張志帥，隋志遠(yuǎn)，張繼虎，李慶瑾，邢 鳳

（1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，阿拉爾 843300）

初情期為雌性動(dòng)物初次發(fā)情并發(fā)生排卵的時(shí)期，與下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)控，環(huán)境和遺傳因素對黃體生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）的協(xié)調(diào)功能的相互作用有關(guān)[1-5]。動(dòng)物初情期的啟動(dòng)是其從幼年發(fā)育到獲得繁殖能力的標(biāo)志，初情期出現(xiàn)的快慢與其繁殖性能直接相關(guān)[6]。在母羊中，初情期的啟動(dòng)受內(nèi)部和外部因素共同控制，主要取決于動(dòng)物的年齡、體重和代謝狀態(tài)，其他因素還包括品種、營養(yǎng)和環(huán)境因素[7]。初情期發(fā)育的正?；蛭蓙y主要由遺傳因素決定[8-9]。環(huán)境和代謝因素的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)在性腺發(fā)育中起著重要作用，但事實(shí)上這些因素均在基因調(diào)控的基礎(chǔ)上發(fā)揮其功能[6]。據(jù)報(bào)道，下丘腦組織中的神經(jīng)肽Y和瘦素系統(tǒng)[10]、神經(jīng)激素B系統(tǒng)[11]、γ-氨基丁酸系統(tǒng)[12]、Lin28系統(tǒng)[13]等均與初情期啟動(dòng)有關(guān)。利鈉肽家族由心房利鈉肽（ANP）、腦利鈉肽（BNP）和C型利鈉肽（CNP）3種結(jié)構(gòu)相關(guān)的肽組成[14]。CNP基因在多種組織中表達(dá)，并可能通過利鈉肽受體（GC-B）作為局部自分泌/旁分泌的調(diào)節(jié)劑[15]。很多研究表明，CNP基因在生殖和胎兒生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。Cameron等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠性交后10.5 d的胎盤組織中CNP基因開始大量表達(dá)；Stepan等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠前小鼠的卵巢以及子宮組織中CNP基因的表達(dá)量最高；CNP基因在大鼠卵巢和子宮中的表達(dá)與初情期的啟動(dòng)有關(guān)[18]。CNP基因的表達(dá)量對發(fā)情周期的依賴是由于子宮內(nèi)容物、液體內(nèi)容物質(zhì)還有雌激素含量的變化[19]。在大鼠卵巢中，CNP基因的表達(dá)在初情期啟動(dòng)過程中表現(xiàn)出時(shí)間依賴性[20]。在嚙齒動(dòng)物中，CNP基因及其受體在子宮和卵巢中均高表達(dá)，在發(fā)情周期中具有特異性調(diào)節(jié)作用[21]。CNP基因及其受體鳥苷環(huán)化酶-利鈉肽受體2 （NPR2）是環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。CNP-NPR2-cGMP信號級聯(lián)在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的進(jìn)程中起重要作用，這對雌性哺乳動(dòng)物的繁殖至關(guān)重要[22]。CNP被認(rèn)為是維持卵母細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）濃度的重要因素，cAMP濃度則是保持減數(shù)分裂阻滯直到排卵的重要因素[23]，排卵前LH增加降低了體細(xì)胞中CNP的釋放和cGMP的產(chǎn)生，從而降低了卵母細(xì)胞cAMP水平，促使減數(shù)分裂恢復(fù)[24-25]。在綿羊中，CNP預(yù)處理對綿羊卵母細(xì)胞成熟過程中母源基因DNA甲基化酶1（DNMT1）、合子阻滯因子1（Zar1）、胚胎必要的母體抗原（Mater）和卵丘細(xì)胞擴(kuò)展相關(guān)基因透明質(zhì)酸合成酶2（HAS2）、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2（PTGS2）、正五聚蛋白3（PTX3）的表達(dá)均有影響,可暫時(shí)阻止綿羊卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù),并提高綿羊卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量及早期胚胎發(fā)育能力[26]。

