徐 景，楊 光，江美祺，丁向彬，郭益文，胡德寶，李 新，郭 宏，張林林

（天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384）

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列/Cas關(guān)聯(lián)蛋白9（clustered regularly interspersed short palindromic repeat/CRISPR associated protein 9,CRISPR/Cas9）基因編輯技術(shù)為DNA基因沉默提供了更直接的基因敲除方式，不需要同源重組（homologous recombination,HR）和中間介質(zhì)（如胚胎干細(xì)胞或成纖維細(xì)胞），可直接應(yīng)用于受精卵。它還可以在細(xì)胞或胚胎中進(jìn)行更高效的HR以實(shí)現(xiàn)特定位點(diǎn)的DNA序列敲入[1]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、篩選精準(zhǔn)、可編程性、合成高效及同時(shí)敲除多個(gè)基因等優(yōu)點(diǎn)[2-4]，目前已被廣泛應(yīng)用于畜禽的基因編輯及其相關(guān)研究，包括基因功能研究、遺傳改良、抗病育種、生產(chǎn)功能性畜產(chǎn)品及制藥等[5-7]。隨著對(duì)畜禽產(chǎn)品需求的增加和相關(guān)疾病的防控[8-11]，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在畜禽遺傳改良和抗病育種方面的研究和應(yīng)用仍需不斷發(fā)展。作者主要對(duì)CRISPR/Cas9技術(shù)的原理及其在畜禽育種中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為推進(jìn)CRISPR/Cas9技術(shù)在畜禽育種中的研究提供參考依據(jù)。

1 CRISPR/Cas9技術(shù)的原理

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是由細(xì)菌和古細(xì)菌中的Ⅱ型CRISPR/Cas獲得性免疫系統(tǒng)經(jīng)人工改造而成的DNA基因編輯技術(shù)[1]。CRISPR是在一些細(xì)菌基因內(nèi)呈簇狀排列的短DNA重復(fù)序列，每個(gè)重復(fù)序列都被原間隔序列（protospacer）隔開(kāi)。原間隔序列是與靶DNA結(jié)構(gòu)相似的短重復(fù)序列，決定基因序列的識(shí)別位點(diǎn)[3]。每個(gè)原間隔序列始終與保守的原間隔序列相鄰基序（protospacer adjacent motif,PAM）相鄰，PAM對(duì)于靶DNA的識(shí)別具有重要作用。最初CRISPR/Cas系統(tǒng)是根據(jù)與靶DNA或RNA配對(duì)的Cas蛋白不同分為3類(lèi)[1]。2015年，根據(jù)Cas編碼復(fù)合物的不同將CRISPR系統(tǒng)分為5個(gè)類(lèi)型和16個(gè)亞型[12]。2020年，CRISPR/Cas系統(tǒng)的最新分類(lèi)包括2個(gè)綱、6個(gè)類(lèi)型和33個(gè)亞型[13]，即根據(jù)CRISPR基因的組成分為兩類(lèi)：Ⅰ類(lèi)系統(tǒng)的CRISPR RNA（crRNA）效應(yīng)器復(fù)合物由多個(gè)亞基組成；Ⅱ類(lèi)系統(tǒng)的crRNA效應(yīng)器復(fù)合物僅由單一的Cas基因編碼[14]。對(duì)這兩類(lèi)進(jìn)一步分類(lèi)，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ型是通過(guò)靶向外源DNA來(lái)保護(hù)細(xì)胞，Ⅲ和Ⅵ型則是靶向入侵的RNA。在細(xì)菌基因組中發(fā)現(xiàn)95%以上的CRISPR/Cas系統(tǒng)是Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ型之一[15]，而Ⅱ類(lèi)系統(tǒng)幾乎是細(xì)菌所獨(dú)有的，且僅依賴一種Cas蛋白，即Cas9蛋白。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由crRNA[16]、反式激活crRNA（transactivating crRNA,tracrRNA）[17]和核酸酶Cas9組成（圖1）。當(dāng)靶DNA上的PAM序列被CRISPR/Cas9系統(tǒng)識(shí)別后，CRISPR序列在前導(dǎo)序列的調(diào)控下轉(zhuǎn)錄為pre-crRNA，在Cas9和RNase Ⅲ作用下加工成成熟的crRNA，與tracrRNA形成雙鏈互補(bǔ)，形成crRNA-tracrRNA與Cas9的RNP復(fù)合體。RNP復(fù)合體在crRNA引導(dǎo)下特異性識(shí)別外源基因序列上的CRISPR序列，由核酸酶Cas9切割識(shí)別的DNA序列生成雙鏈斷裂（double strand break，DSB）[18]。生成的DSB通過(guò)同源定向修復(fù)（homology-directed repair,HDR）和非同源末端連接（non-homologous end joining,NHEJ）兩種機(jī)制進(jìn)行修復(fù)[2]。NHEJ修復(fù)途徑常伴隨著隨機(jī)插入或刪除堿基突變，導(dǎo)致較小片段的隨機(jī)插入、缺失或染色體重排。當(dāng)CRISPR靶點(diǎn)位于特定基因的開(kāi)放閱讀框（open-reading frame，ORF）內(nèi)或隨機(jī)插入或刪除堿基數(shù)不是3的倍數(shù)時(shí)會(huì)發(fā)生移碼突變，破壞ORF，產(chǎn)生基因敲除模型。HDR修復(fù)途徑可以重組原始序列，或利用提供的重組模板插入給定修飾的序列，產(chǎn)生基因敲入模型。之后模擬crRNA和tracrRNA的作用機(jī)理，在體外人工合成單導(dǎo)向RNA（single guide RNA,sgRNA）[19-21]，從而代替crRNA-tracrRNA復(fù)合體引導(dǎo)Cas9到達(dá)目標(biāo)位點(diǎn)發(fā)揮作用。這不僅可以將系統(tǒng)簡(jiǎn)化成仍能在靶標(biāo)位點(diǎn)上產(chǎn)生所需的替換、插入或刪除的僅含Cas9和sgRNA 2個(gè)組分的系統(tǒng)，而且增加了通過(guò)修改sgRNA就能改變Cas9切割位點(diǎn)的便捷性的特點(diǎn)，使得CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)得以更加廣泛地應(yīng)用。

