陳宇婧,張藝藝，黃正陽，石建州，2，3，劉陽坤，2，3，邱 礽，2，3，姚倫廣，2，3，李 娜，2，3

（1.南陽師范學院生命科學與農業(yè)工程學院，南陽 473061；2.河南省畜禽保健品工程技術研究中心，南陽 473061；3.河南省動物疫病診斷與綜合防控工程技術研究中心，南陽 473061）

反向遺傳學（reverse genetics）是一種分子遺傳學方法，通過基因水平的操作來揭示生命發(fā)展規(guī)律。病毒的反向遺傳學系統(tǒng)通過定向修飾病毒的基因組序列，檢測被拯救的人工改造病毒的表型，可以在病毒基因結構、病毒蛋白功能、病毒與宿主互作、病毒致病機制和疫苗開發(fā)等研究中發(fā)揮明顯優(yōu)勢，也是RNA病毒的研究熱點[1-2]，但是RNA病毒在體外拯救效率低[3]，因此，需要建立一種無需體外制備RNA和拯救效率高的體內拯救病毒的方法。T7 RNA聚合酶（T7 RNA polymerase,T7 RNAP）/T7啟動子系統(tǒng)是病毒反向遺傳學技術中常用的轉錄系統(tǒng)。T7 RNAP是一種依賴DNA的RNA聚合酶，對T7啟動子序列具有高度特異性，是分子克隆和反向遺傳學操作中常用的RNA聚合酶[4]。T7 RNAP首次在噬菌體T7感染的大腸桿菌中被發(fā)現，是T7噬菌體染色體編碼的一條單鏈酶[5-7]，具有高度啟動子專一性，且能嚴格、特異地識別T7啟動子[8-9]，不需要其他轉錄因子的協(xié)助[10]。含有T7啟動子的目的基因在胞質內的轉錄可由T7 RNAP高效誘導[11-13]，而不用進入細胞核，這可以克服核膜對外源基因轉錄的屏障作用。另外，T7 RNAP在沒有其他任何蛋白因子的協(xié)助下就可介導T7噬菌體晚期基因轉錄的順利進行[14-15]。T7 RNAP和相應轉錄元件在宿主細胞體內進行轉錄，即可實現對相應重組病毒的拯救[16]。T7 RNAP轉錄產物的5′-端常形成發(fā)夾結構，此結構在哺乳動物細胞中對新生成的RNA可起到保護和穩(wěn)定作用[7]，能夠提高重組病毒的拯救效率。

