張會永，李國輝，薛 倩，周成浩，殷建玫，蘇一軍，夏樹立，韓 威

（1.江蘇省家禽科學(xué)研究所，揚(yáng)州 225125；2.江蘇省家禽科學(xué)研究所科技創(chuàng)新有限公司，揚(yáng)州 225125；3.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

大圍山微型雞（Daweishan Mini chicken,WX）俗稱“香雞”、“金雞”、“嬌雞”，原產(chǎn)地為云南省屏邊縣，屬于肉蛋兼用和競技觀賞型地方品種，2011年收錄于《中國畜禽遺傳資源志·家禽志》[1]。在長期的自然選擇和人工選擇過程中，大圍山微型雞形成了獨(dú)具一格的外貌特征和種質(zhì)特性，具有體型小、胸腿肌發(fā)達(dá)、靈活好斗、耐粗飼、抗病性強(qiáng)等特點(diǎn)，是中國珍稀的家禽遺傳資源。

針對大圍山微型雞的研究主要集中在表型、微衛(wèi)星技術(shù)及線粒體DNA（mtDNA）的研究。李正田等[2]對310日齡不同性別大圍山微型雞的屠宰性能進(jìn)行了測定分析，為品種的選育、開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)資料。佟薈全等[3]對大圍山微型雞生長曲線分析與擬合比較分析中發(fā)現(xiàn)，大圍山微型雞生長曲線拐點(diǎn)為6.94周齡。賈俊靜等[4]利用微衛(wèi)星標(biāo)記法對大圍山微型雞遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明其平均雜合度和群體平均多態(tài)信息含量較低。賈曉旭等[5]基于mtDNA D-loop區(qū)全序列變異對大圍山微型雞遺傳多樣性及其起源進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果表明其遺傳多樣性較低，大圍山微型雞在遺傳來源組成上具有4個(gè)血統(tǒng)。歐陽依娜等[6]對大圍山微型雞、云龍矮腳雞和拉伯高腳雞mtDNA D-loop遺傳多樣性分析的研究發(fā)現(xiàn)，大圍山微型雞由7個(gè)母系血統(tǒng)組成。

隨著分子技術(shù)的不斷發(fā)展，簡化基因組測序（RAD-Seq）技術(shù)以高通量、成本低、操作簡便、靈敏度高等特點(diǎn)[7]，一次運(yùn)行可以獲得0.45～200 Gb的數(shù)據(jù)，克服了微衛(wèi)星標(biāo)記及mtDNA遺傳信息覆蓋整個(gè)雞基因組范圍極其微小的缺點(diǎn)（FAO推薦用于雞遺傳多樣性分析的微衛(wèi)星標(biāo)記約30個(gè)，線粒體DNA的D-loop區(qū)域全長也僅約1 200 bp[8]）,本試驗(yàn)利用RAD-Seq技術(shù)對大圍山微型雞及其他20個(gè)品種雞進(jìn)行測序分析，從分子水平上探討大圍山微型雞的遺傳進(jìn)化，為品種保護(hù)、評價(jià)和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大圍山微型雞保種群體與其他18個(gè)地方雞品種，包括北京油雞（BY）、東鄉(xiāng)綠殼蛋雞（DX）、鹿苑雞（LY）、河南斗雞（DJ）、瓢雞（PJ）、蕭山雞（XS）、文昌雞（WC）、邊雞（BJ）、狼山雞（LS）、白耳黃雞（BE）、茶花雞（CH）、仙居雞（XJ）、安義瓦灰雞（WH）、固始雞（GS）、大骨雞（DG）、惠陽胡須雞（HX）、金湖烏鳳雞（JH）、藏雞（ZZ）及2個(gè)國外引進(jìn)品種隱性白羽肉雞（RW）、安卡雞（AK），每個(gè)品種按照家系選擇30個(gè)樣本（公雞10只、母雞20只），個(gè)體間無親緣關(guān)系。在同一飼養(yǎng)條件下，300日齡時(shí)翅下靜脈采血1.5 mL/只，檸檬酸鈉（ACD）抗凝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與質(zhì)量檢測 采用常規(guī)酚-氯仿法提取21個(gè)品種雞血液樣本基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂米贤夥止夤舛扔?jì)對提取的DNA進(jìn)行濃度和純度的測定。

