不清楚，研究其相互作用的生物學(xué)意義將是今后的重點(diǎn)方向。

4 結(jié) 論

布魯氏菌T4SS效應(yīng)蛋白BPE005定位于宿主細(xì)胞核，在宿主細(xì)胞內(nèi)BPE005與RNA聚合酶Ⅱ多肽G具有較強(qiáng)相互作用，提示布魯氏菌分泌蛋白BPE005將通過影響宿主細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控以抵抗宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答。