張會(huì)永，李國(guó)輝，薛 倩，周成浩，殷建玫，蘇一軍，夏樹(shù)立，韓 威

（1.江蘇省家禽科學(xué)研究所，揚(yáng)州 225125；2.江蘇省家禽科學(xué)研究所科技創(chuàng)新有限公司，揚(yáng)州 225125；3.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

大圍山微型雞（Daweishan Mini chicken,WX）俗稱(chēng)“香雞”、“金雞”、“嬌雞”，原產(chǎn)地為云南省屏邊縣，屬于肉蛋兼用和競(jìng)技觀賞型地方品種，2011年收錄于《中國(guó)畜禽遺傳資源志·家禽志》[1]。在長(zhǎng)期的自然選擇和人工選擇過(guò)程中，大圍山微型雞形成了獨(dú)具一格的外貌特征和種質(zhì)特性，具有體型小、胸腿肌發(fā)達(dá)、靈活好斗、耐粗飼、抗病性強(qiáng)等特點(diǎn)，是中國(guó)珍稀的家禽遺傳資源。

針對(duì)大圍山微型雞的研究主要集中在表型、微衛(wèi)星技術(shù)及線(xiàn)粒體DNA（mtDNA）的研究。李正田等[2]對(duì)310日齡不同性別大圍山微型雞的屠宰性能進(jìn)行了測(cè)定分析，為品種的選育、開(kāi)發(fā)利用提供了基礎(chǔ)資料。佟薈全等[3]對(duì)大圍山微型雞生長(zhǎng)曲線(xiàn)分析與擬合比較分析中發(fā)現(xiàn)，大圍山微型雞生長(zhǎng)曲線(xiàn)拐點(diǎn)為6.94周齡。賈俊靜等[4]利用微衛(wèi)星標(biāo)記法對(duì)大圍山微型雞遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明其平均雜合度和群體平均多態(tài)信息含量較低。賈曉旭等[5]基于mtDNA D-loop區(qū)全序列變異對(duì)大圍山微型雞遺傳多樣性及其起源進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果表明其遺傳多樣性較低，大圍山微型雞在遺傳來(lái)源組成上具有4個(gè)血統(tǒng)。歐陽(yáng)依娜等[6]對(duì)大圍山微型雞、云龍矮腳雞和拉伯高腳雞mtDNA D-loop遺傳多樣性分析的研究發(fā)現(xiàn)，大圍山微型雞由7個(gè)母系血統(tǒng)組成。

隨著分子技術(shù)的不斷發(fā)展，簡(jiǎn)化基因組測(cè)序（RAD-Seq）技術(shù)以高通量、成本低、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高等特點(diǎn)[7]，一次運(yùn)行可以獲得0.45～200 Gb的數(shù)據(jù)，克服了微衛(wèi)星標(biāo)記及mtDNA遺傳信息覆蓋整個(gè)雞基因組范圍極其微小的缺點(diǎn)（FAO推薦用于雞遺傳多樣性分析的微衛(wèi)星標(biāo)記約30個(gè)，線(xiàn)粒體DNA的D-loop區(qū)域全長(zhǎng)也僅約1 200 bp[8]）,本試驗(yàn)利用RAD-Seq技術(shù)對(duì)大圍山微型雞及其他20個(gè)品種雞進(jìn)行測(cè)序分析，從分子水平上探討大圍山微型雞的遺傳進(jìn)化，為品種保護(hù)、評(píng)價(jià)和開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大圍山微型雞保種群體與其他18個(gè)地方雞品種，包括北京油雞（BY）、東鄉(xiāng)綠殼蛋雞（DX）、鹿苑雞（LY）、河南斗雞（DJ）、瓢雞（PJ）、蕭山雞（XS）、文昌雞（WC）、邊雞（BJ）、狼山雞（LS）、白耳黃雞（BE）、茶花雞（CH）、仙居雞（XJ）、安義瓦灰雞（WH）、固始雞（GS）、大骨雞（DG）、惠陽(yáng)胡須雞（HX）、金湖烏鳳雞（JH）、藏雞（ZZ）及2個(gè)國(guó)外引進(jìn)品種隱性白羽肉雞（RW）、安卡雞（AK），每個(gè)品種按照家系選擇30個(gè)樣本（公雞10只、母雞20只），個(gè)體間無(wú)親緣關(guān)系。在同一飼養(yǎng)條件下，300日齡時(shí)翅下靜脈采血1.5 mL/只，檸檬酸鈉（ACD）抗凝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與質(zhì)量檢測(cè) 采用常規(guī)酚-氯仿法提取21個(gè)品種雞血液樣本基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂米贤夥止夤舛扔?jì)對(duì)提取的DNA進(jìn)行濃度和純度的測(cè)定。

