孫青云，范 翔，邢 婭，趙敏孟，劉 龍，耿拓宇，龔道清

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009）

鵝肝是具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的產(chǎn)品，經(jīng)填飼后鵝肝可以增大8～10倍而不發(fā)生明顯的病理癥狀[1]，而人體肝臟脂肪聚集過(guò)多則會(huì)導(dǎo)致脂肪肝，易發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化甚至肝癌，這表明鵝肝臟中存在著某種脂肪耐受機(jī)制[2]。以往研究表明，鵝肥肝具有一些不同于哺乳動(dòng)物脂肪肝疾病的特點(diǎn)，如鵝肥肝中脂肪酸去飽和酶升高及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因表達(dá)下降[3]、脂聯(lián)素受體基因表達(dá)增加[4]、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達(dá)減少[5]、線粒體相關(guān)基因表達(dá)增加[6]和補(bǔ)體基因表達(dá)被抑制[7]等。非酒精性脂肪肝（NAFLD）通常與高血糖、高胰島素血癥和高血脂有關(guān)，作者所在研究團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，脂肪肝形成相關(guān)因子葡萄糖、胰島素、油酸、亞油酸、棕櫚酸等對(duì)鵝肥肝中胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2、己糖激酶基因的表達(dá)有一定調(diào)控作用[8-9]。王倩[9]報(bào)道，較高濃度的葡萄糖和飽和脂肪酸可誘導(dǎo)鵝原代肝細(xì)胞中己糖激酶1（HK1）基因的表達(dá)，而較高濃度的胰島素和不飽和脂肪酸可抑制鵝原代肝細(xì)胞中HK1基因的表達(dá)。目前，鵝肥肝形成中的脂肪耐受機(jī)制尚不完全明確，對(duì)其進(jìn)行研究有助于揭示鵝肥肝的形成機(jī)理，也可為其他畜禽和人類(lèi)脂肪肝的研究提供參考。

卵巢腫瘤去泛素化酶7A（OTUD7A）又名細(xì)胞鋅指結(jié)構(gòu)抗NF-κB 2（CEZANNE）酶,屬于卵巢腫瘤去泛素化酶家族的成員之一，該家族成員參與核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路、干擾素信號(hào)通路和p97介導(dǎo)過(guò)程等多條信號(hào)通路的調(diào)控[10]。對(duì)哺乳動(dòng)物的研究發(fā)現(xiàn)，肝臟組織的炎癥反應(yīng)是肝臟從脂肪變性發(fā)展為肝炎的重要生理過(guò)程[11]。NF-κB通路是其中關(guān)鍵促炎信號(hào)途徑[12]。據(jù)報(bào)道，OTUD7A基因可通過(guò)調(diào)控靶蛋白去泛素化，抑制NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而在抑制炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用[10，13]。因此，推測(cè)OTUD7A基因可能參與鵝肥肝的形成。但目前OTUD7A基因在鵝肥肝形成中的生理功能尚不清楚。本試驗(yàn)主要應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定不同填飼階段朗德鵝肝臟中OTUD7A基因的表達(dá)水平，以及不同濃度葡萄糖、胰島素及脂肪酸處理對(duì)鵝原代肝細(xì)胞中OTUD7A基因表達(dá)水平的影響；利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析在鵝原代肝細(xì)胞中轉(zhuǎn)染OTUD7A過(guò)表達(dá)載體對(duì)細(xì)胞功能的影響，旨在探索OTUD7A基因在脂肪肝形成中的作用，也為闡明鵝肥肝形成的機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 Trizol Universal總RNA提取試劑盒、快速質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；HisScriptTMQ RT SuperMix for qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Vazyme AceQTMqPCR SYBR Green Master Mix試劑盒均購(gòu)自諾唯贊生物有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM低糖培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）均購(gòu)自Gibco公司；青霉素-鏈霉素購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；PBSC10010（pH 7.4）購(gòu)自揚(yáng)州必幫生物技術(shù)有限公司；紅細(xì)胞裂解液、DMSO、葡萄糖均購(gòu)自Solarbio公司；表皮生長(zhǎng)因子（EGF）購(gòu)自PEPROTECH公司；Ⅳ型膠原酶購(gòu)自Worthington公司；胰島素、油酸鈉、棕櫚酸鉀均購(gòu)自Sigma公司；Lip2000 Transfection Reagent購(gòu)自Biosharp公司；pcDNA3.1-OTUD7A載體、空載體均購(gòu)自蘇州吉瑪生物科技有限公司；氯化鈉、氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇等其他試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)用朗德鵝由淮安笠誠(chéng)畜禽養(yǎng)殖公司提供。 選取同批孵化、相同飼養(yǎng)條件下體重一致（3.6～3.8 kg）的70日齡朗德鵝公鵝40只。