幼倉鼠腎細胞（baby hamster kidney,BHK-21）是最常見的動物細胞類型之一，是英國學者在1961年使用來自5只1日齡敘利亞金倉鼠腎臟細胞分離建立的細胞系[17]。BHK-21細胞呈纖維樣貼壁生長，可連續(xù)傳代，常被用于繁殖動物病毒。目前已有多種病毒在BHK-21細胞中成功繁殖，包括日本乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）[18]、口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）[19]、狂犬病毒（Rabies virus,RV）[20]和Sindbis病毒（Sindbis virus,SINV）[21]等，BHK-21細胞系能夠用于大規(guī)模生產獸用疫苗等生物制品,也可以應用于輪狀病毒等RNA病毒反向遺傳學試驗。構建穩(wěn)定表達T7 RNAP的BHK-21細胞系，對于T7啟動子驅動的重組RNA病毒基因組的包裝和拯救至關重要。本研究基于慢病毒載體系統(tǒng)構建了穩(wěn)定表達T7 RNAP的BHK-21-T7 RNAP細胞株，為RNA病毒反向遺傳學操作平臺提供了研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK-293T細胞由河南省南水北調中線水源區(qū)生態(tài)安全重點實驗室保存；BHK-21細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司；慢病毒載體質粒、慢病毒輔助質粒psPAX2和pMD2.G均購自北京歐林生物科技有限公司；限制性內切酶（XmaⅠ、XbaⅠ、BamHⅠ）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；無內毒素質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒均購自OMEGA Bio-Tek公司；psiCHECK2質粒購自Promege公司;反轉錄試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司；高保真酶Q5?High-Fidelity 2×Master Mix和T4 DNA連接酶均購自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 T7-pol慢病毒載體的構建與鑒定 基于大腸桿菌BL21（DE3）中的T7 RNA序列（GeneBank登錄號：NZ_CP081489.1），使用Primer Premier 5.0軟件設計引物T7 RNAP-F和T7 RNAP-R（表1）擴增T7RNAP基因。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。PCR反應體系20 μL：Q5?High-Fidelity 2× Master Mix 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.25 μL，大腸桿菌BL21（DE3）菌液模板1 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應程序：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳結束后進行膠回收純化。使用XbaⅠ和BamHⅠ酶切慢病毒核心質粒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro和T7RNAP基因的膠回收產物并回收目的片段，然后使用T4 DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞。挑取單菌落進行PCR鑒定，得到的陽性克隆培養(yǎng)后提取重組質粒，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.2 慢病毒的包裝 轉染前1 d，按照6×105/mL將HEK-293T細胞接種于24孔板。轉染前2 h，將細胞板中的培養(yǎng)基更換為無血清的基礎培養(yǎng)基。向無菌離心管中加入重組質粒1.5 μg，psPAX2載體1.2 μg，pMD2.G載體0.3 μg，再加入25 μL Opti-MEM混合均勻，室溫孵育5 min。取5 μL Lipofectamine 3000與20 μL Opti-MEM混合，室溫孵育5 min。之后，將稀釋后的DNA與稀釋后的Lipofectamine 3000按照1∶1比例混合，室溫孵育20 min，形成DNA與Lipofectamine 3000的轉染復合物。將轉染復合物轉移至HEK-293T細胞中，6～8 h后棄去培養(yǎng)基，PBS緩沖液洗滌2次后，每孔加入含10%血清的完全細胞培養(yǎng)基250 μL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)12～16 h后，更換為完全培養(yǎng)基。24 h后收集細胞上清于4 ℃保存，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后再次收集細胞上清，與第一次收集的細胞上清液進行混合，室溫下以1 000 r/min離心5 min，去除細胞碎片，上清經0.45 μm無菌濾器過濾至1.5 mL無菌離心管中，4 ℃、5 000 r/min離心2 h后，棄上清晾干，按照20 μL/孔的量加入PBS重懸病毒沉淀，室溫靜置2 h，再次混勻后室溫放置30 min，分裝于無菌的EP管中，做好標記并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 慢病毒滴度的測定 使用DMEM完全培養(yǎng)基10倍梯度稀釋1.2.2中的病毒。 具體做法如下：取鋪好細胞的96孔板，每孔含有培養(yǎng)基90 μL，第1排孔每孔加入待測病毒原液10 μL，混勻后吸取10 μL混合液于第2排孔中，依次稀釋至第6橫孔。感染72 h后觀察細胞熒光（如果病毒熒光較弱可加入polybrene以增強病毒的細胞感染能力）。病毒滴度（TU/mL）=細胞數×熒光百分比×103/病毒原液體積（μL）。

1.2.4 穩(wěn)定表達T7 RNAP的BHK-21-T7 RNAP細胞株的篩選

1.2.4.1 嘌呤霉素（Puro）抗性篩選濃度的測定 按照4.5×105～5×105/mL將HEK-293T細胞接種于48孔板，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h。待細胞密度達到80%～90%時，棄去培養(yǎng)基，PBS（pH 7.4）緩沖液洗滌2次，然后分別加入含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg/mL嘌呤霉素以及10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，每72 h更換1次篩選培養(yǎng)基。篩選1周后，能夠把所有細胞全部殺死的最低嘌呤霉素濃度即為嘌呤霉素抗性篩選的最佳濃度。

1.2.4.2 慢病毒感染BHK-21細胞 按照8×105～10×105/mL將BHK-21細胞接種于6孔板，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，待細胞密度達到70%～80%時進行病毒感染。將1.2.2中收集的病毒液分別以感染復數（multiplicity of infection，MOI）為1、5、10和20感染BHK-21細胞，72 h后觀察熒光情況，篩選最佳感染復數。將1.2.2中收集的病毒液以及空載體重組慢病毒以最佳感染復數分別加于BHK-21細胞中，培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)基更換為含10%血清的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，PBS洗滌2次后加入6 mL含有最適嘌呤霉素的篩選培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。前3～4 d每天更換培養(yǎng)基，之后每2～3 d更換一次培養(yǎng)基，直到熒光顯微鏡中觀察到90%以上的細胞發(fā)出綠色熒光。通過嘌呤霉素的篩選得到穩(wěn)定表達的細胞株，并將細胞凍存，等待進一步檢測。

