楊麗麗，張瓊文，張 瑜，劉笑笑，陳 婷，江明生

（廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004）

在山羊生長發(fā)育過程中，骨骼肌的生長發(fā)育尤為重要，不僅影響山羊生產(chǎn)性能和肉品質(zhì)，而且對(duì)畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益至關(guān)重要。因此，研究動(dòng)物骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)控機(jī)制成為育種工作的重要內(nèi)容。近年來，越來越多的報(bào)道集中于研究非編碼RNA對(duì)動(dòng)物骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，microRNA（miRNA）是其中研究熱點(diǎn)之一。

miRNA是一種非編碼RNA小分子，長度19～22 nt，廣泛存在于病毒、動(dòng)物和植物細(xì)胞中，主要在轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮作用[1]。研究證明，miRNA參與骨骼肌生長發(fā)育，在細(xì)胞的增殖、分化等過程中起重要作用[2]。研究報(bào)道，大部分miRNA具有組織和不同階段表達(dá)模式，只在特定組織和時(shí)期表達(dá)[3]，如miR-1、miR-206、miR-133a等在心肌和骨骼肌中特異性表達(dá)，參與骨骼肌細(xì)胞增殖和分化[4]；miR-1通過調(diào)控細(xì)胞蛋白周期D1，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖[5]，通過靶向配對(duì)盒基因（Pax7）和組蛋白去乙?；?（HDAC4）抑制Pax7和HDAC4的表達(dá)，從而促進(jìn)牛骨骼肌細(xì)胞的分化[6]。李丹丹[7]研究表明，miRNA-101a能夠促進(jìn)山羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化，但對(duì)衛(wèi)星細(xì)胞的增殖作用不顯著。miR-495-3p作為一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞增殖分化中起重要作用，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，如miR-495-3p通過作為lncRNA NEAT1的分子海綿影響靶基因E2F轉(zhuǎn)錄因子3（E2F transcription factor 3，E2F3）的表達(dá)，從而促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[8]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-495-3p能夠與核基質(zhì)結(jié)合區(qū)結(jié)合蛋白質(zhì)1（SATB1）基因的3′-UTR結(jié)合，并與lncRNA-UCA1構(gòu)成內(nèi)源競爭RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA）網(wǎng)絡(luò)，通過對(duì)靶基因的調(diào)節(jié)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖與侵襲[9]。在體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）中過表達(dá)肌生長抑制素（Myostatin），可使miR-495-3p表達(dá)量下降，推測miR-495-3p可能與肌細(xì)胞增殖相關(guān)[10]。以上報(bào)道表明，miRNA可以調(diào)控骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖與分化，但是miRNA對(duì)隆林山羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的作用機(jī)制報(bào)道較少。

隆林山羊是廣西地方品種，主要分布于云貴高原桂西北山區(qū)，具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，但其生長速度慢，產(chǎn)肉量低，導(dǎo)致生產(chǎn)性能低。1月齡是山羊生長發(fā)育關(guān)鍵期，10月齡是成熟期，選擇這2個(gè)階段對(duì)研究其生長發(fā)育具有重要意義。廣西大學(xué)動(dòng)科院遺傳育種課題組前期測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-495-3p與隆林山羊肌肉發(fā)育相關(guān)（未發(fā)表）。因此，本研究利用生物學(xué)信息方法預(yù)測miR-495-3p的靶基因，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測其對(duì)骨骼肌發(fā)育分化調(diào)控基因生肌因子5（Myf5）、肌細(xì)胞生成素（MyoG）表達(dá)的影響，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其結(jié)合位點(diǎn)，研究miR-495-3p對(duì)山羊骨骼肌細(xì)胞增殖分化的調(diào)控，為提高肉羊的生產(chǎn)性能提供參考，對(duì)畜牧業(yè)動(dòng)物品種培育也具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞 隆林山羊來自廣西大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院試驗(yàn)羊場，分別選擇健康、體重相近的1和10月齡隆林山羊各3只；山羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞、293T細(xì)胞、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞均由廣西大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 DMEM、胎牛血清（FBS）、特級(jí)馬血清（FES）、0.25%胰蛋白酶、PBS、Lipofectamine 2000、DNA凝膠回收試劑盒、PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit均購自北京索萊寶科技有限公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；氨芐青霉素購自上海華舜生物技術(shù)有限公司?？諝夂銣?fù)u床（HY45）購自武漢科學(xué)儀器廠；熒光素酶檢測儀（M200 PRO）購自廣州博鷺騰生物科技有限公司。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：90% DMEM+10% FBS；分化培養(yǎng)基：98% DMEM+2% FES。