圖1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的位點(diǎn)結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制Fig.1 The site structure and mechanism of CRISPR/cas9 system

2 CRISPR/Cas9技術(shù)在畜禽育種中的應(yīng)用

作為第3代基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9技術(shù)已在牛、羊、豬、雞等畜禽的遺傳、繁殖和營(yíng)養(yǎng)等方面得到了廣泛研究應(yīng)用，在提高現(xiàn)代畜禽的生產(chǎn)力、改善肉蛋生產(chǎn)、優(yōu)化牛羊奶成分以改良現(xiàn)代畜禽育種體系方面展現(xiàn)出巨大潛力。下面總結(jié)了CRISPR/Cas9編輯技術(shù)在畜禽育種中的最新研究應(yīng)用，重點(diǎn)闡述了該技術(shù)在豬、牛、羊、雞遺傳改良和抗病育種方面的研究進(jìn)展。

2.1 CRISPR/Cas9編輯技術(shù)在豬育種上的應(yīng)用

豬作為中國(guó)重要的食品家畜和大型模式動(dòng)物，CRISPR/Cas9技術(shù)在其育種中的應(yīng)用比較廣泛[22]，尤其是在遺傳改良和抗病育種方面，較多應(yīng)用于提高豬的產(chǎn)肉性能和瘦肉率或增強(qiáng)抗高致病性、致死性病毒能力，對(duì)獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)或抗病新品種的豬展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

在遺傳改良方面，最典型的一個(gè)例子是豬肌生長(zhǎng)抑制素（myostatin,MSTN）基因的敲除。MSTN基因能夠負(fù)向調(diào)節(jié)生長(zhǎng)激素家族，抑制骨骼肌生長(zhǎng)。Wang等[23]借助CRISPR/Cas9技術(shù)成功制備了敲除MSTN的基因編輯豬，這種豬的肌間溝、舌、背和臀等部位的肌肉明顯增多。此外，線粒體中的解偶聯(lián)蛋白1（uncoupling protein-1,UCP1）能將仔豬體內(nèi)的棕色脂肪轉(zhuǎn)化為熱能來(lái)維持體溫，提高瘦肉率[24]。侯連杰[24]、Zheng等[25]利用CRISPR/Cas9技術(shù)將UCP1基因插入到豬染色體上，成功獲得能抵制肥胖、增強(qiáng)抗寒能力的瘦肉豬。