多浪羊是新疆早熟綿羊品種的典型代表，在正常生態(tài)條件下，其初情期年齡為3～4個(gè)月[27]，CNP基因與減數(shù)分裂相關(guān)，但其在初情期啟動(dòng)過程中的影響機(jī)制還不清楚。探究CNP基因在多浪羊初情期啟動(dòng)過程中的影響機(jī)制對提高多浪羊的繁殖性能具有重要意義。因此，本研究通過克隆多浪羊CNP基因序列并進(jìn)行測序，檢測其在初情期前、初情期、初情期后3個(gè)不同發(fā)育期下丘腦、垂體、輸卵管、卵巢、子宮中的表達(dá)水平，以期進(jìn)一步揭示CNP基因在多浪羊初情期啟動(dòng)過程中的作用，為縮短多浪羊的育種周期提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集 試驗(yàn)選用同一飼養(yǎng)條件下的初情期前（50.33±2.08） d、初情期（127±2.52） d、初情期后（154.28±2.30） d各3只健康的多浪羊，屠宰后采集新鮮下丘腦、垂體、輸卵管、卵巢、子宮5個(gè)部位的組織樣品，所有樣品均于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｔ囼?yàn)所用多浪羊均來自塔里木大學(xué)試驗(yàn)站。母羊發(fā)情判斷標(biāo)準(zhǔn)：興奮不安，對外界刺激非常敏感，頻繁排尿，外陰紅腫有黏液，靜立并接受公羊爬跨。

1.1.2 主要試劑 Trizol試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒2×SYBR?Premix ExTaqTM、pMD19-T載體均購自TaKaRa公司；DNA聚合酶、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DNA回收試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank中綿羊的CNP基因序列（登錄號：XM_027974523.1），使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)該基因CDS區(qū)序列特異性引物以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，引物信息見表1。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.2 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄 按照Trizol法提取各個(gè)組織的總RNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA條帶的完整性。用PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，置于-20 ℃保存。

1.2.3 基因克隆及測序 以下丘腦組織的cDNA為模板,用表1中的引物CNP-1、CNP-2、CNP-3對多浪羊CNP基因進(jìn)行擴(kuò)增。 PCR反應(yīng)體系25 μL：Premix 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30s，共38個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物大小。PCR產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（TIANgel Midi Purification Kit）進(jìn)行回收，pMD19-T載體進(jìn)行連接，把連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在搖床中37 ℃震蕩50 min，接種于含有氨芐西林（Amp）的LB固體培養(yǎng)基，在37 ℃隔水培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，長出菌落后，挑取陽性菌落，進(jìn)行菌落PCR鑒定（體系及程序同上）后，取鑒定正確的菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。將克隆所得CNP基因序列拼接成完整序列。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 用DNAMAN軟件對人（Homosapiens，登錄號：NP_149124.3）、雞（Gallusgallus，登錄號：NP_990381.1）、豬（Susscrofa，登錄號：XP_003131468.2）、牛（Bostaurus，登錄號：XP_005220718.1）、馬（Equuscaballus，登錄號：XP_014595720.1）、驢（Equusasinus，登錄號：XP_014689090.1）、山羊（Caprahircus，登錄號：XP_017920590.1）、多浪羊（Dolang sheep）進(jìn)行相似性比對，利用表2中的在線軟件對多浪羊CNP基因序列及其編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

表2 生物信息學(xué)分析軟件Table 2 Bioinformatics analysis softwares

1.2.5CNP基因組織表達(dá)分析 以不同初情期階段多浪羊下丘腦、垂體、輸卵管、卵巢、子宮5個(gè)組織的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。β-actin作為內(nèi)參基因來校正個(gè)體差異。PCR反應(yīng)體系15 μL：ddH2O 5.5 μL，PerfectStart Green qPCR SuperMix （2×） 7.5 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性15 s；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算相對表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析分析，2組之間的差異顯著性比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 多浪羊CNP基因的克隆與測序

1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測表明，CNP-1、CNP-2和CNP-3引物擴(kuò)增所得目的條帶大小分別在914、863和890 bp左右（圖1），與預(yù)期目的片段大小相符。對多浪羊CNP基因先克隆并測序，后將序列進(jìn)行拼接，所得序列大小為2 227 bp，包括5′-UTR 50 bp、3′-UTR 914 bp和CDS區(qū)1 263 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。

①A～C，分別代表由引物CNP-1、CNP-2、CNP-3所擴(kuò)增的片段。②M,DL2000 DNA Marker;1～3,樣品①A-C,Fragments amplified by primers CNP-1,CNP-2 and CNP-3,respectively.②M,DL2000 DNA Marker;1-3,Samples圖1 多浪羊CNP基因PCR結(jié)果Fig.1 PCR results of CNP gene in Dolang sheep

2.2 CNP基因氨基酸序列相似性比較及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

由圖2可知，多浪羊CNP基因編碼氨基酸序列與人、雞、豬、牛、馬、驢、山羊的相似性分別為70.7%、60.7%、90.0%、95.0%、87.9%、89.3%、97.9%。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，多浪羊與山羊、牛、豬的親緣關(guān)系較近，與人、馬、驢的親緣關(guān)系次之，與雞的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖3）。

圖2 多浪羊CNP蛋白氨基酸相似性比對分析Fig.2 Amino acid similarity alignment of CNP protein in Dolang sheep