1.2 方法

1.2.1 朗德鵝分組及處理 40只朗德鵝公鵝隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組（填飼組），每組20只。填飼飼料配制：將玉米顆粒倒入鍋中煮沸5 min后取出瀝干，加入1%植物油和1%食鹽，每10 kg玉米添加20 g復(fù)合維生素，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝罅⒓刺铒?。玉米?gòu)自吉林德惠；復(fù)合維生素購(gòu)自揚(yáng)大飼料廠（每g復(fù)合維生素組成：維生素A 5 000 IU，維生素D 1 000 IU，維生素E 7.50 IU，維生素K 0.75 mg，維生素B1 1 mg，維生素B2 2 mg，維生素B6 1.50 mg，維生素B12 0.01 mg，煙酸 30 mg，泛酸 6 mg，葉酸 0.25 mg，生物素 0.10 mg）。填飼方法參考Osman等[14]方法進(jìn)行，填飼飼料現(xiàn)用現(xiàn)配。填飼的第1～5天每日采食量為500 g，每天分3次進(jìn)行填飼；填飼第6～12天每日采食量為800 g，每天分4次進(jìn)行填飼；填飼第13～19天每日采食量為1 200 g，每天分5次進(jìn)行填飼。對(duì)照組飼喂同樣的飼料，自由采食，每天每只鵝采食120～130 g。填飼第7、14、19天時(shí)，從對(duì)照組和填飼組隨機(jī)選取6只鵝屠宰。取肝臟樣品裝入1.5 mL RNase-free凍存管中，液氮浸泡后于-80 ℃保存，用于OTUD7A基因mRNA表達(dá)水平的測(cè)定。

1.2.2 鵝原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng) 試驗(yàn)選用孵化23胚齡的朗德鵝鵝蛋，采用1 mg/mL Ⅳ型膠原酶消化分離鵝原代肝細(xì)胞，分離后肝細(xì)胞的培養(yǎng)參照洪勝輝等[15]方法進(jìn)行。按6×105/孔的密度進(jìn)行接種，并轉(zhuǎn)移至37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)6 h后，用PBS漂洗以去除未貼壁細(xì)胞，更換新的DMEM完全培養(yǎng)基（100 mL DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入10 mL FBS、1 mL青霉素-鏈霉素混合液（100 IU/mL）、20 μL EGF工作液（20 ng/mL）），于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 脂肪肝形成相關(guān)因子處理鵝原代肝細(xì)胞 脂肪肝形成相關(guān)因子處理濃度參考Osman等[14]。當(dāng)鵝原代肝細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)70%時(shí)，分別用含0（空白組）、125、250 mmol/L葡萄糖溶液，0（空白組）、50、100、200 nmol/L胰島素溶液，0（空白組）、0.125、0.250 mmol/L油酸、亞油酸溶液，0（空白組）、0.25、0.50 mmol/L棕櫚酸的DMEM完善培養(yǎng)基處理鵝原代肝細(xì)胞，每個(gè)處理組6個(gè)重復(fù)。各組細(xì)胞添加相應(yīng)培養(yǎng)液后，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞備用。