在抗病育種方面，密集化的飼養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致豬新舊疫病的繼發(fā)，給產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)豬造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。目前研究人員主要是通過(guò)編輯宿主基因來(lái)抑制病毒，培育抗病的轉(zhuǎn)基因豬，其中最成功的一個(gè)應(yīng)用是制備抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的基因編輯豬。PRRSV是一種囊膜單鏈正義RNA病毒[26]，增殖復(fù)制過(guò)程不產(chǎn)生dsDNA中間產(chǎn)物，而CRISPR/Cas9技術(shù)主要是DNA基因編輯，故病毒感染和增殖所必需的宿主基因成為CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)靶向的優(yōu)先選擇。Whitworyh等[27]研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV受體和門(mén)控蛋白CD163（cluster of differentiation 163）基因敲除豬對(duì)PRRSV感染具有抗性；進(jìn)一步應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了CD163基因第7外顯子SRCR5（scavenger receptor cysteine-rich domain 5）敲除豬，成功阻斷了生長(zhǎng)豬和妊娠母豬及其胎兒的PRRSV感染[28]。此后的研究也證實(shí)了對(duì)PRRSV受體CD163基因進(jìn)行CRISPR/Cas9基因編輯可以防止PRRSV感染和與感染相關(guān)的繁殖障礙[29-31]。

CRISPR/Cas9技術(shù)在豬其他高致死性疾病的抗病育種方面也取得了一定的進(jìn)展。豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）是一種囊膜單鏈正義RNA病毒，利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建以特定的靶向病毒序列的短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA,shRNA）為突變體的抗CSFV轉(zhuǎn)基因豬[32]，有效限制了CSFV在體內(nèi)外的復(fù)制，且其抗病特性可以穩(wěn)定地傳遞給F1代。Oh等[33]利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯PRRSV受體CD163，同時(shí)結(jié)合RNAi技術(shù)將靶向口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus,FMDV）的RNA聚合酶3D基因和PRRSV的開(kāi)放閱讀框7（ORF7）基因的shRNA整合到CD163編輯的細(xì)胞中，抑制了病毒的復(fù)制，成功培育出對(duì)FMDV和PRRSV的多重抗病毒轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞系。綜上所述，在大多數(shù)RNA病毒（如PRRSV、CSFV和FMDV）的增殖復(fù)制過(guò)程中都不產(chǎn)生dsDNA中間產(chǎn)物，故應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯培育抗病豬，主要是通過(guò)靶向病毒感染所必需的宿主基因，即敲除或替換病毒感染所涉及的細(xì)胞因子或受體，從而抑制RNA病毒復(fù)制。

2.2 CRISPR/Cas9編輯技術(shù)在牛育種上的應(yīng)用

大型反芻家畜牛是中國(guó)優(yōu)質(zhì)肉制品和奶制品的重要來(lái)源，CRISPR/Cas9技術(shù)在其遺傳改良方面已開(kāi)展了大量的研究。β-乳球蛋白（β-lactoglobulin,BLG）基因是基于牛奶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行研究的一個(gè)熱門(mén)靶標(biāo)。BLG是牛奶中主要的過(guò)敏原，過(guò)去主要是借助核移植（SCNT）、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）和顯微注射等手段干擾BLG基因的表達(dá)，但是過(guò)程較為復(fù)雜。2020年，Yulia等[34]利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除了奶牛BLG基因，培育出可分泌不含致敏性BLG基因牛奶的高營(yíng)養(yǎng)奶牛品種。在肉質(zhì)方面，通過(guò)CRISPR系統(tǒng)成功敲除了牛MSTN基因，不僅獲得了肌肉發(fā)達(dá)的牛品種[35]，還為后續(xù)的肌肉發(fā)育調(diào)控機(jī)制研究提供了MSTN敲除牛的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞模型。以上研究證實(shí)了CRISPR/Cas9基因編輯大型反芻動(dòng)物的有效性和培育優(yōu)質(zhì)家畜的可能性，為提高反芻動(dòng)物的經(jīng)濟(jì)效益提供了方向。