1.2.2 構(gòu)建pair-end文庫 檢測合格的DNA樣品，采用ddRAD建庫方式構(gòu)建長度范圍在300～500 bp的pair-end文庫：取基因組DNA 500 ng，加入0.6 UEcoRⅠ（NEB公司）、T4DNA連接酶（NEB公司）、ATP（NEB公司）和EcoRⅠ接頭（含區(qū)分樣品的Index序列）在37 ℃反應(yīng)3 h，65 ℃退火1 h。然后加限制性內(nèi)切酶NlaⅢ（NEB公司）和NlaⅢ接頭在37 ℃反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后在PCR儀中65 ℃放置30 min使內(nèi)切酶失活。使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳選擇400～600 bp回收酶切產(chǎn)物。使用Qubit3.0（Life Technology公司）對回收產(chǎn)物進(jìn)行DNA定量，等量混合樣品。 使用IlluminaTruSeq試劑盒對混合產(chǎn)物進(jìn)行DNA文庫構(gòu)建。

1.2.3 RAD-Seq簡化基因組測序與SNP質(zhì)控 在pair-end文庫構(gòu)建完成后，在IlluminaHiSeq X平臺進(jìn)行RAD-Seq簡化基因組測序。SNP的檢測使用GATK4.1.2.0和samtoolsl.9軟件工具包，質(zhì)控條件：堿基測序正確識別率（QPhred （20），Q20）>95%；SNP深度>60%，SNP檢出率>70%，最小等位基因頻率（minorallele frequency，MAF）>0.05。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用PopGen32軟件進(jìn)行平均雜合度（heterozygosity，Ho）、核苷酸多樣度（Pi）、近交系數(shù)（Fis）和群體分化指數(shù)（Fst）計(jì)算。應(yīng)用Admixture1.3.0軟件進(jìn)行群體聚類分析，采用PLINK1.90軟件進(jìn)行選擇信號檢測，基于Fst檢驗(yàn)方法進(jìn)行選擇信號分析（以100 kb為窗口、10 kb為步長），Z/W性染色體位點(diǎn)不進(jìn)行分析。 利用DAVID在線軟件（https:∥david.ncifcrf.gov/）對受選擇基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG信號通路分析。

2 結(jié) 果

2.1 SNP鑒定

通過數(shù)據(jù)質(zhì)控，在大圍山微型雞群體中鑒定出331 892個(gè)SNPs，主要分布于1、2、3、4、5號和Z染色體上（圖1），SNP位點(diǎn)數(shù)量與染色體長度總體上呈正相關(guān)。

圖1 SNP在染色體上的分布Fig.1 Distribution of SNP on chromosomes

2.2 群體遺傳多樣性分析

21個(gè)品種的平均雜合度、核苷酸多樣度和近交系數(shù)見表1，大圍山微型雞的平均雜合度為0.219；核苷酸多樣度為0.245，與其他品種相比，呈中度多態(tài)；近交系數(shù)為0.107。

表1 各品種雞的平均雜合度、核苷酸多樣度和近交系數(shù)Table 1 Ho，Pi and Fis of chicken breeds

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

大圍山微型雞與其他18個(gè)地方雞品種的Fst見表2，大圍山微型雞與瓢雞的Fst最低（0.0929），親緣關(guān)系最近；與河南斗雞的Fst最高（0.2179），親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。對21個(gè)雞種進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)聚類分析發(fā)現(xiàn)，大圍山微型雞與瓢雞、茶花雞和藏雞聚合在一起（圖2），親緣關(guān)系較近。

表2 大圍山微型雞與其他品種雞間的群體分化指數(shù)Table 2 Fst between WX and other chicken breeds

圖2 大圍山微型雞及其他品種雞的遺傳進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of WX and other chicken breeds

2.4 選擇信號分析

本研究基于Fst檢驗(yàn)方法，大圍山微型雞分別與其他18個(gè)地方雞品種比較，以100 kb為窗口、10 kb為step進(jìn)行滑動的Fst選擇信號分析,篩選Fst值前5%的位點(diǎn)作為選擇位點(diǎn)，注釋相應(yīng)的基因，以≥10個(gè)品種受到選擇的基因作為選取標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出200個(gè)受到選擇的基因。GO功能分析結(jié)果顯示，這些受選擇基因主要富集在對刺激的應(yīng)答、信號傳導(dǎo)、運(yùn)動等生物過程（圖3）。KEGG通路富集分析結(jié)果表明，這些受選擇基因主要富集在新陳代謝、肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、RIG-Ⅰ樣受體、Notch、MAPK、Apelin等信號通路（圖4）。 根據(jù)GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果，對與大圍山微型雞種質(zhì)特性相關(guān)基因進(jìn)行初步篩選發(fā)現(xiàn)，NTRK2、SEMA3A、NTF3、NRG1基因與刺激反應(yīng)信號傳導(dǎo)等生物過程相關(guān)；NTRK2、GNAQ、GNA14、CRHBP基因與攻擊行為相關(guān)；PDE4D、SEMA3A、AGGF1基因與心血管系統(tǒng)相關(guān)；ALDH1A1、PDE8B、ECH1、PTPRD基因與代謝相關(guān)；SEMA3A、NPR2基因與骨骼發(fā)育相關(guān)，TULP3、FOXP2基因與顱骨形成相關(guān)；PRPF3、GLI3、DIAPH3基因與視力、聽覺感知相關(guān)；TRIM14、MALT1基因與免疫相關(guān)。