1.2.4 RNA提取、cDNA合成及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 用Trizol法提取朗德鵝肝臟及鵝原代肝細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank中OTUD7A基因序列（登錄號(hào)：NC_030817.1）用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物信息見(jiàn)表1。以GAPDH為內(nèi)參基因，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。PCR反應(yīng)體系20 μL：SYBR?Premix ExTaq（2×） 10 μL，ROX Reference Dye Ⅱ （50×） 0.4 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。目的基因表達(dá)水平用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.5OTUD7A基因過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序

1.2.5.1OTUD7A基因過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建及驗(yàn)證 由蘇州吉瑪生物科技有限公司合成過(guò)表達(dá)載體pcDNA3.1-OTUD7A，用PCR方法得到OTUD7A基因序列片段，分別酶切OTUD7A基因與pcDNA3.1載體，并對(duì)純化后產(chǎn)物進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)形成的克隆先進(jìn)行酶切鑒定，證明目的基因已經(jīng)定向連入目的載體。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序和分析比對(duì)，比對(duì)正確的即為構(gòu)建成功的目的基因表達(dá)質(zhì)粒載體。將構(gòu)建好的重組載體進(jìn)行超純抽提得到pcDNA3.1-OTUD7A載體。按照快速質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒提取操作。待鵝原代肝細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)70%時(shí)，按照Lip2000（biosharp）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。轉(zhuǎn)染6 h后，用預(yù)熱的PBS清洗3遍，更換為DMEM完全培養(yǎng)基，在37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，按照1.2.4的方法進(jìn)行RNA提取、反轉(zhuǎn)錄并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證過(guò)表達(dá)是否成功。

1.2.5.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序 將空載體（pcDNA3.1）轉(zhuǎn)染組和過(guò)表達(dá)OTUD7A基因的鵝原代肝細(xì)胞進(jìn)行RNA-Seq分析。RNA-Seq由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾后，通過(guò)Bowtie2建立參考基因組索引，使用Tophat2軟件將過(guò)濾后的Reads與參考基因組進(jìn)行對(duì)比分析。 其中參考基因組為：鴻雁（登錄號(hào)：AnsCyg_PRJNA183603_v1.0），得到的Mapping比例為53.55%～61.80%。 采用DESeq R包（1.18.0）進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，其篩選條件為：表達(dá)差異倍數(shù)|log2FoldChange|>1，P<0.05表示差異顯著。P值使用Benjamini和Hochberg方法進(jìn)行校正。使用GOseq軟件（Release2.12）進(jìn)行GO功能富集分析。先將全部基因映射到GO數(shù)據(jù)庫(kù)的條目，計(jì)算各個(gè)條目的差異表達(dá)基因數(shù)目，再以整個(gè)基因組為背景，用超幾何分布計(jì)算差異表達(dá)基因顯著富集的條目。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS 16.0軟件采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 填飼對(duì)朗德鵝肝臟中OTUD7A基因表達(dá)的影響

由圖1可知，在填飼第7和14天時(shí)，填飼組鵝肝臟中OTUD7A基因的表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。而在填飼第19天時(shí)，填飼組鵝肝臟中OTUD7A基因的表達(dá)極顯著低于對(duì)照組（P<0.01）。

*，差異顯著（P<0.05）；**，差異極顯著（P<0.01）。圖3同*,Significant difference （P<0.05）；**，Extremely significant difference （P<0.01）.The same as fig.3圖1 朗德鵝肝臟中OTUD7A mRNA的相對(duì)表達(dá)水平Fig.1 The relative expression level of OTUD7A mRNA in Landes goose liver