CRISPR/Cas9技術(shù)在研究牛的抗病育種方面得到了廣泛的關(guān)注。針對(duì)病菌性疾病，特別是利用CRISPR/Cas9基因編輯培育抗溶血性支原體肺炎牛的相關(guān)研究較多，但是相對(duì)較分散。如由溶血性曼氏桿菌引起牛的肺臟組織損傷和急性炎癥，該桿菌能分泌白細(xì)胞毒素。利用CRISPR/Cas9精準(zhǔn)編輯病菌毒素的受體基因，如白細(xì)胞表面的黏附蛋白CD18等位基因[36]，影響了白細(xì)胞毒素與CD18信號(hào)肽結(jié)合，阻止了由白細(xì)胞毒素誘導(dǎo)的白細(xì)胞溶解，避免了肺臟組織損傷和急性炎癥。研究發(fā)現(xiàn)，利用CRISPR/Cas9敲入或敲除肺臟相關(guān)的免疫內(nèi)源性功能基因，如敲入天然抗性相關(guān)巨噬蛋白1（natural resistance-associated macrophage protein-1,NRAMP1）基因，提高奶牛對(duì)結(jié)核分枝桿菌的抵抗力[37]；敲除抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素10受體α（interleukin-10 receptor alpha,IL-10RA）基因，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)由副結(jié)核分枝桿菌引起的抗炎反應(yīng)[38]。這些應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)培育出的具有抗炎性的功能細(xì)胞系，不僅有助于深入研究抗炎反應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)機(jī)制，而且還可作為抗炎藥物的抗炎效果評(píng)價(jià)的細(xì)胞模型發(fā)揮作用。針對(duì)病毒性疾病，研究最多的是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）引起的牛病毒性腹瀉。BVDV是一種單鏈、有囊膜的RNA病毒，增殖復(fù)制過(guò)程不存在dsDNA中間產(chǎn)物。利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向病毒感染所必需的宿主基因，敲除該RNA病毒的受體基因，如低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor,LDLR）[39]、1型跨膜糖蛋白CD46[40]、緊密連接蛋白（occludin,OCLN）[41]基因；敲除該病毒RNA復(fù)制所需的細(xì)胞因子，如α2抗纖溶酶（serpin peptidase inhibitor clade F member 2,SERPINF2）[42]及豬Jiv（J-domain protein interacting with virus，DNAJC14）[43]基因，都能有效防治由BVDV引起的繁殖障礙和免疫功能紊亂等疾病。另外，利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除病毒感染后的差異基因?yàn)榧膊》揽睾蜋C(jī)制研究提供了一種新的策略。史慧君等[44]利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除BVDV感染后細(xì)胞內(nèi)的差異基因，如UDP-葡萄糖糖蛋白糖基轉(zhuǎn)移酶1（UDP-glucose glycoprotein glucosyltransferase 1,UGGT1）基因，抑制了BVDV的復(fù)制。由此可見(jiàn)，對(duì)于已知的感染機(jī)制，CRISPR/Cas9技術(shù)主要是通過(guò)編輯宿主基因（如病菌毒素受體基因、免疫相關(guān)的內(nèi)源性功能基因和影響RNA病毒復(fù)制相關(guān)的基因）來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)牛病菌性和病毒性疾病的防控；對(duì)于未知的感染機(jī)制，CRISPR/Cas9技術(shù)主要是通過(guò)敲除篩選出的差異基因進(jìn)一步提高對(duì)疾病的機(jī)制研究，因此，創(chuàng)新CRISPR/Cas9基因編輯抗病牛的研究方法和應(yīng)用勢(shì)在必行。

