張燕偉，蔡春波，孫 迪，安家岐，黃曉宇，牛 瑾，崔子旭，高鵬飛，郭曉紅，李步高，曹果清

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，太谷 030801）

骨骼肌是哺乳動物機體的重要組成部分，參與動物生理及代謝活動，約占機體總干重的45%[1]。骨骼肌的基本組成單位是肌纖維，多根肌纖維聚合形成由肌膜包裹的肌纖維束，多條肌纖維束構(gòu)成骨骼肌[2]。骨骼肌肌纖維的直徑、密度和橫截面積與肌肉嫩度具有顯著的相關(guān)性，可影響肉品質(zhì)。骨骼肌肌纖維直徑和橫截面積越小，密度越大，肌肉的嫩度越好，肉質(zhì)品質(zhì)更高[3-4]。根據(jù)收縮速度與能量代謝的差異，骨骼肌肌纖維可以分為4種類型：慢速收縮氧化型（Ⅰ型）、快速收縮氧化型（Ⅱa型）、快速收縮酵解型（Ⅱb型）和中間型（Ⅱx型）[5-6]，對應(yīng)的標(biāo)記基因分別為肌球蛋白重鏈7（myosin heavy chain 7，MYH7）、MYH2、MYH4和MYH1[7]，4種類型肌纖維的形態(tài)和能量代謝方式具有較大的差異。Ⅰ型肌纖維直徑和橫截面積小，糖酵解代謝活性低，氧化磷酸化代謝活性高；Ⅱa型肌纖維直徑和橫截面積較小，糖酵解代謝活性較低，氧化磷酸化代謝活性較高；Ⅱb型肌纖維直徑和橫截面積大，糖酵解代謝活性高，氧化磷酸化代謝活性低；Ⅱx型肌纖維屬于Ⅱa型和Ⅱb型肌纖維的過渡形態(tài)，糖酵解和氧化磷酸化活性處于兩者之間[8-9]。

影響哺乳動物骨骼肌肌纖維組成的因素很多，包括年齡、品種、肌肉部位、飼養(yǎng)水平及飼養(yǎng)環(huán)境等[10]。豬骨骼肌肌纖維數(shù)目在胚胎期90 d已經(jīng)確定，出生后數(shù)量不會改變，但是會增粗和變長[11]。仔豬骨骼肌中主要以氧化型肌纖維為主，隨著年齡增長，氧化型肌纖維向酵解型肌纖維轉(zhuǎn)化[12]。與國外豬種相比，中國地方豬骨骼肌中Ⅰ型肌纖維較多，Ⅱb型肌纖維較少[13]。豬不同部位骨骼肌的運動強度不同，肌纖維的組成也具有較大差異。豬背最長肌可以使脊柱保持直立，運動強度較?。欢洪L伸肌位于小腿前側(cè)，參與豬后腿直立和行走等功能，運動強度較大。楊秋梅[14]報道，6月齡大白豬背最長肌中慢肌含量為13.5%，快肌為86.5%；趾長伸肌中慢肌含量為8%，快肌為92%，運動強度較高的趾長伸肌的快肌含量高于背最長肌。