1.2.5 檢測T7 RNAP活性的重組質粒pT7-hRluc構建及鑒定 根據海腎熒光素酶（hRluc）基因序列設計特異性引物hRluc-F和hRluc-R（表1）。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以psiCHECK2質粒為模板進行擴增，并對擴增產物進行純化，純化產物和pT7載體利用XmaⅠ和BamHⅠ進行雙酶切，對酶切產物進行回收，連接，轉化大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞。對菌液PCR鑒定得到的陽性菌液提取質粒，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.2.6 BHK-21-T7 RNAP細胞株中T7RNAP基因的穩(wěn)定性及活性鑒定 設計3對檢測引物（T7 RNAP-1、T7 RNAP-2和T7 RNAP-3）（表1），利用RT-PCR鑒定獲得的穩(wěn)定表達T7 RNAP的細胞株。收集獲得的穩(wěn)定表達T7 RNAP的BHK-21細胞，并設定慢病毒空載體組和BHK-21空白細胞組進行對照，提取細胞總RNA進行RT-PCR檢測，PCR擴增體系同1.2.1。同時利用所構建的檢測質粒pT7-hRluc對穩(wěn)定篩選細胞株和BHK-21細胞空白對照組進行轉染，測定檢測質粒上T7啟動子所驅動的hRluc酶活性，通過檢測2組細胞hRluc報告基因的活性差異，可以反映hRluc的轉錄水平，以判斷穩(wěn)定篩選的BHK-21-T7 RNAP細胞株中的T7 RNAP是否有活性。將pT7-hRluc檢測質粒轉染篩選的穩(wěn)定細胞株，轉染步驟同1.2.2。在轉染36 h后，使用熒光素酶報告系統(tǒng)檢測試劑盒進行檢測，根據說明書進行操作。 用PBS清洗細胞后，加入現配的1×PLB（passive lysis buffer），每孔65 μL。然后搖勻置于-80 ℃冰箱，反復凍融3次，充分裂解細胞。 最后收集在1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心1 min。取96孔黑色酶標板，每孔加入20 μL細胞裂解上清液，每個待測樣品做3孔重復。然后在避光環(huán)境下加入現配的hRluc1×Stop&GLO試劑（1∶50），每孔30 μL，搖勻，快速讀取hRluc的酶活數值,并利用軟件GraphPad Prism 5.0進行作圖分析。每個轉染組做3個重復。

1.2.7 統(tǒng)計分析 不同組之間的hRluc活性差異采用GraphPad Prism 5.0軟件進行Student’s-t檢驗。試驗結果以平均值±標準差表示，P<0.05 表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著；P>0.05表示差異不顯著。

2 結 果

2.1 慢病毒重組質粒構建

利用引物（T7 RNAP-F/R）從大腸桿菌BL21（DE3）基因組DNA中擴增T7RNAP基因，在2 700 bp處有明亮的條帶（圖1），同預期結果相同。重組質粒的PCR鑒定結果如圖2所示，挑取的3個單菌落均為陽性。選取2個陽性克隆菌液抽提質粒并測序，結果表明重組質粒pCDH-CMV-T7 RNAP構建成功。

M，Trans2K Plus DNA Marker；1，陰性對照；2，T7 RNAP PCR擴增結果M，Trans2K Plus DNA Marker;1，Negative control;2，The result for PCR amplification of T7 RNAP圖1 T7 RNAP基因擴增Fig.1 Amplification of T7 RNAP gene

M，Trans2K Plus DNA Marker；1，陽性對照；2，陰性對照；3～5，菌落PCR結果M:Trans2K Plus DNA Marker;1，Positive control;2，Negative control;3-5，Colony PCR results圖2 T7 RNAP重組質粒菌落PCR鑒定Fig.2 Identification of the recombinant plasmid T7 RNAP colony by PCR

2.2 HEK-293T細胞系轉染及慢病毒滴度鑒定

利用HEK-293T細胞對慢病毒進行包裝，48和72 h各收集一次病毒上清，測得混合重組慢病毒的滴度為1.0×108TU/mL。

2.3 穩(wěn)定表達T7 RNAP的BHK-21-T7 RNAP細胞株的篩選

測定結果表明，1周時間把所有BHK-21細胞全部殺死的最低嘌呤霉素濃度為4 μg/mL，即嘌呤霉素抗性篩選的最佳濃度為4 μg/mL。

將重組慢病毒分別以MOI為1、5、10和20感染BHK-21細胞，72 h后于熒光顯微鏡下觀察，結果表明，當MOI為1和5時，感染后細胞狀態(tài)較好，均觀察到明顯綠色熒光，且當MOI為5時熒光細胞數目更多（圖3），即為慢病毒的最佳感染復數。