2.3 CRISPR/Cas9編輯技術(shù)在羊育種上的應(yīng)用

小型反芻家畜羊是中國(guó)重要的優(yōu)質(zhì)肉、奶、毛制品的重要來(lái)源。CRISPR/Cas9技術(shù)用于生產(chǎn)基因編輯的綿羊和山羊，主要是從產(chǎn)肉、絨、毛、奶性狀相關(guān)的重要基因功能進(jìn)行研究。在肉質(zhì)方面，MSTN是首批CRISPR/Cas9目標(biāo)基因，通過(guò)在肉用綿羊[5,45]和肉用山羊[5,46]中應(yīng)用Cas9/gRNA介導(dǎo)的基因靶向編輯工具促進(jìn)了肌肉生長(zhǎng)發(fā)育。Zhou等[47]利用CRISPR/Cas9技術(shù)在綿羊細(xì)胞因子信號(hào)抑制蛋白2（suppressor of cytokine signaling 2,SOCS2）基因抑制子中引入點(diǎn)突變，其對(duì)綿羊體重、大小和產(chǎn)奶量均有影響。Niu等[48]敲除β-胡蘿卜素加氧酶2（β-carotene oxygenase 2,BCO2）基因?qū)崿F(xiàn)了綿羊羊肉黃色脂肪的增加。Wang等[49]利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除綿羊MSTN基因和刺豚鼠信號(hào)蛋白（agouti-signaling protein,ASIP）、BCO2 2個(gè)重要的經(jīng)濟(jì)性狀基因，實(shí)現(xiàn)了肌纖維增大和體重增加的多重基因編輯，表明大多數(shù)重要的經(jīng)濟(jì)性狀是由多個(gè)基因座控制。因此，通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)能在家畜育種中有效地多重靶向是非常重要的。在絨毛品質(zhì)方面，重點(diǎn)研究對(duì)象是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5（fibroblast growth factor 5,FGF5）基因。作為毛發(fā)生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)因子，該基因成為CRISPR/Cas9基因編輯羊的首選靶向基因。Li等[50]應(yīng)用了CRISPR技術(shù)將無(wú)意義的密碼子滲入FGF5基因中阻斷了FGF5基因活性，提高了山羊產(chǎn)絨量。Zhang等[51]研究證實(shí)，綿羊FGF5基因的CRISPR/Cas9基因編輯破壞可導(dǎo)致羊毛長(zhǎng)度和平均羊毛生長(zhǎng)率的增加，同時(shí)建立的FGF5和Wnt/β-catenin等下游信號(hào)通路為改善羊毛品質(zhì)提供了新思路。馮新宇[52]研究發(fā)現(xiàn)，分泌型糖蛋白Wnt2基因在次級(jí)毛囊形態(tài)發(fā)生誘導(dǎo)期表達(dá)量差異顯著，利用CRISPR/Cas9技術(shù)在綿羊細(xì)胞水平上敲除Wnt2基因后，F(xiàn)GF5基因表達(dá)顯著上調(diào)，推測(cè)Wnt2基因?qū)GF5基因的表達(dá)存在抑制作用，為應(yīng)用CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)改善羊毛品質(zhì)提供了理論支撐。提高羊奶質(zhì)量是羊基因改造計(jì)劃的主要目標(biāo)之一。運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向山羊BLG基因[53]，培育了敲除BLG基因編輯山羊，生產(chǎn)出無(wú)BLG的羊奶。另外，通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)敲除綿羊乳腺細(xì)胞中的硬脂酰輔酶A去飽和酶1（stearoyl-CoA desaturase 1,SCD1）[54]、前脂肪細(xì)胞中的乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶2（acetyl CoA acyltransferase 2,ACAA2）[55]基因?qū)χ舅岽x產(chǎn)生影響，這些基因與羊奶性狀直接或間接相關(guān)，有助于開(kāi)發(fā)一個(gè)天然低脂或功能性乳制品的牛奶市場(chǎng)。綜上所述，應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)能培育出具有特定生產(chǎn)特性的基因修飾綿羊和山羊，有利于促進(jìn)功能性羊產(chǎn)品的研究和大規(guī)模生產(chǎn)。