馬身豬是山西省地方豬種，具有肌內(nèi)脂肪含量高、肉質(zhì)品質(zhì)好、耐粗飼、抗逆性強等優(yōu)良的種質(zhì)特性，但其生長速度慢、飼料報酬低、瘦肉率低、皮下脂肪含量高，嚴(yán)重限制其商業(yè)化推廣與應(yīng)用[15-16]。晉汾白豬是以馬身豬、二花臉、大白豬和長白豬為親本，經(jīng)雜交選育而成的新品種，通過國家畜禽遺傳資源委員會審定，融合了中國地方豬種和國外商品豬種的優(yōu)良特性，具有生長速度快、瘦肉率高和肉質(zhì)品質(zhì)好的優(yōu)點，是一個優(yōu)良的華系培育品種[17]。本研究以馬身豬、晉汾白豬和杜長大豬為研究對象，采集背最長肌與趾長伸肌，分別檢測4種肌纖維類型的標(biāo)記基因（MYH7、MYH2、MYH4、MYH1）、線粒體活性相關(guān)基因（ATP5A1、PGC1-α、PPARβ）、電子傳遞鏈相關(guān)基因（UQCRC2、SDHA、NDUFA9）及糖酵解相關(guān)基因（LDHA、LDHB、GK）的表達量，探究3個豬種骨骼肌差異性的分子機制，以期為豬肉品質(zhì)的研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 選取28 d斷奶杜長大豬（簡稱DLY）、晉汾白豬（簡稱JFW）、馬身豬（簡稱MS）去勢公豬各4頭，相同條件下飼養(yǎng)，自由采食。6月齡時屠宰，采集背最長?。ê喎QLD）和趾長伸?。ê喎QEDL），一部分修成1 cm×1 cm×0.5 cm的組織塊，置于4%多聚甲醛固定液中，用于后續(xù)制作石蠟組織切片；另一部分組織-80 ℃保存，用于提取總RNA。

1.1.2 主要試劑及儀器 4%多聚甲醛、二甲苯、石蠟、中性樹膠、HE染色試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit、SYBR Premix ExTaqTMⅡ均購自TaKaRa公司；RNA提取試劑盒購自Promega公司。

M60切片機、HI1220烘片機、HI1210攤片機、EG1150H智能生物包埋機（Leica Biosystems公司）；CFX Connect熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司）；Centrifuge 5415R高速冷凍離心機（Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 制作石蠟切片 骨骼肌樣品經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h后流水沖洗過夜；使用70%乙醇2 h、80%乙醇2 h、90%乙醇2 h、100%乙醇1 h梯度脫水，脫水完成后，使用二甲苯對蠟塊進行透明處理1 h；將組織塊浸入60 ℃蠟罐中3 h，浸蠟完成后進行包埋；借助專用切片機將其制成5 μm厚度的切片，置于載玻片上47 ℃攤片，貼片后45 ℃烤箱烘片7 h，備用。

1.2.2 HE染色 將烘干的切片置于二甲苯中脫蠟，并在梯度酒精中進行逐級復(fù)水處理；使用蘇木精染液對細胞核著色2.5 min，蒸餾水洗1 min返藍后，將切片放入1%鹽酸酒精溶液中分化10 s，水洗2 min；用伊紅染液對細胞質(zhì)著色2.5 min，蒸餾水洗1 min；著色結(jié)束后使用梯度酒精逐級脫水，二甲苯透明，用中性樹膠封片。每張切片隨機選擇10個視野拍攝取圖，保證每個視野內(nèi)至少包含100根肌纖維。用Image-Pro Plus 6.0軟件進行肌纖維直徑、密度、橫截面積的測量。

1.2.3 RNA提取和cDNA合成 使用RNA提取試劑盒提取組織RNA。加入適量無菌水溶解RNA，用核酸蛋白檢測儀測定RNA濃度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA合成：去除基因組DNA，分別加入gDNA Eraser 1 μL，5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，總RNA 500 ng，加RNase-free ddH2O補齊至10 μL，混勻后42 ℃ 2 min；加PrimeScriptTMRT Enzyme Mix 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，RNase-free ddH2O 4 μL，5×PrimerScrept Buffer 2 4 μL，總體系20 μL，混勻后37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s，4 ℃保存。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測 采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物，以18S rRNA作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系20 μL：SYBR Premix ExTaqTMⅡ 10 μL，上、下游引物各0.6 μL，cDNA 1.5 μL，加無菌水補足體系。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，退火（退火溫度見表1） 20 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt計算基因的相對表達量。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.2.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 21.0軟件的單因素方差分析和獨立樣本t檢驗分析差異顯著性。數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 肌纖維形態(tài)分析