A、C、E和G，重組慢病毒以MOI為1、5、10、20感染BHK-21細胞的熒光圖;B、D、F和H，重組慢病毒以MOI為1、5、10、20感染BHK-21細胞的白光圖A,C,E and G，BHK-21 cells were infected with recombinant lentiviral particles at MOI of 1,5,10,20 and visualized by fluorescence microscopy imaging,respectively；B,D,F and H,BHK-21 cells were infected with recombinant lentiviral particles at MOI of 1,5,10,20 and visualized by white light microscopy imaging,respectively圖3 慢病毒以不同感染復數對BHK-21細胞轉導效果的熒光顯微鏡觀察圖（200×）Fig.3 Fluorescence microscope observation of the transduction effect of lentivirus at different MOI on BHK-21 cells （200×）

將重組慢病毒以MOI為5對BHK-21細胞進行轉導，并以空載體重組慢病毒轉導BHK-21細胞作為對照，以含有4 μg/mL嘌呤霉素的篩選培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，2周后獲得穩(wěn)定遺傳的BHK-21-T7 RNAP細胞株與對照細胞株（圖4）。

A、B，BHK-21-T7 RNAP細胞株熒光圖和白光圖；C、D，對照細胞株熒光圖和白光圖A and B，Fluorescence diagram and white light diagram of BHK-21-T7 RNAP cell strain;C and D，Fluorescence diagram and white light diagram of control cell strain圖4 BHK-21-T7 RNAP細胞株與對照細胞株的熒光顯微鏡觀察圖（200×）Fig.4 Fluorescence microscope observation of the BHK-21-T7 RNAP cell strains and control cell strain （200×）

2.4 重組質粒pT7-hRluc構建及鑒定

利用特異性引物進行hRluc基因的PCR擴增，在1 000 bp附近有明亮的條帶（圖5），同預期大小相符。重組質粒pT7-hRluc鑒定中，從平板中挑取5個單菌落進行PCR鑒定，結果如圖6，挑取的5個單菌落均為陽性，且經測序比對分析顯示序列正確，證明pT7-hRluc檢測質粒構建成功。

M，Trans2K Plus DNA Marker；1、2，hRluc基因PCR擴增結果M，Trans2K Plus DNA Marker;1 and 2，The result for PCR amplification of hRluc gene圖5 hRluc基因PCR擴增結果Fig.5 PCR amplification results of hRluc gene

M，Trans2K Plus DNA Marker；1，陽性對照；2，陰性對照；3～7，重組質粒的菌落PCR檢測M，Trans2K Plus DNA Marker;1，Positive control;2，Negative control;3-7，Colony PCR detection of recombinant plasmid圖6 pT7-hRluc重組質粒菌落PCR鑒定Fig.6 PCR identification of the recombinant plasmid pT7-hRluc colony

2.5 BHK-21-T7 RNAP細胞株中T7 RNAP基因的穩(wěn)定性及活性鑒定

2.5.1 RT-PCR檢測 RT-PCR檢測結果如圖7所示，BHK-21-T7 RNAP細胞株中均能夠擴增到T7RNAP基因條帶，慢病毒空載體組和BHK-21空白細胞組均無擴增條帶，說明外源基因穩(wěn)定插入所構建的細胞株基因組中。

M，Trans DNA Marker Ⅰ；1、4、7，BHK-21-T7 RNAP細胞組；2、5、8，慢病毒空載體組；3、6、9，BHK-21空白細胞組M，Trans DNA Marker Ⅰ;1,4 and 7,BHK-21-T7 RNAP cell group;2,5 and 8:Lentivirus vector control group;3,6 and 9:BHK-21 blank cell group圖7 BHK-21-T7 RNAP細胞株中T7 RNAP基因的RT-PCR檢測Fig.7 RT-PCR detection of T7 RNAP gene in BHK-21-T7 RNAP cell strain

2.5.2 hRluc活性檢測 利用pT7-hRluc檢測質粒轉染篩選的穩(wěn)定細胞株，對hRluc活性進行檢測，結果顯示，BHK-21-T7 RNAP細胞株中hRluc活性與空白對照組BHK-21細胞相比極顯著升高（P<0.01）（圖8）。