在增強(qiáng)抗病力方面，最具代表性的是利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞朊病毒蛋白（prion protein,PrP）和病毒受體透明質(zhì)酸酶2（hyaluronidase 2,HYAL2）基因的敲除。PrP基因與山羊傳染性海綿狀腦病的發(fā)病機(jī)制直接相關(guān)，利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向山羊成纖維細(xì)胞中PrP基因，產(chǎn)生PrP基因敲除供體細(xì)胞，能用于SCNT生產(chǎn)PrP基因抗性山羊[56-57]。Menchaca等[58]運(yùn)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)誘導(dǎo)HYAL2基因功能喪失，使綿羊肺腺癌綜合征得以防治。這些疾病相關(guān)基因敲除羊的產(chǎn)生驗(yàn)證了CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于基因編輯小型反芻動(dòng)物的有效性和培育抗病毒家畜的可能性。

2.4 CRISPR/Cas9編輯技術(shù)在雞育種上的應(yīng)用

由于雞的受精卵結(jié)構(gòu)特殊，無(wú)法直接通過(guò)SCNT獲得基因編輯個(gè)體[59-60]，所以CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在雞育種上發(fā)展較為緩慢。傳統(tǒng)選育的重點(diǎn)是篩選出飼料轉(zhuǎn)化效率高、生長(zhǎng)快、產(chǎn)蛋多的優(yōu)質(zhì)種雞，但是該過(guò)程操作繁瑣、耗時(shí)耗力且效果差。作為一種新型的解決方案，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)尋找生長(zhǎng)速度快、飼料轉(zhuǎn)化效率高和其他理想特性（如抗病性）的遺傳標(biāo)記得到了積極的應(yīng)用[61]。

在肉雞行業(yè)，提高肉品產(chǎn)量是實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益的重要因素，Kim等[62]利用突變的CRISPR/Cas9的Cas9-D10A nickase對(duì)MSTN基因進(jìn)行了有效的調(diào)控，首次建立了在雞DF-1細(xì)胞中敲除MSTN基因的方法；其次為了提高飼料利用率，可以通過(guò)減少體內(nèi)脂肪來(lái)實(shí)現(xiàn)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分配，利用CRISPR/Cas9技術(shù)通過(guò)PGC介導(dǎo)產(chǎn)生的G0/G1開(kāi)關(guān)基因2（G0/G1 switch gene 2,G0S2）敲除雞，解除了脂肪甘油三酯脂肪酶的活性抑制，引發(fā)甘油三酯分解，加速脂肪分解代謝，減少脂肪積累，使得腹部脂肪含量顯著降低[63]，這有利于研究雞的脂質(zhì)代謝，為CRISPR/Cas9技術(shù)在工業(yè)飼料方面的實(shí)際應(yīng)用和基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。

在蛋雞產(chǎn)業(yè)養(yǎng)殖過(guò)程中生產(chǎn)的雛雞約一半是雌性雛雞，之后留作產(chǎn)蛋種雞，而另外一半雄性雛雞則會(huì)被淘汰，造成蛋雞養(yǎng)殖業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失和優(yōu)質(zhì)潛能種雞的錯(cuò)過(guò)。通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)將表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的基因插入雞的Z染色體中，使用熒光設(shè)備鑒定表達(dá)GFP的ZW雌性與野生型ZZ雄性交配的后代，能實(shí)現(xiàn)高效的性別篩選，降低孵化成本[64]。另外，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除雞Stra8（stimulated by retinoic acid 8）[65]和C1EIS（chromosome 1 expression in SSC）[17]基因，阻止了胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為雄性生殖細(xì)胞，為產(chǎn)蛋種雞的育種研究提供了新的參考，也為利用CRISPR/Cas9技術(shù)從蛋白和蛋黃營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量方面的研究和應(yīng)用提供了新的策略，從而提高雞蛋的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，降低人類(lèi)患病的風(fēng)險(xiǎn)[66]。