圖3 基于CNP蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of CNP protein

2.3 CNP蛋白的生物信息學(xué)分析

2.3.1 理化性質(zhì) 通過在線分析軟件ProtParam分析多浪羊CNP蛋白的理化性質(zhì)顯示，其分子質(zhì)量為47 370.22 ku，理論等電點(diǎn)pI為9.13，分子式為C2114H3356N584O625S13，原子總數(shù)為6 692個(gè)，共編碼420個(gè)氨基酸（表3），其中亮氨酸（L）有47個(gè)，比例最高，占11.2%，色氨酸（W）、Asn（N）、His（H）、Met（M）各有5個(gè)，比例最低，均占1.2%。帶負(fù)電荷的氨基酸（Asp+Glu）殘基總數(shù)為56，帶正電荷的氨基酸（Arg+Lys）殘基總數(shù)為68（表3）；不穩(wěn)定指數(shù)為43.02；利用在線分析軟件ProtScale預(yù)測CNP蛋白的疏水性，由圖4可知，得分小于0的區(qū)域比得分大于0的區(qū)域更密集，脂溶性系數(shù)為77.33；體外哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞中半衰期為30 h，總平均親水性（GRAVY）為-0.502，表明該蛋白為不穩(wěn)定親水堿性蛋白。

圖4 多浪羊CNP蛋白質(zhì)疏水性分析Fig.4 Hydrophobicity analysis of CNP protein in Dolang sheep

表3 多浪羊CNP蛋白氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of CNP protein in Dolang sheep

用TMHMM軟件對多浪羊CNP蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測顯示，CNP蛋白質(zhì)不含跨膜結(jié)構(gòu)域（圖5）。用在線軟件SignalP 4.0預(yù)測多浪羊CNP蛋白質(zhì)的信號肽，發(fā)現(xiàn)CNP蛋白不含有信號肽（圖6）。用在線軟件NetPhos 3.1對多浪羊CNP蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示共有43個(gè)磷酸化位點(diǎn)，包括25個(gè)絲氨酸（S）位點(diǎn)、13個(gè)蘇氨酸（T）位點(diǎn)、5個(gè)絡(luò)氨酸（Y）位點(diǎn)（圖7）。

圖5 多浪羊CNP蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.5 Transmembrane domain prediction of CNP protein in Dolang sheep

圖6 多浪羊CNP蛋白信號肽預(yù)測Fig.6 Signal peptide prediction of CNP protein in Dolang sheep

圖7 多浪羊CNP蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測Fig.7 Phosphorylation sites prediction of CNP protein in Dolang sheep

2.3.2 二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 用SOPMA軟件對CNP蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測顯示，該蛋白含有157個(gè)α-螺旋（37.38）、66個(gè)延伸鏈（15.71%）、18個(gè)β-折疊（4.29%）和179個(gè)無規(guī)則卷曲（42.62%）；α-螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲貫穿于整個(gè)氨基酸鏈，β-折疊只有少量，散布在α-螺旋附近（圖8）。使用SWISS-MODEL軟件對CNP蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，匹配到1個(gè)與CNP蛋白相似性為80.45%的同源序列2xmi.1.A，以它作為CNP蛋白的模板進(jìn)行建模分析，結(jié)果顯示，GMQE為0.45，QMEAN為-0.21，CNP蛋白無配體結(jié)構(gòu)（圖9）。

①h，α-螺旋；t，β-轉(zhuǎn)角；c，無規(guī)則卷曲；e，延伸鏈。②線條按照從長到短依次代表α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲① h,Alpha helix;t,Beta turn;c,Random coil;e,Extended chain.②The lines represent alpha helix,extended chain,beta turn and random coil,by the length,respectively圖8 多浪羊CNP蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.8 Secondary structure prediction of CNP protein in Dolang sheep

圖9 多浪羊CNP蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.9 Tertiary structure prediction of CNP protein in Dolang sheep

2.4 CNP基因在多浪羊不同初情期階段不同組織中的表達(dá)分析

CNP基因在初情期啟動(dòng)的3個(gè)階段下丘腦中表達(dá)量均顯著高于在其他組織中對應(yīng)發(fā)育階段的表達(dá)量（P<0.05）。下丘腦中CNP基因在初情期的表達(dá)量顯著低于初情期前和初情期后的表達(dá)量（P<0.05）。子宮中CNP基因在初情期前的表達(dá)量顯著高于初情期和初情期后的表達(dá)量（P<0.05）（圖10）。