圖3 受選擇基因的GO功能分析Fig.3 GO function analysis of selected genes

圖4 受選擇基因的KEGG分析Fig.4 KEGG analysis of selected genes

3 討 論

開展地方雞保種群遺傳多樣性分析對保種工作至關(guān)重要，保種工作的核心工作之一就是確保種群世代傳遞過程中遺傳多樣性的穩(wěn)態(tài)。賈靜雯等[4]用微衛(wèi)星方法測得的大圍山微型雞平均雜合度為0.1737，賈曉旭等[5]基于mtDNA D-loop區(qū)分析大圍山微型雞的核苷酸多樣度為0.00443，上述研究說明大圍山微型雞的遺傳多樣性相對匱乏。本研究結(jié)果顯示，大圍山微型雞的平均雜合度處于中等水平，核苷酸多樣度處于中度多態(tài)。與前人研究不一致的原因可能是本研究對大圍山微型雞群體的采樣更有代表性，囊括了其主要類型（白羽、白麻、黑麻、黃麻、黑花等，單冠、豆冠），采樣個(gè)體表型上有一定差異。

大圍山微型雞的近交系數(shù)與其他18個(gè)地方雞品種相比，處于中上水平，這提示在今后的保種工作中，應(yīng)嚴(yán)格控制近交水平的過快增加，保持遺傳多樣性的相對穩(wěn)定，必要時(shí)可從原產(chǎn)地引進(jìn)一定數(shù)量的群體（或其他類群）進(jìn)行血緣更新。群體遺傳結(jié)構(gòu)分析中與大圍山微型雞親緣關(guān)系較近的3個(gè)地方雞品種，從地理位置上看，大圍山微型雞與瓢雞、茶花雞同為云南省地方雞品種，藏雞在云南省西北部迪慶藏族自治州也有分布，具有明顯的地域特征。

本研究基于Fst檢驗(yàn)方法對大圍山微型雞種質(zhì)特性相關(guān)基因進(jìn)行篩選，共篩選出200個(gè)受選擇的基因，進(jìn)行了GO功能和KEGG通路分析。結(jié)果表明，與其他18個(gè)地方雞品種及2個(gè)引入肉雞品種相比，受選擇候選基因顯著富集于不同的生物學(xué)通路。

自然選擇是進(jìn)化的原動力，大圍山微型雞公雞長期處于半野生半家養(yǎng)狀態(tài)，為了保護(hù)種群應(yīng)對野外的危險(xiǎn)，因而具有較強(qiáng)的戰(zhàn)斗力，與其他種群公雞相比，它體型較小，成年公雞的平均體重僅為1 kg左右，但斗性強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)，大圍山微型雞有著發(fā)達(dá)的神經(jīng)系統(tǒng)，與刺激反應(yīng)信號傳導(dǎo)等生物學(xué)過程相關(guān)的基因NTRK2、SEMA3A、NTF3、NRG1等受到了選擇。研究表明，NTRK2編碼酪氨酸激酶受體B （TrkB），不僅可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生存，增加突觸可塑性及神經(jīng)發(fā)生[9-10]；SEMA3A是神經(jīng)軸突發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵信號蛋白，通過結(jié)合神經(jīng)纖毛蛋白1（NRP1）、神經(jīng)纖毛蛋白2（NRP2）和叢狀蛋白A（LXNA）復(fù)合物受體參與軸突排斥﹑樹突分支、突觸形成和神經(jīng)元遷移過程[11]；NTF3是早期神經(jīng)發(fā)生期間神經(jīng)元發(fā)育的關(guān)鍵介質(zhì)，在維持突觸功能和突觸形成中起重要作用，在神經(jīng)營養(yǎng)蛋白選擇性地結(jié)合特定的酪氨酸受體激酶存儲信號在各種信號通路中的作用，對神經(jīng)元的存活和軸突投射至關(guān)重要[12-14]；NRG1影響神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育與遷移、突觸可塑性、髓鞘形成[15-17]。這些基因使得大圍山微型雞反應(yīng)迅速、行動敏捷。