1.2.2 構(gòu)建pair-end文庫(kù) 檢測(cè)合格的DNA樣品，采用ddRAD建庫(kù)方式構(gòu)建長(zhǎng)度范圍在300～500 bp的pair-end文庫(kù)：取基因組DNA 500 ng，加入0.6 UEcoRⅠ（NEB公司）、T4DNA連接酶（NEB公司）、ATP（NEB公司）和EcoRⅠ接頭（含區(qū)分樣品的Index序列）在37 ℃反應(yīng)3 h，65 ℃退火1 h。然后加限制性?xún)?nèi)切酶NlaⅢ（NEB公司）和NlaⅢ接頭在37 ℃反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后在PCR儀中65 ℃放置30 min使內(nèi)切酶失活。使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳選擇400～600 bp回收酶切產(chǎn)物。使用Qubit3.0（Life Technology公司）對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行DNA定量，等量混合樣品。 使用IlluminaTruSeq試劑盒對(duì)混合產(chǎn)物進(jìn)行DNA文庫(kù)構(gòu)建。

1.2.3 RAD-Seq簡(jiǎn)化基因組測(cè)序與SNP質(zhì)控 在pair-end文庫(kù)構(gòu)建完成后，在IlluminaHiSeq X平臺(tái)進(jìn)行RAD-Seq簡(jiǎn)化基因組測(cè)序。SNP的檢測(cè)使用GATK4.1.2.0和samtoolsl.9軟件工具包，質(zhì)控條件：堿基測(cè)序正確識(shí)別率（QPhred （20），Q20）>95%；SNP深度>60%，SNP檢出率>70%，最小等位基因頻率（minorallele frequency，MAF）>0.05。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用PopGen32軟件進(jìn)行平均雜合度（heterozygosity，Ho）、核苷酸多樣度（Pi）、近交系數(shù)（Fis）和群體分化指數(shù)（Fst）計(jì)算。應(yīng)用Admixture1.3.0軟件進(jìn)行群體聚類(lèi)分析，采用PLINK1.90軟件進(jìn)行選擇信號(hào)檢測(cè)，基于Fst檢驗(yàn)方法進(jìn)行選擇信號(hào)分析（以100 kb為窗口、10 kb為步長(zhǎng)），Z/W性染色體位點(diǎn)不進(jìn)行分析。 利用DAVID在線(xiàn)軟件（https:∥david.ncifcrf.gov/）對(duì)受選擇基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG信號(hào)通路分析。

2 結(jié) 果

2.1 SNP鑒定

通過(guò)數(shù)據(jù)質(zhì)控，在大圍山微型雞群體中鑒定出331 892個(gè)SNPs，主要分布于1、2、3、4、5號(hào)和Z染色體上（圖1），SNP位點(diǎn)數(shù)量與染色體長(zhǎng)度總體上呈正相關(guān)。

圖1 SNP在染色體上的分布Fig.1 Distribution of SNP on chromosomes

2.2 群體遺傳多樣性分析

21個(gè)品種的平均雜合度、核苷酸多樣度和近交系數(shù)見(jiàn)表1，大圍山微型雞的平均雜合度為0.219；核苷酸多樣度為0.245，與其他品種相比，呈中度多態(tài)；近交系數(shù)為0.107。

表1 各品種雞的平均雜合度、核苷酸多樣度和近交系數(shù)Table 1 Ho，Pi and Fis of chicken breeds

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

大圍山微型雞與其他18個(gè)地方雞品種的Fst見(jiàn)表2，大圍山微型雞與瓢雞的Fst最低（0.0929），親緣關(guān)系最近；與河南斗雞的Fst最高（0.2179），親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。對(duì)21個(gè)雞種進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，大圍山微型雞與瓢雞、茶花雞和藏雞聚合在一起（圖2），親緣關(guān)系較近。

表2 大圍山微型雞與其他品種雞間的群體分化指數(shù)Table 2 Fst between WX and other chicken breeds

圖2 大圍山微型雞及其他品種雞的遺傳進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of WX and other chicken breeds