2.2 脂肪肝形成相關(guān)因子對(duì)OTUD7A基因表達(dá)的影響

由圖2可知，與空白組相比，125 mmol/L葡萄糖處理對(duì)鵝原代肝細(xì)胞中OTUD7A基因的表達(dá)無(wú)顯著影響（P>0.05），但250 mmol/L葡萄糖處理顯著提高了細(xì)胞中OTUD7A基因的表達(dá)水平（P<0.05）；不同濃度的胰島素、油酸、亞油酸處理鵝原代肝細(xì)胞后，各組間OTUD7A基因的表達(dá)水平均無(wú)顯著差異（P>0.05）；與空白組相比，0.25和0.50 mmol/L棕櫚酸處理均顯著提高OTUD7A基因的表達(dá)水平（P<0.05）。

肩標(biāo)不同字母表示差異顯著（P<0.05）；肩標(biāo)相同字母或無(wú)字母標(biāo)注表示差異不顯著（P>0.05）Values with different letter superscripts mean significant difference （P<0.05）; While with the same or no letter superscripts mean no significant difference （P>0.05）圖2 脂肪肝形成相關(guān)因子對(duì)鵝原代肝細(xì)胞中OTUD7A mRNA表達(dá)水平的影響Fig.2 Effects of fatty liver formation related factors on OTUD7A mRNA expression level in goose primary hepatocytes

2.3 OTUD7A基因過(guò)表達(dá)載體的驗(yàn)證

由圖3可知，與空載體組相比，過(guò)表達(dá)組OTUD7A基因mRNA水平的表達(dá)量極顯著提高（P<0.01）,故pcDNA3.1-OTUD7A過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖3 過(guò)表達(dá)后鵝原代肝細(xì)胞中OTUD7A mRNA的表達(dá)水平Fig.3 Expression level of OTUD7A mRNA in goose primary hepatocytes after overexpression

2.4 OTUD7A基因過(guò)表達(dá)后差異表達(dá)基因GO功能富集分析

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明，與空載體組相比，OTUD7A基因過(guò)表達(dá)后共篩選到34個(gè)差異表達(dá)基因，其中有19個(gè)基因表達(dá)上調(diào)、15個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，這些差異表達(dá)基因被注釋到165條GO條目中。其中，100條被注釋到生物過(guò)程（biological process），31條被注釋到細(xì)胞組分（cellular component），34條被注釋到分子功能（molecular function）。

由表2可知，生物過(guò)程差異表達(dá)基因主要富集在對(duì)微生物的防御反應(yīng)（defense response to other organism）、對(duì)外界生物刺激的反應(yīng)（response to external biotic stimulus）、對(duì)微生物的反應(yīng)（response to other organism）、T細(xì)胞分化（T cell differentiation）等；在細(xì)胞組分方面，差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞外區(qū)域部分（extracellular region part）、細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm）、非包膜細(xì)胞器（non-membrane-bounded organelle）、細(xì)胞外外泌體（extracellular exosome）、細(xì)胞骨架（cytoskeletal part）；而在分子功能方面，差異表達(dá)基因則主要富集在GTP酶活性（GTPase activity）、水解酶活性（hydrolase activity）、核苷三磷酸酶活性（nucleoside-triphosphatase activity）、肽酶活性（peptidase activity）、催化活性（catalytic activity）等。 其中，CLMP、PROCR、SH3BP1、ARHGAP28、ACE、OTUD7A、LOC106045877、LOC106048002基因的表達(dá)上調(diào)，TNFSF8、DDX60、PLAC8、RSAD2、MX1、RSAD2、GBP1基因的表達(dá)下調(diào)。

表2 OTUD7A基因過(guò)表達(dá)后差異表達(dá)基因GO功能富集分析Table 2 GO function enrichment analysis of differentially expressed genes after OTUD7A gene overexpression