**，差異極顯著（P<0.01）**，Extremely significant difference （P<0.01）圖8 hRluc活性檢測結果Fig.8 The activity of hRluc

3 討 論

慢病毒載體系統(tǒng)是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒（HIV-1）為基礎發(fā)展起來的基因工程載體，此系統(tǒng)由載體、輔助載體和包裝細胞株組成[22-23]。相比于其他載體系統(tǒng)，它適用于更多種類的宿主細胞，并且慢病毒載體對于分裂細胞和非分裂細胞都具有感染力，整合能力強，能使宿主染色體有效整合外源基因，實現外源基因的長期高效表達。此外，慢病毒系統(tǒng)容量大，經過改造的慢病毒載體可以接納10 kb大小的外源基因[24-25]。利用慢病毒載體系統(tǒng)建立穩(wěn)定的轉基因細胞株，能夠在基因功能、疫苗和生物制品開發(fā)等生物研究中發(fā)揮重要作用。

T7 RNAP具有高度啟動子專一性，高特異性識別T7啟動子和終止子序列，其能夠在不借助其他輔助因子的情況下，介導T7啟動子下游的外源基因的高效表達，被廣泛應用于RNA病毒的反向遺傳學系統(tǒng)中。目前已有國內外學者建立了表達T7 RNAP的細胞株。van Gennip等[26]建立了表達T7 RNAP的豬腎細胞株SK6/T7，該細胞株可以提高豬瘟病毒反向遺傳操作的效率。鄭海學等[27]通過逆轉錄病毒基因轉導和假病毒包裝的技術建立了穩(wěn)定表達T7 RANP的細胞株IBRS/T7，并利用該細胞株拯救出豬水皰病病毒。吳錦艷等[3]利用逆轉錄病毒載體系統(tǒng)將T7RNAP基因整合進豬源細胞，獲得穩(wěn)定表達T7 RANP的PK15和SK6細胞株。BHK-21細胞系對于多種病毒敏感，可以用于多種病毒的增殖和純化，本研究利用慢病毒載體系統(tǒng)篩選出穩(wěn)定表達T7 RNAP的BHK-21-T7RNAP細胞株，能夠為多種RNA病毒反向遺傳學平臺的建立提供細胞基礎。

本研究一方面將目的基因T7RNAP導入慢病毒質粒獲得重組慢病毒質粒，利用包裝系統(tǒng)轉染HEK-293T細胞后，重組慢病毒的滴度高達1.0×108TU/mL。進一步試驗發(fā)現，在MOI為5的條件下，重組慢病毒感染BHK-21細胞的熒光細胞量較高，且細胞整體狀態(tài)較好。隨后，摸索了嘌呤霉素的在BHK-21細胞中的使用濃度，發(fā)現使用濃度為4 μg/mL嘌呤霉素能夠有效進行抗性篩選，所篩選的細胞均含有嘌呤霉素抗性基因，說明慢病毒系統(tǒng)中的抗性基因穩(wěn)定插到細胞基因組中。經RT-PCR及測序鑒定證明,序列與所克隆的T7 RNAP序列一致。同時此細胞株轉染含有T7-啟動子驅動的hRluc的報告載體后，通過檢測hRluc報告基因的活性來反映hRluc的轉錄水平，以判斷穩(wěn)定篩選的BHK-21-T7 RNAP細胞株中的T7 RNAP是否有活性。結果顯示，hRluc的活力與對照組相比極顯著升高，證明所篩選的BHK-21-T7 RNAP細胞株能夠表達有活性的T7 RNAP，具有驅動T7啟動子下游基因轉錄的作用。該細胞系的成功建立使得在DNA水平上研究和利用RNA病毒基因的突變、缺失、插入和替換成為可能，為RNA病毒反向遺傳學操作平臺提供了研究基礎。

4 結 論

本研究將目的基因T7RNAP基因導入慢病毒質粒獲得重組慢病毒質粒系統(tǒng)，轉染HEK-293T細胞后得到重組慢病毒，進一步感染BHK-21細胞，通過嘌呤霉素篩選得到表達T7 RNAP的細胞系，再經過RT-PCR檢測和hRluc酶活的檢測驗證獲得了穩(wěn)定表達T7 RNAP的細胞株。