2.4 選擇信號(hào)分析

本研究基于Fst檢驗(yàn)方法，大圍山微型雞分別與其他18個(gè)地方雞品種比較，以100 kb為窗口、10 kb為step進(jìn)行滑動(dòng)的Fst選擇信號(hào)分析,篩選Fst值前5%的位點(diǎn)作為選擇位點(diǎn)，注釋相應(yīng)的基因，以≥10個(gè)品種受到選擇的基因作為選取標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出200個(gè)受到選擇的基因。GO功能分析結(jié)果顯示，這些受選擇基因主要富集在對(duì)刺激的應(yīng)答、信號(hào)傳導(dǎo)、運(yùn)動(dòng)等生物過(guò)程（圖3）。KEGG通路富集分析結(jié)果表明，這些受選擇基因主要富集在新陳代謝、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、RIG-Ⅰ樣受體、Notch、MAPK、Apelin等信號(hào)通路（圖4）。 根據(jù)GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果，對(duì)與大圍山微型雞種質(zhì)特性相關(guān)基因進(jìn)行初步篩選發(fā)現(xiàn)，NTRK2、SEMA3A、NTF3、NRG1基因與刺激反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)等生物過(guò)程相關(guān)；NTRK2、GNAQ、GNA14、CRHBP基因與攻擊行為相關(guān)；PDE4D、SEMA3A、AGGF1基因與心血管系統(tǒng)相關(guān)；ALDH1A1、PDE8B、ECH1、PTPRD基因與代謝相關(guān)；SEMA3A、NPR2基因與骨骼發(fā)育相關(guān)，TULP3、FOXP2基因與顱骨形成相關(guān)；PRPF3、GLI3、DIAPH3基因與視力、聽(tīng)覺(jué)感知相關(guān)；TRIM14、MALT1基因與免疫相關(guān)。

圖3 受選擇基因的GO功能分析Fig.3 GO function analysis of selected genes

圖4 受選擇基因的KEGG分析Fig.4 KEGG analysis of selected genes

3 討 論

開(kāi)展地方雞保種群遺傳多樣性分析對(duì)保種工作至關(guān)重要，保種工作的核心工作之一就是確保種群世代傳遞過(guò)程中遺傳多樣性的穩(wěn)態(tài)。賈靜雯等[4]用微衛(wèi)星方法測(cè)得的大圍山微型雞平均雜合度為0.1737，賈曉旭等[5]基于mtDNA D-loop區(qū)分析大圍山微型雞的核苷酸多樣度為0.00443，上述研究說(shuō)明大圍山微型雞的遺傳多樣性相對(duì)匱乏。本研究結(jié)果顯示，大圍山微型雞的平均雜合度處于中等水平，核苷酸多樣度處于中度多態(tài)。與前人研究不一致的原因可能是本研究對(duì)大圍山微型雞群體的采樣更有代表性，囊括了其主要類(lèi)型（白羽、白麻、黑麻、黃麻、黑花等，單冠、豆冠），采樣個(gè)體表型上有一定差異。

大圍山微型雞的近交系數(shù)與其他18個(gè)地方雞品種相比，處于中上水平，這提示在今后的保種工作中，應(yīng)嚴(yán)格控制近交水平的過(guò)快增加，保持遺傳多樣性的相對(duì)穩(wěn)定，必要時(shí)可從原產(chǎn)地引進(jìn)一定數(shù)量的群體（或其他類(lèi)群）進(jìn)行血緣更新。群體遺傳結(jié)構(gòu)分析中與大圍山微型雞親緣關(guān)系較近的3個(gè)地方雞品種，從地理位置上看，大圍山微型雞與瓢雞、茶花雞同為云南省地方雞品種，藏雞在云南省西北部迪慶藏族自治州也有分布，具有明顯的地域特征。

本研究基于Fst檢驗(yàn)方法對(duì)大圍山微型雞種質(zhì)特性相關(guān)基因進(jìn)行篩選，共篩選出200個(gè)受選擇的基因，進(jìn)行了GO功能和KEGG通路分析。結(jié)果表明，與其他18個(gè)地方雞品種及2個(gè)引入肉雞品種相比，受選擇候選基因顯著富集于不同的生物學(xué)通路。

自然選擇是進(jìn)化的原動(dòng)力，大圍山微型雞公雞長(zhǎng)期處于半野生半家養(yǎng)狀態(tài)，為了保護(hù)種群應(yīng)對(duì)野外的危險(xiǎn)，因而具有較強(qiáng)的戰(zhàn)斗力，與其他種群公雞相比，它體型較小，成年公雞的平均體重僅為1 kg左右，但斗性強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)，大圍山微型雞有著發(fā)達(dá)的神經(jīng)系統(tǒng)，與刺激反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)等生物學(xué)過(guò)程相關(guān)的基因NTRK2、SEMA3A、NTF3、NRG1等受到了選擇。研究表明，NTRK2編碼酪氨酸激酶受體B （TrkB），不僅可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生存，增加突觸可塑性及神經(jīng)發(fā)生[9-10]；SEMA3A是神經(jīng)軸突發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵信號(hào)蛋白，通過(guò)結(jié)合神經(jīng)纖毛蛋白1（NRP1）、神經(jīng)纖毛蛋白2（NRP2）和叢狀蛋白A（LXNA）復(fù)合物受體參與軸突排斥﹑樹(shù)突分支、突觸形成和神經(jīng)元遷移過(guò)程[11]；NTF3是早期神經(jīng)發(fā)生期間神經(jīng)元發(fā)育的關(guān)鍵介質(zhì)，在維持突觸功能和突觸形成中起重要作用，在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白選擇性地結(jié)合特定的酪氨酸受體激酶存儲(chǔ)信號(hào)在各種信號(hào)通路中的作用，對(duì)神經(jīng)元的存活和軸突投射至關(guān)重要[12-14]；NRG1影響神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育與遷移、突觸可塑性、髓鞘形成[15-17]。這些基因使得大圍山微型雞反應(yīng)迅速、行動(dòng)敏捷。