①同一組織不同情期，肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）；肩標(biāo)相同小寫字母或無字母標(biāo)注表示差異不顯著（P>0.05）。②同一情期不同組織，肩標(biāo)不同大寫字母表示差異顯著（P<0.01）；肩標(biāo)相同大寫字母表示差異不顯著（P>0.05）①Values of the same tissues, different period with different small letter superscripts mean significant difference （P<0.05）; While with the same small letter or no letter superscripts mean no significant difference （P>0.05）.②Values of the same period, different tissues with different capital letter superscripts mean significant difference （P<0.05）; While with the same capital letter superscripts mean no significant difference （P>0.05）圖10 多浪羊CNP基因在不同初情期階段不同組織中的相對表達(dá)量Fig.10 The relative expression of CNP gene in different tissues at different puberty stages of Dolang sheep

3 討 論

CNP基因與動(dòng)物生殖系統(tǒng)功能關(guān)系密切，其具體作用機(jī)制是通過產(chǎn)生cGMP間接影響生殖細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量，從而影響生殖活動(dòng)。CNP基因在雌性動(dòng)物中的表達(dá)隨發(fā)情周期的變化而變化，受多種內(nèi)分泌激素及通路的影響[28]。CNP基因首次在豬腦提取物中被純化和測序[29]，是腦內(nèi)高表達(dá)的利鈉肽。本研究成功克隆了多浪羊CNP基因，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，CNP蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成，屬于親水性蛋白，沒有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，推測CNP蛋白不屬于分泌蛋白，在合成后不發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn)。蛋白磷酸化是一種可逆的翻譯后修飾，這種翻譯后修飾可以改變蛋白的構(gòu)象，進(jìn)而使蛋白活化或者失活[30]。對CNP蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)了43個(gè)磷酸化位點(diǎn)，包括25個(gè)絲氨酸（S）位點(diǎn)、13個(gè)蘇氨酸（T）位點(diǎn)、5個(gè)絡(luò)氨酸（Y）位點(diǎn)。CNP蛋白氨基酸序列在不同物種間存在著高度保守性[31]，對多浪羊CNP基因與其他物種的同源性分析以及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，多浪羊與山羊、牛、豬的親緣關(guān)系較近，與人、馬、驢的親緣關(guān)系次之，與雞的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，與生物的進(jìn)化特征相符，并且有廣泛的同源性。

CNP基因是利鈉肽家族的第3個(gè)成員，研究表明，CNP基因在小鼠和豬的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯中起著維持作用[32]，在排卵前的卵泡中，促黃體素誘導(dǎo)的由C型尿鈉肽前體（natriuretic peptide precursor typeC,NPPC）編碼的CNP基因表達(dá)下降是卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)的先決條件[22]。研究表明，CNP基因在水牛卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞中的表達(dá)量顯著低于顆粒細(xì)胞[33]；妊娠前的成年小鼠子宮和卵巢中CNP基因含量最高，超過前腦和腦干中CNP基因含量，在皮膚、舌頭、心臟和肺臟中均有少量表達(dá)[17]；在新生小鼠中，前腦和腦干中CNP濃度最高，在皮膚、舌頭、心臟、肺臟、胸腺、骨骼肌、肝臟、腎臟、胃和顱骨中均有少量表達(dá)[17]。CNP基因在下丘腦和垂體前葉中也有表達(dá)[34]。本研究結(jié)果表明，初情期前下丘腦CNP基因表達(dá)量顯著高于其他組織，這與在新生小鼠腦組織中的表達(dá)趨勢一致。在大鼠發(fā)情期間，CNP基因參與了子宮中水與礦物質(zhì)平衡及子宮肌層活動(dòng)[35]。在山羊中，CNP基因可能參與調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟[36]。本研究下丘腦和子宮中CNP基因在多浪羊初情期前到初情期的發(fā)育過程中表達(dá)量顯著降低，證明CNP基因在多浪羊初情期啟動(dòng)過程中發(fā)揮著重要作用，這可能與CNP基因?qū)p數(shù)分裂的抑制效果降低有關(guān)。綜上所述，多浪羊CNP基因在下丘腦、垂體、輸卵管、卵巢、子宮中均有表達(dá)，下丘腦組織中高表達(dá)，在初情期前子宮組織中也有較高的表達(dá)。這為進(jìn)一步研究多浪羊CNP蛋白性質(zhì)及其在多浪羊初情期啟動(dòng)中的調(diào)控機(jī)制奠定了理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆了多浪羊CNP基因，其序列長度為2 227 bp，包括5′-UTR 50 bp，3′-UTR 914 bp和CDS區(qū)1 263 bp。CNP蛋白在進(jìn)化中和物種間比較保守；多浪羊CNP基因主要在下丘腦和子宮中表達(dá)，且下丘腦中CNP基因表達(dá)量顯著高于其他組織，在初情期前、初情期、初情期后的下丘腦組織中其表達(dá)量先降低再升高，提示其可能參與調(diào)控初情期的啟動(dòng)過程。