阮 涌，陳 祥，代林剛，黃家錦，安冬偉，鄒啟順

（1.貴州大學(xué)，高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴陽 550025；2.貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴陽 550025；3.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025；4.務(wù)川自治縣宏牧羊業(yè)有限公司，銅仁 564300）

泛酰巰基乙胺酶（pantetheinase）是一類泛酰巰基乙胺水解酶，能水解泛酞琉基乙胺形成泛酸和半胱胺[1]。泛酞琉基乙胺酶在馬、牛、豬、大鼠、奶牛、鴿子和雞的肝臟、腎臟、心臟和肌肉組織中均有發(fā)現(xiàn)[2-3]。 Vanin是泛酰巰基乙胺水解酶的一種，Vanin家族包括VNN1、VNN2和VNN3，其中VNN1在Vanin家族中研究最多[4]。 VNN1在糖脂代謝、免疫、腫瘤形成等生命過程中發(fā)揮著十分重要的作用[5]。1996年，VNN1蛋白首次在小鼠中被鑒定，是由血管周圍的胸腺基質(zhì)細胞表達的分子質(zhì)量為70 ku的糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定分子，參與調(diào)節(jié)胸腺歸巢中的細胞黏附[6]。 1999年，Maras等[7]從豬腎臟中分離出泛酰巰基乙胺酶，其部分氨基酸序列與人和小鼠VNN1基因的相似性分別為83.2%和79.7%，因此認為VNNl可能具有泛酰巰基乙胺酶活性。

目前不僅在果蠅中發(fā)現(xiàn)VNN1基因[8-9]，Caldwell等[10]發(fā)現(xiàn)VNN1基因在雞中同樣存在，野生型小鼠血清中可以檢測到Vanin-1，小鼠VNN1在肝臟、腎臟、卵巢、腸及上皮細胞中均有表達，肝臟中的VNN1主要由肝小葉中心區(qū)的細胞表達，肝臟釋放的VNN1能到達血清中，肝臟和血清中的VNN1均具有泛酰巰基乙胺酶活性，且這種活性可以被VNN1基因突變所抑制[11]。Pitari等[12]研究發(fā)現(xiàn)，VNN1基因轉(zhuǎn)染的小鼠表皮細胞膜上有VNN1蛋白的表達，且細胞具有泛酰巰基乙胺酶活性；而VNN1基因敲低的小鼠失去了泛酰巰基乙胺酶活性，且檢測不到游離的巰基乙胺。Chen等[13]研究發(fā)現(xiàn)，VNN1在禁食小鼠或胰島素抵抗小鼠的肝臟中表達被誘導(dǎo)，其中VNN1增加了糖異生基因的表達和肝臟葡萄糖輸出，從而導(dǎo)致高血糖，主要通過調(diào)控Akt信號通路介導(dǎo)。因此，VNN1可能成為治療過度激活糖異生引起的代謝性疾病的潛在靶點。Holleboom等[14]研究發(fā)現(xiàn)，VNN1在小鼠高密度脂蛋白（HDL）代謝中發(fā)揮著重要的作用。對墨西哥兒童脂質(zhì)性狀研究顯示，VNN1基因G137T的多態(tài)位點與高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）含量有關(guān)，且TT基因型與總樣本中較低的VNN1基因mRNA表達水平、較低的HDL-C水平和較高的體重指數(shù)（BMI） z-score均呈顯著相關(guān)，其中VNN1基因表達與HDL-C水平呈正相關(guān)，與BMI z-score呈負相關(guān)[15-16]。Khan等[17]應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，老年海福特牛卵巢顆粒細胞VNN1基因表達量明顯高于青年牛。Bunel等[18]研究了在牛卵母細胞發(fā)育能力獲得期卵丘細胞轉(zhuǎn)錄組水平的變化，結(jié)果顯示，卵丘細胞中VNN1基因的表達與卵泡過度分化相關(guān)。綜上所述，VNN1基因在小鼠、人和牛中研究較多，但鮮見VNN1基因與山羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的研究報道。

產(chǎn)羔數(shù)作為衡量母畜優(yōu)劣的重要指標，是影響生產(chǎn)效益的重要因素，且山羊產(chǎn)羔數(shù)性狀屬于低遺傳力性狀，用傳統(tǒng)育種方法育種速度慢，而分子育種技術(shù)可以篩選更多的優(yōu)勢基因，加快山羊育種進程[19]。本試驗采集F3代波雜山羊血液，通過DNA混池、PCR擴增和直接測序法對優(yōu)異基因進行篩選，以期為后期培育新品系提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取統(tǒng)一飼養(yǎng)環(huán)境下107只F3代初產(chǎn)波雜山羊，F(xiàn)3代波雜山羊是以F2代波雜山羊為母本、貴州白山羊為父本雜交獲得，其中貴州白山羊血統(tǒng)占87.5%，波爾山羊血統(tǒng)占12.5%。試驗羊及產(chǎn)羔數(shù)記錄均由務(wù)川自治縣宏牧羊業(yè)有限公司提供，頸靜脈采血放入EDTA抗凝管，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及儀器