5-羥色胺（5-HT）、多巴胺（DA）已被證實(shí)是調(diào)控攻擊行為的主要神經(jīng)遞質(zhì)[18]，本研究發(fā)現(xiàn)，與此相關(guān)的基因NTRK2、GNAQ、GNA14、CRHBP受到了選擇。研究表明，NTRK2對(duì)5-羥色胺和多巴胺能神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育、分化再生具有維持和促進(jìn)作用[19]，GNAQ、GNA14通過(guò)磷脂酶C激活多巴胺受體信號(hào)通路[20-21]。李佳玉等[22]研究發(fā)現(xiàn)，CRHBP基因rs10062367位點(diǎn)多態(tài)性可能與攻擊行為有關(guān)。本研究中還發(fā)現(xiàn)與心血管系統(tǒng)相關(guān)的基因PDE4D、SEMA3A、AGGF1等受到了選擇。PDE4D能夠調(diào)解心肌細(xì)胞收縮和心率[23]，SEMA3A能夠降低室性心速過(guò)快[24]，AGGF1在誘導(dǎo)血管生成、血管發(fā)育以及血管損傷后新內(nèi)膜形成發(fā)揮作用[25]。發(fā)達(dá)的心血管系統(tǒng)和充足的能量供應(yīng)為大圍山微型雞打斗的爆發(fā)力和持久力、野外逃避危險(xiǎn)的能力提供了保障。多個(gè)代謝通路（糖酵解和糖異生、甘油磷脂代謝、甘油酯代謝等）相關(guān)的基因ALDH1A1、PDE8B、ECH1、PTPRD受到了選擇，這可能為大微山微型雞打斗爆發(fā)力和持久力提供充足的能量。

大圍山微型雞骨細(xì)，而較強(qiáng)的斗性行為要求必須有堅(jiān)硬的骨骼，本研究發(fā)現(xiàn)與骨骼發(fā)育相關(guān)的基因SEMA3A、NPR2等、與顱骨形成相關(guān)的基因TULP3、FOXP2，以及與視力和聽(tīng)覺(jué)感知相關(guān)的基因PRPF3、GLI3、DIAPH3等也受到了選擇。研究表明，SEMA3A可促進(jìn)成骨細(xì)胞和抑制破骨細(xì)胞的生成，并可調(diào)節(jié)骨重塑[26-27]；NPR2能夠編碼利納肽B型受體（NPR-B），NPR-B與C型利納肽結(jié)合促進(jìn)骨骼基質(zhì)的合成和刺激軟骨的增殖分化[28]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP2基因能夠調(diào)控顱骨形成和長(zhǎng)骨骨重塑[29]；TULP3是正常胚胎發(fā)育所必需的,它的破壞導(dǎo)致胚胎顱面區(qū)域形態(tài)缺陷[30]，這些基因可能使得大圍山微型雞形成了獨(dú)特的頭部外貌特征。PRPF3在視網(wǎng)膜的發(fā)育過(guò)程中起重要作用[31]。GLI3可通過(guò)調(diào)節(jié) Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)控制晶狀體和視網(wǎng)膜的發(fā)育[32]。這些基因可能使大圍山微型雞能夠面對(duì)野外生存危險(xiǎn)保持足夠的機(jī)警。在免疫調(diào)節(jié)方面，TRIM14和MALT1等基因受到了選擇。TRIM14能夠正向調(diào)控抗病毒天然免疫[33]，MALT1蛋白可以調(diào)控免疫細(xì)胞的生存和增殖分化，在神經(jīng)系統(tǒng)損傷等多種疾病發(fā)揮作用[34]。這些基因可能與大圍山微型雞的抗病能力有關(guān)。本研究初步篩選出大圍山微型雞的特性及其相關(guān)基因，這些基因所在的通路及其作用還需要進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

大圍山微型雞遺傳多樣性呈中度多態(tài)，與瓢雞親緣關(guān)系最近（Fst為0.0929），并篩選出了200個(gè)受到選擇的基因，這些基因在代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、顱骨發(fā)育等多個(gè)方面發(fā)揮作用。結(jié)果為大圍山微型雞種質(zhì)特性的深入挖掘、保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。