經(jīng)過HE染色后，3個豬種的背最長肌和趾長伸肌肌纖維的細胞質(zhì)顯示為紅色，邊界清晰；細胞核顯示為藍色，分布在細胞邊緣（圖1）。

由圖2可知，馬身豬背最長肌肌纖維直徑和橫截面積均顯著低于晉汾白豬和杜長大豬（P<0.05），而肌纖維密度顯著高于晉汾白豬和杜長大豬（P<0.05），晉汾白豬和杜長大豬背最長肌肌纖維直徑、密度和橫截面積均無顯著差異（P>0.05）；馬身豬和晉汾白豬趾長伸肌肌纖維直徑和橫截面積均顯著低于杜長大豬（P<0.05），而肌纖維密度顯著高于杜長大豬（P<0.05），馬身豬和晉汾白豬趾長伸肌肌纖維直徑、密度和橫截面積均無顯著差異（P>0.05）。

肩標(biāo)不同字母表示差異顯著（P<0.05）；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著（P>0.05）Value with different letter superscripts mean significant difference （P<0.05）；While with the same or no letter superscripts mean no significant difference （P>0.05）圖2 馬身豬、晉汾白豬、杜長大豬背最長肌與趾長伸肌肌纖維直徑（A）、密度（B）與橫截面積（C）Fig.2 Diameter （A）,density （B） and cross-sectional area （C） of myofibers of longissimus dorsi muscle and extensor digitorum longus muscle in MS,JFW and DLY pigs

2.2 4種類型肌纖維標(biāo)記基因的表達量分析

由表2可知，馬身豬背最長肌中Ⅰ型肌纖維標(biāo)記基因MYH7的表達量顯著高于晉汾白豬和杜長大豬，晉汾白豬背最長肌中MYH7基因的表達量顯著低于杜長大豬（P<0.05）；馬身豬背最長肌中Ⅱb型和Ⅱx型肌纖維的標(biāo)記基因MYH4和MYH1的表達量均顯著低于晉汾白豬和杜長大豬，而Ⅱa型肌纖維的標(biāo)記基因MYH2的表達量顯著高于晉汾白豬和杜長大豬（P<0.05）。馬身豬和晉汾白豬趾長伸肌中MYH7基因的表達量顯著高于杜長大豬，而MYH4和MYH1基因的表達量均顯著低于杜長大豬（P<0.05）；馬身豬趾長伸肌中MYH2基因的表達量顯著高于晉汾白豬和杜長大豬，晉汾白豬趾長伸肌中MYH2基因的表達量顯著高于杜長大豬（P<0.05）。兩種肌肉相比，背最長肌中MYH2和MYH7基因的表達量顯著或極顯著高于趾長伸肌，而MYH1和MYH4基因的表達量顯著或極顯著低于趾長伸肌（P<0.05；P<0.01）。

2.3 線粒體相關(guān)基因的表達量分析

由表3可知，馬身豬背最長肌中ATP5A1、PGC1-α和PPARβ基因的表達量均顯著低于杜長大豬，晉汾白豬背最長肌中PGC1-α和PPARβ基因的表達量均顯著低于杜長大豬（P<0.05）；馬身豬和晉汾白豬趾長伸肌中ATP5A1、PGC1-α和PPARβ基因的表達量均顯著低于杜長大豬（P<0.05）。馬身豬背最長肌中PGC1-α和PPARβ基因的表達量均顯著低于趾長伸?。≒<0.05），ATP5A1基因的表達量在兩種肌肉中無顯著差異（P>0.05）；晉汾白豬背最長肌中ATP5A1和PGC1-α基因的表達量均顯著低于趾長伸?。≒<0.01），PPARβ基因的表達量在兩種肌肉中無顯著差異（P>0.05）；杜長大豬背最長肌中ATP5A1、PGC1-α和PPARβ基因的表達量均極顯著低于趾長伸?。≒<0.01）。