血液DNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司；2×TaqPCR StarMix購自上海詡圣科技有限公司；DL2000 DNA Marker購自北京擎科生物技術(shù)有限公司。超微量分光光度計和高速冷凍離心機均購自Thermo公司；梯度PCR儀購自ABI公司；凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad公司。

1.3 血液DNA提取

采用血液DNA提取試劑盒提取F3代波雜山羊血液DNA，采用超微量分光光度計檢測提取DNA的濃度和純度，1.0%瓊脂凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。將符合要求的107只F3代波雜山羊血液DNA每管分別吸取0.5 μL至一離心管中混勻，構(gòu)建DNA混池。

1.4 引物設(shè)計及合成

根據(jù)GenBank中公布的山羊VNN1基因（登錄號：NC_030816.1）全長20 746 bp序列（共有8個外顯子區(qū)域），采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計外顯子引物（含有部分內(nèi)含子區(qū)域），引物序列見表1。引物均由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.5 PCR擴增及測序分型

PCR反應(yīng)體系30 μL：2×TaqPCR StarMix 15 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 12 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55～61 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物技術(shù)有限公司測序，利用DNAStar軟件將測序結(jié)果與NCBI原始序列進行比對，篩選可能存在的SNP位點。

1.6 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excle軟件對各SNP位點基因型分布進行基因型頻率、基因頻率Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗及遺傳多樣性分析；應(yīng)用SPSS 16.0軟件對VNN1基因SNP位點與F3代波雜山羊產(chǎn)羔數(shù)進行相關(guān)性分析，產(chǎn)羔數(shù)用平均值±標準差表示，以P<0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴增

以混池DNA為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，PCR擴增片段長約507、703、801、614、685、730和928 bp（圖1），與預(yù)期目的片段大小一致，可滿足后續(xù)試驗要求。

M，DL2000 DNA Marker;1～7，VNN1基因外顯子1-7區(qū)域PCR擴增產(chǎn)物M，DL2000 DNA Marker;1-7，PCR amplification of exons 1-7 region of VNN1 gene,respectively圖1 VNN1基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of VNN1 gene

2.2 SNPs篩選及分型

測序發(fā)現(xiàn),VNN1基因第1、2、3、4、6外顯子擴增區(qū)域均無SNP位點，而VNN1基因第5和7外顯子擴增區(qū)域共存在7個SNPs位點，分別為含第5外顯子區(qū)域的g.10956 A→G、g.11010 C→T、g.11103 C→T、g.11284 C→A、g.11313 T→C，以及含第7外顯子區(qū)域的g.18094 C→T和g.18158 G→C（圖2）。其中，g.10956 A→G、g.11010 C→T和g.11103 C→T位點為外顯子突變，而g.11284 C→A、g.11313 T→C、g.18094 C→T和g.18158 G→C為設(shè)計引物時包含的部分內(nèi)含子突變。

A～G，分別為g.10956 A→G、g.11010 C→T、g.11103 C→T、g.11284 C→A、g.11313 T→C、g.18094 C→T和g.18158 G→CA-G，g.10956 A→G，g.11010 C→T，g.11103 C→T，g.11284 C→A，g.11313 T→C，g.18094 C→T and g.18158 G→C，respectively圖2 VNN1基因7個SNPs位點測序峰圖Fig.2 Sequencing maps of 7 SNPs of VNN1 gene

2.3 F3代波雜山羊基因型頻率、基因頻率及遺傳多樣性分析

由表2可知，g.10956 A→G、g.11010 C→T、g.11103 C→T、g.11313 T→C和g.18094 C→T位點優(yōu)勢基因型為AG或CT（TC），均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P>0.05），可進行后續(xù)產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)性分析;而g.11284 C→A和g.18158 G→C位點優(yōu)勢基因型為CC或GG，均處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)（P<0.01），不具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 F3代波雜山羊VNN1基因型頻率及基因頻率Table 2 Genotype frequency and gene frequency of VNN1 gene in F3 generation Boza goats

由表3可知，VNN1基因7個SNPs位點有效等位基因數(shù)在1.926～1.989之間，雜合度在0.481～0.497之間，純合度在0.503～0.519之間，多態(tài)信息含量均為中度多態(tài)（0.25

表3 VNN1基因7個SNPs位點的遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity of 7 SNPs of VNN1 gene

2.4 VNN1基因多態(tài)性與F3代波雜山羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

對VNN1基因SNPs位點與F3代波雜山羊產(chǎn)羔數(shù)進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果見表4。由表4可知，g.11010 C→T和g.11313 T→C位點與F3代波雜山羊產(chǎn)羔數(shù)存在顯著相關(guān)，且g.11010 C→T位點CC基因型顯著低于CT和TT基因型；g.11313 T→C位點TT基因型顯著低于TC和CC基因型（P<0.05）；g.10956 A→G、g.11103 C→T和g.18158 G→C位點與F3代波雜山羊產(chǎn)羔數(shù)均無顯著相關(guān)（P>0.05）。