1.1.3 質(zhì)粒合成 根據(jù)miRbase上miR-495-3p的序列，運(yùn)用化學(xué)方法合成miR-495-3p模擬物（miR-495-3p mimic）、模擬物對(duì)照（miR-495-3p mimic NC）及抑制物（miR-495-3p inhibitor）和抑制物對(duì)照（miR-495-3p inhibitor NC）,均由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成，ACTC1-WT+mimics NC、ACTC1-WT+miR-495-3p、ACTC1-Mut+mimics NC、ACTC1-Mut+miR-495-3p均由湖南普拉特澤生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 屠宰過程按照《畜禽屠宰操作規(guī)程 羊》（NY/T 3469-2019）進(jìn)行，在無菌狀態(tài)下分離隆林山羊的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背最長肌及腿肌組織，立即凍存至液氮中，在實(shí)驗(yàn)室將各組織整理后置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 miR-495-3p靶基因預(yù)測 利用生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-495-3p的靶基因。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 參考GenBank中山羊的miR-495-3p、ACTC1、Pax7、Cyclin E、MyoG、Myf5的基因序列，利用Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物信息見表1，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。根據(jù)Trizol法提取骨骼肌細(xì)胞1月齡山羊心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背最長肌、腿肌及10月齡山羊背最長肌總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以U6為miRNA的內(nèi)參，GAPDH為其他基因內(nèi)參，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各基因相對(duì)表達(dá)量。 PCR反應(yīng)體系：Premix ExTaqⅡ 5.0 μL，上、下游引物各0.3 μL，cDNA 2.5 μL，RNase-free ddH2O補(bǔ)至10 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性30 s，退火（溫度見表1） 30 s，72 ℃延伸12 s，共35個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物信息Table 1 Primer information

續(xù)表

1.2.4 miR-495-3p及其靶基因的組織表達(dá)譜構(gòu)建 以1月齡隆林山羊的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背最長肌、腿肌cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢驗(yàn)miR-495-3p及其靶基因在各組織中的表達(dá)水平。

1.2.5 山羊骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分化 將凍存細(xì)胞復(fù)蘇后加入培養(yǎng)基置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代。當(dāng)傳代細(xì)胞融合度達(dá)到60%～70%時(shí)，按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將miR-495-3p mimic、miR-495-3p inhibitor、miR-495-3p mimic NC、miR-495-3p inhibitor NC和雙熒光載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h后收集一部分細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測過表達(dá)及干擾效率；另一部分傳代細(xì)胞在培養(yǎng)24 h后更換含2% FES分化培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)6 d收集細(xì)胞。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測肌細(xì)胞分化標(biāo)志基因MyoG、Myf5的表達(dá)量，PCR反應(yīng)體系和程序同1.2.3。

1.2.6 細(xì)胞增殖活力 將細(xì)胞均勻接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，將miR-495-3p mimic、miR-495-3 pmimic NC、miR-495-3p inhibitor和miR-495-3p inhibitor NC根據(jù)1.2.5方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，每組設(shè)置7個(gè)重復(fù)，以PBS溶液為空白對(duì)照；24 h后，收集細(xì)胞備用，或者每孔中加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h，收集細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測細(xì)胞增殖標(biāo)志基因Pax7、CyclinE的表達(dá)量，PCR反應(yīng)體系和程序同1.2.3；用酶標(biāo)儀檢測D450 nm值，并計(jì)算細(xì)胞增殖率。