3 討 論

本研究前期數(shù)據(jù)表明，填飼7、14、19 d后，填飼組朗德鵝肝臟重量分別從填飼前的86.45、92.90、80.63 g增加到填飼后的182.76、416.00和826.00 g[16]，證明鵝肥肝模型建立成功。人肝癌細(xì)胞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，OTUD7A基因可以通過(guò)對(duì)腫瘤壞死因子受體相關(guān)分子6（TRAF6）基因進(jìn)行去泛素化調(diào)節(jié)，起到抑制NF-κB通路的作用[13]。研究表明，通過(guò)抑制NF-κB通路，可降低肝臟中炎癥因子（如TNF-α）的表達(dá)，緩解NAFLD的發(fā)展[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在填飼第7和14天時(shí)，填飼組鵝肝臟中OTUD7A基因的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，表明短期填飼可以促進(jìn)鵝肥肝中OTUD7A基因的高表達(dá)，而OTUD7A表達(dá)增高可能抑制鵝肥肝中炎癥的發(fā)生。

哺乳動(dòng)物NAFLD的形成常伴隨著高血糖癥、高血脂癥和高胰島素血癥[18-19]。據(jù)報(bào)道，鵝肥肝形成過(guò)程中也出現(xiàn)了葡萄糖、胰島素和脂肪酸升高等現(xiàn)象[20-21]。本研究結(jié)果表明，250 mmol/L葡萄糖及0.25和0.50 mmol/L的棕櫚酸處理均顯著提高OTUD7A基因的表達(dá)水平，說(shuō)明高濃度葡萄糖和低濃度棕櫚酸（飽和脂肪酸）可以誘導(dǎo)鵝肝細(xì)胞中OTUD7A基因的表達(dá)。用油酸（單不飽和脂肪酸）和亞油酸（多不飽和脂肪酸）處理肝細(xì)胞后對(duì)OTUD7A基因的表達(dá)無(wú)顯著變化，與棕櫚酸的處理結(jié)果并不相同，這可能是因?yàn)轱柡椭舅岷筒伙柡椭舅峋哂械牟煌飳W(xué)效應(yīng)。楊彪[4]研究發(fā)現(xiàn)，在鵝原代肝細(xì)胞中，葡萄糖和油酸提高了脂聯(lián)素受體2（Adipor2）的表達(dá)，胰島素抑制Adipor2基因的表達(dá)，而棕櫚酸對(duì)其表達(dá)無(wú)顯著影響。可見(jiàn)，當(dāng)用不同因子處理鵝肝細(xì)胞后，不同基因的表達(dá)情況不盡相同，可能與這些因子激活不同的信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)。

GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因主要富集在對(duì)其他生物的防御反應(yīng)、對(duì)外界生物刺激的反應(yīng)、T細(xì)胞分化和外泌體等條目。 研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者脂肪肝的嚴(yán)重程度與T細(xì)胞亞群的變化有關(guān)，當(dāng)脂肪肝的嚴(yán)重程度增加時(shí)，CD8+T細(xì)胞數(shù)量逐漸下降，CD4+T細(xì)胞數(shù)量逐漸升高，而增加的CD4+T細(xì)胞可通過(guò)TNF-α、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）的產(chǎn)生參與NAFLD的發(fā)生與發(fā)展[22]。外泌體作為介導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)傳遞的載體，可調(diào)節(jié)肝細(xì)胞與炎癥細(xì)胞間的信號(hào)交流及物質(zhì)傳遞，影響單核巨噬系統(tǒng)的活性，起到調(diào)節(jié)肝臟炎癥反應(yīng)的作用。Ibrahim等[23]研究發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸能激活肝細(xì)胞的混合譜系激酶3，使肝細(xì)胞釋放出含有趨化因子配體10（CXCLl0）的外泌體，進(jìn)而調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的活化，加速肝臟損傷。因此，OTUD7A基因可能通過(guò)調(diào)控對(duì)其他生物的防御反應(yīng)、對(duì)外界生物刺激的反應(yīng)、T細(xì)胞分化和外泌體等條目相關(guān)基因的表達(dá)參與鵝肥肝的形成。