表4 VNN1基因多態(tài)性與F3代波雜山羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析Table 4 Correlation analysis between VNN1 gene polymorphism and lambing number in F3 generation Boza goats 只

續(xù)表

3 討 論

SNP是基因組水平上單個核苷酸變異所導(dǎo)致的DNA堿基序列的改變，屬于第3代遺傳標記，1996年第一次提出此概念[20]，具有數(shù)量多、分布廣、代表性強、遺傳穩(wěn)定性好、便于高通量、高度自動化的檢測分析等特點[21]。在動物方面，利用SNP方法可以篩選出動物個體間存在的優(yōu)異基因、優(yōu)異基因型以及與動物疾病相關(guān)的基因等[22]。目前，VNN1基因與牛繁殖性狀相關(guān)的研究已有報道[17-18]，但鮮見VNN1基因與山羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)性的研究。本試驗通過DNA混池、PCR擴增和直接測序法發(fā)現(xiàn)，VNN1基因在F3代波雜山羊共存在7個SNPs位點，其中外顯子5區(qū)域存在5個SNPs位點，外顯子7區(qū)域存在2個SNPs位點。χ2檢驗顯示，g.10956 A→G、g.11010 C→T、g.11103 C→T、g.11313 T→C和g.18094 C→T位點均處于Hardy-Weinberg平衡，說明這些位點可能受人工影響因素較小，適應(yīng)性較好，有利于優(yōu)良基因的保存[23]；g.11284 C→A和g.18158 G→C位點均處于Hardy-Weinberg不平衡，推測可能是該群體在自然、人工選擇選育過程中被逐漸淘汰，也可能與品種本身有關(guān)[24]，在后續(xù)產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)性分析中不具有統(tǒng)計學(xué)意義。而將處于Hardy-Weinberg平衡的SNP位點進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，只有g(shù).11010 C→T和g.11313 T→C位點與F3代波雜山羊產(chǎn)羔數(shù)呈正相關(guān)，是由于各基因中雖然普遍存在SNP位點，但是否存在Hardy-Weinberg平衡以及是否與生產(chǎn)性能等指標存在相關(guān)性等，均需要在獲得SNP位點后進行分析檢驗，從而淘汰相當一部分SNP位點[25]。根據(jù)分析結(jié)果，在后續(xù)貴州白山羊新品系育成中，VNN1基因可作為分子選育的候選基因。

貴州白山羊是中國著名的白山羊品種之一，為貴州省目前群體數(shù)量最大的山羊品種，貴州白山羊肉質(zhì)鮮美但體型偏小，為改善貴州白山羊體型的同時基本保持貴州白山羊原有肉質(zhì)風(fēng)味，將波爾山羊進行導(dǎo)入雜交的研究已有報道，但均通過傳統(tǒng)的選育方法進行。陳浩林等[26]通過傳統(tǒng)育種方法，以貴州白山羊為母本、波爾山羊為父本，發(fā)現(xiàn)雜交F1代羔羊生長性能優(yōu)于本地純繁白山羊。焦仁剛等[27]以波爾山羊和南江黃羊與貴州白山羊進行雜交試驗，雜交F1代在體重、日增重等方面與純種白山羊相比具有顯著提高。楊光等[28]利用波爾山羊改良貴州波本F1代并測定其肉質(zhì)性能，結(jié)果顯示，該雜交組合不僅能提高生長速度，而且產(chǎn)肉性能十分良好。說明將波爾山羊血液導(dǎo)入貴州白山羊群體，并保持一定血緣比例是行之有效的育種方案，但上述傳統(tǒng)育種方案也顯示出在新品系育成時耗時較長的缺點，因此，將傳統(tǒng)育種與分子育種相結(jié)合，能夠有效地加快這一新品系的育成。此外，值得注意的是，由于不同遺傳背景和統(tǒng)計樣本數(shù)的限制，關(guān)于VNN1基因是否還存在其他未知的SNP位點，以及該位點是否在不同品種之間仍具有統(tǒng)計學(xué)指導(dǎo)意義，需要在接下來的育種工作中進一步證實和探索。

4 結(jié) 論

在F3代波雜山羊VNN1基因中發(fā)現(xiàn)7個SNPs位點，其中，g.11284 C→A和g.18158 G→C位點均處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)，不具有統(tǒng)計學(xué)意義，g.10956 A→G、g.11010 C→T、g.11103 C→T、g.11313 T→C和g.18094 C→T位點均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，均屬于中度多態(tài)，可進行產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)性分析，分析結(jié)果表明，g.11010 C→T和g.11313 T→C與F3代波雜山羊產(chǎn)羔數(shù)存在顯著關(guān)聯(lián)。