細(xì)胞增殖率（%）=[（試驗(yàn)孔-空白孔）/（對(duì)照孔-空白孔）]×100%

1.2.7 雙熒光素酶熒光活性分析 以psiCHECK2作為載體，根據(jù)預(yù)測到的miR-495-3p及其靶基因的結(jié)合位點(diǎn)，以XhoⅠ、NotⅠ為酶切位點(diǎn)，構(gòu)建靶基因的野生型載體（ACTC1-WT+mimics NC、ACTC1-WT+miR-495-3p）和突變型載體（ACTC1-Mut+mimics NC、ACTC1-Mut+miR-495-3p）；在24孔板進(jìn)行293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，分組轉(zhuǎn)入ACTC1-WT+mimics NC、ACTC1-WT+miR-495-3p、ACTC1-Mut+mimics NC、ACTC1-Mut+miR-495-3p質(zhì)粒，在37 ℃培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染48 h。按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明書測定miR-495-3p及其靶基因的結(jié)合情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并采用t檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 隆林山羊肌肉發(fā)育相關(guān)miRNA和靶基因的篩選

生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-495-3p與肌肉發(fā)育相關(guān)的ACTC1基因有潛在結(jié)合位點(diǎn)（圖1A），可能與肌肉發(fā)育有關(guān)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，miR-495-3p與ACTC1基因在1和10月齡背最長肌中表達(dá)量均差異極顯著（P<0.01）（圖1B、1C）。

①A，miR-495-3p與ACTC1結(jié)合預(yù)測圖；B、C，miR-495-3p、ACTC1在1和10月齡背最長肌中的相對(duì)表達(dá)量。②*，差異顯著（P<0.05）；**，差異極顯著（P<0.01）；無*，差異不顯著（P>0.05）。下同①A,Prediction diagram of the combination of miR-495-3p and ACTC1;B and C,The relative expression of miR-495-3p and ACTC1 in longissimus dorsi at 1 and 10 months old,respectively.②*,Significant difference （P<0.05）；**，Extremely significant difference （P<0.01）；No *,No significant difference（P>0.05）.The same as below圖1 miR-495-3p靶基因預(yù)測（A）及不同月齡山羊背最長肌中miR-495-3p（B）與ACTC1（C）的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Target gene prediction of miR-495-3p （A） and the expression levels of miR-495-3p （B） and ACTC1 （C） in longissimus dorsi muscle of goats at different growth ages

2.2 miR-495-3p與ACTC1基因的組織表達(dá)譜

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，miR-495-3p與ACTC1基因在不同組織中均有表達(dá)，miR-495-3p在1月齡隆林山羊脾臟中表達(dá)量最高，依次為背肌、腿肌、肝臟、腎臟、心臟、肺臟，各組織間均有顯著差異（P<0.05）（圖2A）；ACTC1基因在隆林山羊心臟中表達(dá)量最高，依次為背最長肌、肺臟、腿肌、脾臟、腎臟、肝臟，各組織間均有顯著差異（P<0.05）（圖2B）。

肩標(biāo)不同字母表示差異顯著（P<0.05）Values with different letter superscripts mean significant difference （P<0.05）圖2 1月齡山羊miR-495-3p（A）和ACTC1（B）組織表達(dá)譜Fig.2 Tissue expression profile of miR-495-3p （A） and ACTC1 （B） in one-month-old goats

2.3 miR-495-3p過表達(dá)和干擾效率檢測

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，miR-495-3p mimic組miR-495-3p的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于miR-495-3p mimic NC組（P<0.01），miR-495-3p inhibitor組miR-495-3p的相對(duì)表達(dá)量極顯著低于miR-495-3p inhibitor NC組（P<0.01）（圖3）。