5-羥色胺（5-HT）、多巴胺（DA）已被證實(shí)是調(diào)控攻擊行為的主要神經(jīng)遞質(zhì)[18]，本研究發(fā)現(xiàn)，與此相關(guān)的基因NTRK2、GNAQ、GNA14、CRHBP受到了選擇。研究表明，NTRK2對5-羥色胺和多巴胺能神經(jīng)元的生長發(fā)育、分化再生具有維持和促進(jìn)作用[19]，GNAQ、GNA14通過磷脂酶C激活多巴胺受體信號通路[20-21]。李佳玉等[22]研究發(fā)現(xiàn)，CRHBP基因rs10062367位點(diǎn)多態(tài)性可能與攻擊行為有關(guān)。本研究中還發(fā)現(xiàn)與心血管系統(tǒng)相關(guān)的基因PDE4D、SEMA3A、AGGF1等受到了選擇。PDE4D能夠調(diào)解心肌細(xì)胞收縮和心率[23]，SEMA3A能夠降低室性心速過快[24]，AGGF1在誘導(dǎo)血管生成、血管發(fā)育以及血管損傷后新內(nèi)膜形成發(fā)揮作用[25]。發(fā)達(dá)的心血管系統(tǒng)和充足的能量供應(yīng)為大圍山微型雞打斗的爆發(fā)力和持久力、野外逃避危險(xiǎn)的能力提供了保障。多個(gè)代謝通路（糖酵解和糖異生、甘油磷脂代謝、甘油酯代謝等）相關(guān)的基因ALDH1A1、PDE8B、ECH1、PTPRD受到了選擇，這可能為大微山微型雞打斗爆發(fā)力和持久力提供充足的能量。

大圍山微型雞骨細(xì)，而較強(qiáng)的斗性行為要求必須有堅(jiān)硬的骨骼，本研究發(fā)現(xiàn)與骨骼發(fā)育相關(guān)的基因SEMA3A、NPR2等、與顱骨形成相關(guān)的基因TULP3、FOXP2，以及與視力和聽覺感知相關(guān)的基因PRPF3、GLI3、DIAPH3等也受到了選擇。研究表明，SEMA3A可促進(jìn)成骨細(xì)胞和抑制破骨細(xì)胞的生成，并可調(diào)節(jié)骨重塑[26-27]；NPR2能夠編碼利納肽B型受體（NPR-B），NPR-B與C型利納肽結(jié)合促進(jìn)骨骼基質(zhì)的合成和刺激軟骨的增殖分化[28]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP2基因能夠調(diào)控顱骨形成和長骨骨重塑[29]；TULP3是正常胚胎發(fā)育所必需的,它的破壞導(dǎo)致胚胎顱面區(qū)域形態(tài)缺陷[30]，這些基因可能使得大圍山微型雞形成了獨(dú)特的頭部外貌特征。PRPF3在視網(wǎng)膜的發(fā)育過程中起重要作用[31]。GLI3可通過調(diào)節(jié) Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)來控制晶狀體和視網(wǎng)膜的發(fā)育[32]。這些基因可能使大圍山微型雞能夠面對野外生存危險(xiǎn)保持足夠的機(jī)警。在免疫調(diào)節(jié)方面，TRIM14和MALT1等基因受到了選擇。TRIM14能夠正向調(diào)控抗病毒天然免疫[33]，MALT1蛋白可以調(diào)控免疫細(xì)胞的生存和增殖分化，在神經(jīng)系統(tǒng)損傷等多種疾病發(fā)揮作用[34]。這些基因可能與大圍山微型雞的抗病能力有關(guān)。本研究初步篩選出大圍山微型雞的特性及其相關(guān)基因，這些基因所在的通路及其作用還需要進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

大圍山微型雞遺傳多樣性呈中度多態(tài)，與瓢雞親緣關(guān)系最近（Fst為0.0929），并篩選出了200個(gè)受到選擇的基因，這些基因在代謝、信號傳導(dǎo)、顱骨發(fā)育等多個(gè)方面發(fā)揮作用。結(jié)果為大圍山微型雞種質(zhì)特性的深入挖掘、保護(hù)與開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。