腫瘤壞死因子超家族成員（TNFSF）是由免疫細(xì)胞分泌的具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，TNFSF及其膜受體（TNF-R）相互作用參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡、機(jī)體炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答等[24]。據(jù)報(bào)道，TNFSF8和其受體TNFRSF8結(jié)合后，TNFRSF8通過(guò)與TRAF蛋白結(jié)合，激活NF-κB信號(hào)通路，從而可介導(dǎo)白細(xì)胞介素2（IL-2）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、TNF-α等細(xì)胞因子的分泌[25-26]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果表明，在鵝原代肝細(xì)胞中過(guò)表達(dá)OTUD7A基因可抑制TNFSF8基因的表達(dá)，提示鵝肝臟TNFSF8基因的表達(dá)可能受到OTUD7A基因的調(diào)控，且OTUD7A基因有可能通過(guò)調(diào)控TNFSF8基因參與鵝肥肝形成中的炎癥反應(yīng)。

自由基S-腺苷蛋氨酸結(jié)構(gòu)域2（RSAD2）是一種抗病毒蛋白，可被干擾素誘導(dǎo)表達(dá)[27]。此外，RSAD2還有一些其他的生物學(xué)功能，Qiu等[28]研究發(fā)現(xiàn)，RSAD2在NF-κB活性的調(diào)節(jié)和CD4細(xì)胞的分化發(fā)育中具有重要作用，在RSAD2基因敲除小鼠中，表現(xiàn)出NF-κB活性的降低，導(dǎo)致細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素4（IL-4）、白細(xì)胞介素5（IL-5）和白細(xì)胞介素13（IL-13）的表達(dá)水平降低。抗黏液病毒1（MX1）蛋白是Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類(lèi)活性蛋白質(zhì)，在固有免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要功能[29]。鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白1（GBP1）在抗病原微生物中發(fā)揮重要作用，α干擾素（IFN-α）、β干擾素（IFN-β）和γ干擾素（IFN-γ）均能夠誘導(dǎo)GBP1的表達(dá)[30]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在鵝原代肝細(xì)胞中過(guò)表達(dá)OTUD7A基因后，RSAD2、MX1和GBP1基因表達(dá)水平均顯著下調(diào)，推測(cè)鵝肝臟中RSAD2、MX1和GBP1基因的表達(dá)可能受到OTUD7A基因的調(diào)控。而RSAD2、MX1和GBP1作為與免疫相關(guān)的基因，可能與鵝肝臟中抑制炎癥發(fā)生過(guò)程相關(guān)。

CLMP被認(rèn)為是脂肪細(xì)胞黏附分子（ACAM），在嚙齒動(dòng)物和肥胖人類(lèi)的成熟脂肪細(xì)胞中上調(diào)。在喂食高脂肪、高蔗糖（HFHS）食物的ACAMTg小鼠中，ACAM在成熟脂肪細(xì)胞的質(zhì)膜上大量表達(dá)，其中形成了小帶黏附樣結(jié)構(gòu)[31]。小帶黏附的形成可以增加機(jī)械強(qiáng)度，抑制脂肪細(xì)胞肥大，提高胰島素敏感性。蛋白C受體（PROCR）是Th17致病性的負(fù)調(diào)控因子，下調(diào)多個(gè)致病特征基因的表達(dá)，包括IL-1和IL-23受體[32]。本研究轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，在鵝原代肝細(xì)胞中過(guò)表達(dá)OTUD7A基因可使CLMP和PROCR基因的表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明OTUD7A基因可能通過(guò)調(diào)控CLMP和PROCR基因參與鵝肥肝的形成過(guò)程。

4 結(jié) 論

綜上所述，在朗德鵝填飼前期OTUD7A基因的表達(dá)顯著上調(diào)；250 mmol/L葡萄糖和0.25、0.50 mmol/L棕櫚酸處理能顯著誘導(dǎo)鵝原代肝細(xì)胞中OTUD7A基因的表達(dá)，OTUD7A基因通過(guò)參與調(diào)控TNFSF8、RSAD2、MX1、GBP1、CLMP和PROCR等基因的表達(dá)參與鵝肥肝的形成。