圖3 miR-495-3p過表達(dá)和干擾效率Fig.3 Efficiency of miR-495-3p overexpression and inhibition

2.4 miR-495-3p過表達(dá)、干擾對(duì)細(xì)胞分化的影響

將miR-495-3pmimic、miR-495-3p inhibitor轉(zhuǎn)染至骨骼肌細(xì)胞中，分化6 d時(shí)發(fā)現(xiàn)有明顯的肌管產(chǎn)生，與miR-495-3p mimic NC組相比，miR-495-3p mimic組促進(jìn)肌管的生成，miR-495-3p inhibitor組抑制肌管的生成（圖4）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，miR-495-3p mimic組骨骼肌細(xì)胞分化標(biāo)志基因MyoG、Myf5的表達(dá)水平顯著高于miR-495-3p mimic NC組（P<0.05），miR-495-3p inhibitor組MyoG、Myf5基因的表達(dá)水平顯著低于miR-495-3p inhibitor NC組（P<0.05）（圖5）。

A～D，miR-495-3p mimic NC、miR-495-3p mimic、miR-495-3p inhibitor NC和miR-495-3p inhibitor組A-D,miR-495-3p mimic NC,miR-495-3p mimic，miR-495-3p inhibitor NC and miR-495-3p inhibitor groups,respectively圖4 山羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞轉(zhuǎn)染后分化6 d的形態(tài)Fig.4 Morphology of goat skeletal muscle satellite cells after transfection and differentiation for 6 days

圖5 各組山羊骨骼肌細(xì)胞分化標(biāo)志基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression of differentiation marker genes in skeletal muscle cells of goats in each group

2.5 miR-495-3p過表達(dá)、干擾對(duì)細(xì)胞增殖的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，miR-495-3p mimic和miR-495-3p inhibitor組Pax7、Cyclin E的表達(dá)量均無顯著差異（P>0.05）；CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)，miR-495-3p mimic和miR-495-3p inhibitor組對(duì)細(xì)胞增殖活力均沒有顯著影響（P>0.05）（圖6）。

A，Pax7、Cyclin E基因相對(duì)表達(dá)量；B，細(xì)胞活力A,The relative expression of Pax7 and Cyclin E genes;B,Cell viability圖6 各組山羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量及細(xì)胞活力Fig.6 The relative expression of proliferation-related genes and cell viability of goat skeletal muscle satellite cells in each group

2.6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)合位點(diǎn)

雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染ACTC1-WT+mimics NC相比，共轉(zhuǎn)染ACTC1-WT+miR-495-3p可極顯著降低海腎熒光與螢火蟲熒光的比值（P<0.01）；與轉(zhuǎn)染ACTC1-Mut+mimics NC相比，共轉(zhuǎn)染ACTC1-Mut+miR-495-3p對(duì)海腎熒光比螢火蟲熒光無顯著影響（P>0.05）（圖7），表明miR-495-3p可靶向ACTC1基因。

圖7 miR-495-3p與ACTC1共轉(zhuǎn)染雙熒光素素酶活性檢測結(jié)果Fig.7 Detection results of bifluorinase activity by co-transfection of miR-495-3p and ACTC1

3 討 論

骨骼肌是動(dòng)物生長發(fā)育的重要組成部分，對(duì)山羊產(chǎn)肉量和肉品質(zhì)具有重要影響。骨骼肌的生長發(fā)育是極其復(fù)雜的生物學(xué)過程，包括細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等，同時(shí)受到多種調(diào)節(jié)因子和信號(hào)通路的調(diào)控，miRNA作為重要的調(diào)控因子[11-12]，在骨骼肌發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，miRNA在動(dòng)物骨骼肌發(fā)育中的機(jī)制和作用研究大多采用高通量測序結(jié)合生物信息學(xué)分析的方法[13]。有研究報(bào)道，與肌肉發(fā)育相關(guān)的miRNA已經(jīng)被鑒定出來，如miR-1靶向HDAC4基因促進(jìn)肌肉發(fā)育[6]，miR-486靶向Pax7基因促進(jìn)肌肉發(fā)育[14]。然而，大部分與肌肉發(fā)育相關(guān)的miRNA尚未被鑒定，其作用機(jī)制和分子功能還有待于進(jìn)一步研究。