馬立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）和J型禽白血病病毒（Avian leucosis virus subgroup J,ALV-J）是主要的免疫抑制病毒，給養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[67]。傳統(tǒng)的選擇育種難以獲得抗病性，而CRISPR/Cas9技術(shù)提供了另一種選擇，即通過(guò)編輯病毒受體的宿主基因增強(qiáng)基因編輯家禽的抵抗力，如通過(guò)修飾ALV-J的功能性細(xì)胞受體的Na+/H+交換子類(lèi)型1（Na+/H+exchanger type 1,chNHE1）基因，使得NHE1受體活性的關(guān)鍵氨基酸W38缺失，使雞對(duì)ALV-J產(chǎn)生抗性[68-71]。但是ALV-J和MDV共感染在養(yǎng)殖場(chǎng)普遍存在，MDV作為一種雞皰疹病毒，可增強(qiáng)ALV誘導(dǎo)的淋巴白血病。Liu等[67]利用ALV-J和MDV的重疊感染特性，使用MDV作為CRISPR/Cas9載體在體內(nèi)切除ALV-J基因，首次使用皰疹病毒作為體內(nèi)用于各種基因治療目的的CRISPR/Cas9系統(tǒng)的載體，為防治雞慢性病毒感染的研究和臨床試驗(yàn)提供了新的方向。此外，火雞皰疹病毒（Herpesvirus of turkeys,HVT）[72]是馬立克氏病的活疫苗，更是一種重要的生產(chǎn)禽類(lèi)疾病的CRISPR/Cas9重組疫苗載體，如傳染性法氏囊?。╥nfectious bursal disease,IBD）和禽流感（avian influenza,AI）等禽類(lèi)疾病。Tang等[73]應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯IBDV的VP2基因敲入到HVT基因組中，得到了基于HVT的快速、高效地表達(dá)IBDV VP2蛋白的新型重組疫苗。 Li等[72]利用CRISPR/Cas9基因編輯將H7N1型禽流感病毒的血凝素（hemagglutinin,HA）基因敲入到HVT基因組中，獲得了一種重組HVT（rHVT-H7HA）的多價(jià)疫苗載體，可誘導(dǎo)產(chǎn)生HA特異性抗體，為受到高致病性H7N1-AIV攻擊的免疫雛雞提供保護(hù)，同時(shí)也對(duì)MDV攻擊具有保護(hù)作用。Liu等[74]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了含H9N2-AIV的HA基因的重組HVT（rHVT-H9），誘導(dǎo)雞體內(nèi)發(fā)生強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫，對(duì)H9N2-AIV具有有效的保護(hù)作用。綜上所述，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)為快速開(kāi)發(fā)新型重組載體疫苗提供了一種有效的潛在方法，將有助于預(yù)防多種家禽疾病。

3 小 結(jié)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)已成為現(xiàn)代畜禽遺傳育種基礎(chǔ)研究必不可少的工具，已經(jīng)被廣泛利用產(chǎn)生了很多有價(jià)值的畜禽動(dòng)物或細(xì)胞模型，拓寬了對(duì)相關(guān)基因及其相應(yīng)的表型和功能的理解。但是將CRISPR/Cas9技術(shù)用于家畜遺傳育種也面臨著一些問(wèn)題，首先是主要表現(xiàn)在CRISPR/Cas9技術(shù)本身存在脫靶效應(yīng)、sgRNA設(shè)計(jì)及載體的運(yùn)載效率等限制因素；其次，通常利用CRISPR/Cas9技術(shù)抑制病毒主要有兩種方法，即靶向病毒感染所必需的宿主基因和靶向病毒DNA以直接阻止病毒復(fù)制。但是CRISPR/Cas9系統(tǒng)在畜禽中抗RNA病毒感染的應(yīng)用障礙為系統(tǒng)針對(duì)的是dsDNA而不是RNA[75]。因?yàn)镃RISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是一種dsDNA病毒基因組工程，缺乏RNA靶向活性，從而限制CRISPR/Cas9基因編輯畜禽抗RNA病毒的能力。另外，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的dsDNA病毒靶向可能會(huì)在引導(dǎo)RNA靶向位點(diǎn)引入突變、插入或缺失[75]，從而導(dǎo)致病毒變體，這些變體可能更具致病性或抵抗力，這是CRISPR/Cas9基因編輯畜禽在抗病毒治療中存在的問(wèn)題。但不可否認(rèn)的是，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)新推進(jìn)了畜禽育種現(xiàn)代化，且其在畜禽育種中的研究?jī)H僅是起步階段，其巨大潛力將在更多的CRISPR/Cas9基因編輯畜禽中得以顯現(xiàn)。