2.4 電子傳遞鏈相關(guān)基因的表達量分析

由表4可知，晉汾白豬背最長肌中UQCRC2、SDHA和NDUFA9基因的表達量均顯著低于杜長大豬和馬身豬，馬身豬中NDUFA9基因的表達量顯著低于杜長大豬（P<0.05）；杜長大豬趾長伸肌中UQCRC2、SDHA和NDUFA9基因的表達量均顯著高于晉汾白豬和馬身豬（P<0.05），晉汾白豬中UQCRC2和SDHA基因的表達量均顯著高于馬身豬（P<0.05）。比較電子傳遞鏈相關(guān)基因在背最長肌和趾長伸肌中的表達量發(fā)現(xiàn)，除杜長大豬背最長肌和趾長伸肌中NDUFA9基因的表達量無顯著差異外（P>0.05），其余均有顯著或極顯著差異（P<0.05；P<0.01），且在背最長肌中的表達量高于趾長伸肌。

2.5 糖酵解相關(guān)基因的表達量分析

由表5可知，馬身豬和晉汾白豬背最長肌中LDHA、LDHB和GK基因的表達量均顯著低于杜長大豬，晉汾白豬背最長肌中LDHA基因的表達量顯著高于馬身豬（P<0.05）；馬身豬和晉汾白豬趾長伸肌中LDHA、LDHB和GK基因的表達量均顯著低于杜長大豬，晉汾白豬趾長伸肌中LDHA基因的表達量顯著高于馬身豬（P<0.05）。3個品種趾長伸肌中LDHA、LDHB和GK基因的表達量均顯著高于背最長?。≒<0.05）。

3 討 論

剪切力與肉品質(zhì)具有顯著的相關(guān)性，也與骨骼肌肌纖維直徑、密度和橫截面積存在顯著的相關(guān)性。肌纖維直徑越小，密度越大；肌肉剪切力越小，肉品質(zhì)也更好[3]。諶啟亮等[18]測定了18、36、54、72月齡西門塔爾雜交公牛背最長肌肌纖維直徑與剪切力并進行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)剪切力與肌纖維直徑的相關(guān)系數(shù)為0.833。陳璐等[19]測定了6個雜交組合的背最長肌肌纖維直徑、密度和剪切力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)背最長肌肌纖維直徑與密度之間呈顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.83，直徑與剪切力呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.966。本研究發(fā)現(xiàn)，馬身豬背最長肌和趾長伸肌肌纖維直徑和橫截面積均顯著低于杜長大豬，說明馬身豬骨骼肌的剪切力小于杜長大豬；培育品種晉汾白豬背最長肌肌纖維直徑和橫截面積與杜長大豬沒有明顯差異，而趾長伸肌肌纖維直徑和橫截面積均小于杜長大豬，說明晉汾白豬和杜長大豬不同部位骨骼肌剪切力的變化趨勢并不一致。