研究報(bào)道，Lee等[15]通過高通量測序在小鼠成肌細(xì)胞和腓腸肌肌肉中篩選鑒定出miR-3074-3p，miR-3074-3p通過靶向Cav1促進(jìn)成肌細(xì)胞分化。Keel等[16]利用RNA-Seq技術(shù)在牛背最長肌中鑒定出ACTC1基因，證明其可影響牛肌肉增重和采食量。本研究通過生物信息學(xué)分析預(yù)測確定miR-495-3p的靶基因?yàn)锳CTC1，并通過構(gòu)建1月齡隆林山羊miR-495-3p和ACTC1基因的組織表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，miR-495-3p及ACTC1在隆林山羊的背最長肌及腿肌中表達(dá)量均較高，符合特定組織和不同階段表達(dá)模式[3]，說明miR-495-3p和ACTC1基因均參與調(diào)控山羊肌肉發(fā)育。Boutilier等[17]研究結(jié)果表明，ACTC1基因是心臟α-肌動(dòng)蛋白，是成熟心臟和胎兒骨骼肌中表達(dá)量最高的橫紋肌α-肌動(dòng)蛋白。以上研究結(jié)果表明，miRNA與肌肉生長發(fā)育密切相關(guān)。Goossens等[10]通過在體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）中過表達(dá)肌生長抑制素（myostatin，MYST），發(fā)現(xiàn)miR-495-3p的表達(dá)量下降，推測miR-495-3p與肌細(xì)胞增殖相關(guān)。Lee等[18]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-146b-5p能促進(jìn)雞成肌細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，但對(duì)肌管分化產(chǎn)生抑制作用，說明miR-146b-5p促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖，抑制其分化。Ye等[19]研究發(fā)現(xiàn)，miR-92b-3p能夠靶向血清-糖皮質(zhì)激素激酶3（serum-glucocorticoid-inducible kinase 3，SGK3）抑制C2C12細(xì)胞增殖并對(duì)C2C12細(xì)胞的遷移產(chǎn)生抑制作用，但是其對(duì)C2C12細(xì)胞分化并無顯著影響。Qin等[20]從不同年齡組榮昌豬背最長肌中篩選出miR-323-3p，發(fā)現(xiàn)miR-323-3p可靶向白細(xì)胞抑制因子2（Smad2）抑制成肌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其分化。本研究通過將miR-495-3p模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染到山羊骨骼肌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)miR-495-3p過表達(dá)可以促進(jìn)MyoG、Myf5的表達(dá)，對(duì)增殖相關(guān)基因Pax7、CyclinE的表達(dá)無影響，抑制miR-495-3p表達(dá)時(shí)MyoG、Myf5的表達(dá)下降；最后通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-495-3p靶向ACTC1基因，說明miR-495-3p通過靶向ACTC1基因促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞的分化。

4 結(jié) 論

本研究通過生物信息學(xué)的方法篩選出miR-495-3p的靶基因?yàn)锳CTC1，miR-495-3p和ACTC1基因在1月齡隆林山羊心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背肌、腿肌中均有表達(dá)，在背最長肌中表達(dá)水平較高，具有組織特異性表達(dá)特點(diǎn)；miR-495-3p通過靶向ACTC1基因促進(jìn)山羊骨骼肌細(xì)胞的分化，參與骨骼肌的生長發(fā)育，結(jié)果可為肉羊生產(chǎn)性能、肉質(zhì)性狀的分子選育研究提供參考。