不同豬種骨骼肌中4種類型肌纖維的含量及其標(biāo)記基因的表達量都具有較大的差異。與國外豬種相比，中國地方豬的骨骼肌中氧化型肌纖維含量較多，酵解型肌纖維較少[20]。劉凡等[21]研究發(fā)現(xiàn)，12月齡林芝藏豬背最長肌中Ⅱa型肌纖維標(biāo)記基因的表達量顯著高于大白豬，而Ⅱb型肌纖維標(biāo)記基因的表達量顯著低于大白豬。Guo等[22]研究發(fā)現(xiàn)，6月齡馬身豬背最長肌中Ⅰ和Ⅱa型肌纖維標(biāo)記基因的表達量顯著高于大白豬，而Ⅱb和Ⅱx型肌纖維標(biāo)記基因的表達量顯著低于大白豬。Hu等[23]研究發(fā)現(xiàn)，萊蕪豬背最長?、騜型肌纖維標(biāo)記基因的表達量顯著低于杜洛克豬，而Ⅱa型肌纖維標(biāo)記基因的表達量顯著高于杜洛克豬。對于動物個體而言，不同部位骨骼肌的肌纖維組成也不同。 楊秋梅[14]通過組織切片和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸四唑氧化還原酶染色法發(fā)現(xiàn)，6月齡杜長大豬的背最長肌、半膜肌與半腱肌中Ⅰ型肌纖維的比例分別為10.00%、31.22%和45.44%，Ⅱa型為7.90%、15.56%和15.49%，Ⅱb型為82.03%、53.22%和39.01%，其中背最長肌中Ⅱb型肌纖維的含量顯著高于半腱肌，Ⅰ、Ⅱa型肌纖維的含量均顯著低于半腱肌。本研究中，馬身豬背最長肌和趾長伸肌中Ⅰ與Ⅱa肌纖維標(biāo)記基因的表達量顯著高于杜長大豬，Ⅱb型肌纖維標(biāo)記基因的表達量顯著低于杜長大豬；培育品種晉汾白豬的背最長肌Ⅰ型肌纖維標(biāo)記基因的表達量低于杜長大豬，Ⅱb型肌纖維標(biāo)記基因的表達量沒有明顯差異；而趾長伸?、裥图±w維標(biāo)記基因的表達量顯著高于杜長大豬，Ⅱb型肌纖維標(biāo)記基因的表達量顯著低于杜長大豬，兩個部位骨骼肌的Ⅰ和Ⅱb型肌纖維標(biāo)記基因的表達量并不一致，背最長肌氧化型肌纖維標(biāo)記基因的表達量顯著高于趾長伸肌，而酵解型標(biāo)志基因的表達量較低。

骨骼肌運動所需ATP的生成方式有2種：糖酵解和氧化磷酸化。葡萄糖通過糖酵解代謝分解為丙酮酸，同時產(chǎn)生少量的ATP。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）可以催化丙酮酸生成乳酸，其含有2個亞基：LDHA和LDHB。丙酮酸也可以生成乙酰輔酶A，通過三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化產(chǎn)生大量的ATP。氧化磷酸化發(fā)生在線粒體中，主要包括呼吸電子傳遞鏈過程中形成的質(zhì)子電化學(xué)梯度和質(zhì)子電化學(xué)梯度驅(qū)動ATP合酶合成的ATP。不同豬種骨骼肌中糖酵解和氧化磷酸化的活性存在較大差異。Chen等[24]研究發(fā)現(xiàn)，巴馬豬背最長肌中LDH活性顯著低于大白豬，而琥珀酸脫氫酶（SDH）與蘋果酸脫氫酶（MDH）活性均顯著高于大白豬。Lefaucheur等[25]研究發(fā)現(xiàn)，巴斯克豬半膜肌中LDH活性顯著低于大白豬，而檸檬酸合酶（CS）和β-羥基?；o酶A脫氫酶（HAD）活性均顯著高于大白豬。本研究中，馬身豬和晉汾白豬骨骼肌中LDHA和LDHB基因的表達量均顯著低于杜長大豬，而ATP5A1和SDHA基因的表達量均低于杜長大豬。本研究結(jié)果與前人報道并不一致，可能原因是豬ATP5A1和SDH通過改變蛋白的含量和空間構(gòu)象來調(diào)控其生物學(xué)活性，mRNA的表達量并不能真實反映ATP5A1和SDH酶的活性。Huber等[26]研究發(fā)現(xiàn)，豬背最長肌中LDH的活性顯著高于膈肌，而異檸檬酸脫氫酶（ICDH）活性顯著低于膈肌。本研究發(fā)現(xiàn)，趾長伸肌中LDHA、LDHB和ATP5A1基因的表達量均高于背最長肌，SDHA基因的表達量低于背最長肌。說明不同部位骨骼肌的糖酵解和氧化磷酸化活性也存在較大差異。

4 結(jié) 論

3個豬種相比，馬身豬骨骼肌肌纖維直徑和橫截面積較小，Ⅰ和Ⅱa型肌纖維標(biāo)記基因的表達量高；杜長大豬骨骼?、騜型肌纖維標(biāo)記基因的表達量高，氧化磷酸化和糖酵解相關(guān)基因的表達量均較高。